第三章基因突變的應(yīng)用

1、1www.theme 第三章 基因突變的應(yīng)用基因突變的應(yīng)用2www.theme 笫一節(jié)笫一節(jié) 誘變育種誘變育種 一、一、概述概述1.1.相相關(guān)概關(guān)概念念2.2.產(chǎn)產(chǎn)生生與發(fā)與發(fā)展展3.3.誘變誘變育育種種的作用的作用 提高提高產(chǎn)產(chǎn)量量 改善菌改善菌種種特性特性 開發(fā)開發(fā)新新產(chǎn)產(chǎn)品品 提供育提供育種種手段手段4.4.高高產(chǎn)產(chǎn)菌株菌株誘變誘變育育種種的特點的特點二、二、誘變育種方案的設(shè)計誘變育種方案的設(shè)計1.1.制定明確的制定明確的選選育目育目標(biāo)標(biāo)2.2.建立可行的建立可行的篩選篩選方法方法3.3.確定確定誘變篩選誘變篩選流程流程三、三、誘變育種的一般流程誘變育種的一般流程出發(fā)菌出發(fā)菌純化、活化、

2、同步培養(yǎng)純化、活化、同步培養(yǎng)培養(yǎng)液培養(yǎng)液 離心收集細胞、洗滌，制備均一的菌懸液（玻璃離心收集細胞、洗滌，制備均一的菌懸液（玻璃株打散、過濾）株打散、過濾）單細胞或單孢子懸液單細胞或單孢子懸液活菌計數(shù)，誘變預(yù)備試驗活菌計數(shù)，誘變預(yù)備試驗誘變處理誘變處理活細胞計數(shù)，致死率計算活細胞計數(shù)，致死率計算中間培養(yǎng)中間培養(yǎng)( (后培養(yǎng)后培養(yǎng)) )平板分離平板分離變異率計算變異率計算初篩初篩復(fù)篩復(fù)篩 保藏及擴大試驗保藏及擴大試驗四、四、誘變育種需要注意的一些問題誘變育種需要注意的一些問題1.1.安全安全問題問題2.2.養(yǎng)養(yǎng)成良好的工作成良好的工作習(xí)慣習(xí)慣3.3.誘變誘變育育種種和其他育和其他育種種手段相手段相

3、結(jié)結(jié)合合 4.4.工作的合理工作的合理設(shè)計設(shè)計代謝調(diào)控育種代謝調(diào)控育種代謝調(diào)控育種的措施和原理代謝調(diào)控育種的措施和原理v 營養(yǎng)缺陷型突變，營養(yǎng)缺陷型突變，條件條件解除反饋調(diào)節(jié)解除反饋調(diào)節(jié)v 滲漏營養(yǎng)缺陷型，解除反饋調(diào)節(jié)滲漏營養(yǎng)缺陷型，解除反饋調(diào)節(jié)v 結(jié)構(gòu)類似物抗性突變，解除反饋調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)類似物抗性突變，解除反饋調(diào)節(jié)v 營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變，解除反饋調(diào)節(jié)營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變，解除反饋調(diào)節(jié)8www.theme 笫二節(jié)笫二節(jié) 營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選與應(yīng)用營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選與應(yīng)用 一、營養(yǎng)缺陷型菌株的概念一、營養(yǎng)缺陷型菌株的概念二、培養(yǎng)基的類型二、培養(yǎng)基的類型 三、營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選三、營養(yǎng)缺陷型菌株的篩

4、選 四、營養(yǎng)缺陷型菌株的應(yīng)用四、營養(yǎng)缺陷型菌株的應(yīng)用一、營養(yǎng)缺陷型菌株的概念一、營養(yǎng)缺陷型菌株的概念v在誘變育種工作中，營養(yǎng)缺陷型突變體的篩選及應(yīng)用有著十分重要的意義。v營養(yǎng)缺陷型菌株是指通過誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營養(yǎng)物質(zhì)(如氨基酸、維生素、嘌呤和嘧啶堿基等)的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)缺陷的營養(yǎng)物質(zhì)才能正常生長繁殖的變異菌株。二、培養(yǎng)基的類型二、培養(yǎng)基的類型按其營養(yǎng)成分分類按其營養(yǎng)成分分類v基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基v完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基v補充培養(yǎng)基補充培養(yǎng)基三種培養(yǎng)基的定義三種培養(yǎng)基的定義v凡是能凡是能滿滿足野生菌株正常生足野生菌株正常生長長的最低成分的合成的最低成分的合成培培養(yǎng)養(yǎng)基，

5、基，稱為稱為基本培基本培養(yǎng)養(yǎng)(MM)。在。在這這里我里我們稱們稱其其變異變異前的菌株前的菌株稱為稱為野生菌株。野生菌株。v在基本培在基本培養(yǎng)養(yǎng)基中加入一些富含基中加入一些富含氨氨基酸、基酸、維維生素及生素及含含氮堿氮堿基之基之類類的天然有機物的天然有機物質(zhì)質(zhì)，如蛋白，如蛋白質(zhì)質(zhì)、酵母、酵母膏等，能膏等，能滿滿足各足各種營養(yǎng)種營養(yǎng)缺陷型菌株生缺陷型菌株生長長繁殖的培繁殖的培養(yǎng)養(yǎng)基，基，稱為稱為完全培完全培養(yǎng)養(yǎng)基基(CM) 。三種培養(yǎng)基的定義三種培養(yǎng)基的定義v在基本培在基本培養(yǎng)養(yǎng)基中只是有基中只是有針對針對性的加入某一性的加入某一種種或某或某幾幾種種自身不能合成的有機自身不能合成的有機營養(yǎng)營養(yǎng)成分

6、，以成分，以滿滿足相足相應(yīng)應(yīng)的的營養(yǎng)營養(yǎng)缺陷型菌株生缺陷型菌株生長長的培的培養(yǎng)養(yǎng)基，基，稱為稱為補補充培充培養(yǎng)養(yǎng)基基(SM)。三、營養(yǎng)缺陷型菌株篩選的一般方法三、營養(yǎng)缺陷型菌株篩選的一般方法1、誘變處理誘變處理 一般選擇較高致死劑量一般選擇較高致死劑量2 2、后培養(yǎng)（中間培養(yǎng)）、后培養(yǎng)（中間培養(yǎng)） 在在CMCM中進行，中進行，消除消除突變細胞的突變細胞的表型延遲表型延遲（生理（生理性延遲和分離延遲性延遲和分離延遲3 3、淘汰野生型、淘汰野生型（濃縮作用）（濃縮作用） 降低野生型細胞的數(shù)量和比例，使?fàn)I養(yǎng)缺陷型降低野生型細胞的數(shù)量和比例，使?fàn)I養(yǎng)缺陷型細胞得以相對濃縮細胞得以相對濃縮4 4、檢出營養(yǎng)

7、缺陷型、檢出營養(yǎng)缺陷型5 5、鑒定營養(yǎng)缺陷型、鑒定營養(yǎng)缺陷型淘汰野生型淘汰野生型 原理原理：限制營養(yǎng)成分使缺陷型細胞生長受抑制，限制營養(yǎng)成分使缺陷型細胞生長受抑制，野生型細胞在生長過程中被殺死或生長后被除去野生型細胞在生長過程中被殺死或生長后被除去 方法：方法：v 抗生素法抗生素法：v 菌絲過濾法菌絲過濾法：v 差別殺菌：差別殺菌：v 饑餓處理法：（饑餓處理法：（在某些條件下濃縮雙缺突變株）在某些條件下濃縮雙缺突變株） 問題：問題：高絲氨酸脫氫酶高絲氨酸脫氫酶(AK) 高絲氨酸營養(yǎng)缺高絲氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株陷型突變株( (HserHser- -) )條件解除條件解除（Thr+Lys)對對AK的

8、協(xié)同反饋抑的協(xié)同反饋抑制制高絲氨酸滲漏缺陷高絲氨酸滲漏缺陷型突變株型突變株(Hser(Hserl l ) )解解除反饋抑制除反饋抑制營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選過程營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選過程v營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選一般要經(jīng)過誘變、淘汰野營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選一般要經(jīng)過誘變、淘汰野生型菌株、檢出缺陷型和確定生長譜四個環(huán)節(jié)。生型菌株、檢出缺陷型和確定生長譜四個環(huán)節(jié)。v誘變劑處理誘變劑處理v誘變劑處理時與其它誘變處理基本相同。在誘變誘變劑處理時與其它誘變處理基本相同。在誘變處理后的存活個體中，營養(yǎng)缺陷型的比例一般很處理后的存活個體中，營養(yǎng)缺陷型的比例一般很低，通常只有百分之幾至千分之幾，采用抗菌素低，通常只有百分

9、之幾至千分之幾，采用抗菌素法或菌絲過濾法，可以淘汰為數(shù)眾多的野生型菌法或菌絲過濾法，可以淘汰為數(shù)眾多的野生型菌株，從而達到濃縮營養(yǎng)缺陷型的目的。株，從而達到濃縮營養(yǎng)缺陷型的目的。淘汰野生菌的方法淘汰野生菌的方法v抗生素法是利用野生型菌株能在抗生素法是利用野生型菌株能在MMMM中生長，中生長，而缺陷型不能生長，于是將誘變處理液在而缺陷型不能生長，于是將誘變處理液在MMMM中培中培養(yǎng)短時讓野生型生長，處于活化階段，而缺陷型養(yǎng)短時讓野生型生長，處于活化階段，而缺陷型無法生長，仍處于無法生長，仍處于“休眠狀態(tài)休眠狀態(tài)”，這時，加入一，這時，加入一定量的抗生素，結(jié)果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，定量的抗生素

10、，結(jié)果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，保存了缺陷型。保存了缺陷型。在選擇抗生素時，細菌可以用青在選擇抗生素時，細菌可以用青霉素，酵母可用制霉菌素。霉素，酵母可用制霉菌素。淘汰野生菌的方法淘汰野生菌的方法v菌菌絲過濾絲過濾法只適用于法只適用于絲狀真絲狀真菌，其原理是菌，其原理是在基本培在基本培養(yǎng)養(yǎng)基中，野生型的基中，野生型的孢孢子能子能發(fā)發(fā)芽成菌芽成菌絲絲，而而營養(yǎng)營養(yǎng)缺陷型缺陷型則則不能。因此不能。因此將誘變處將誘變處理后的理后的孢孢子子在基本培在基本培養(yǎng)養(yǎng)基中培基中培養(yǎng)養(yǎng)一段一段時間時間后，再后，再進進行行過濾過濾。v如此重如此重復(fù)數(shù)復(fù)數(shù)次后，就可以除去大部分野生型菌株，次后，就可以除去大部分野生

11、型菌株，同同樣達樣達到到“ “濃縮濃縮” ”營養(yǎng)營養(yǎng)缺陷型的目的。缺陷型的目的。 營養(yǎng)缺陷型的檢出方法營養(yǎng)缺陷型的檢出方法v具體方法：影印法、點種法、夾層法 、限量補充培養(yǎng)法 ）影印法）影印法v影印法是影印法是將誘變處將誘變處理后的理后的細細胞涂布在完全培胞涂布在完全培養(yǎng)養(yǎng)基基表面上，表面上，經(jīng)經(jīng)培培養(yǎng)養(yǎng)后后長長出菌落，然后用一小出菌落，然后用一小塊塊直直徑徑比平皿稍小的比平皿稍小的圓圓柱形木柱形木塊復(fù)塊復(fù)蓋于蓋于滅過滅過菌的菌的絲絨絲絨布布上作上作為為接接種種工具，工具，將長將長出菌落的平皿倒出菌落的平皿倒轉(zhuǎn)過來轉(zhuǎn)過來，在在絲絨絲絨上上輕輕輕輕按一下，按一下，轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)接到另一基本培接到另一基本培

12、養(yǎng)養(yǎng)基平基平板上，板上，經(jīng)經(jīng)培培養(yǎng)養(yǎng)后，比后，比較這兩個較這兩個平皿平皿長長出的菌落。出的菌落。如果如果發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)前一平扳上某一部位前一平扳上某一部位長長有菌落，而在后有菌落，而在后一培一培養(yǎng)養(yǎng)基上的相基上的相應(yīng)應(yīng)部位卻部位卻沒沒有，就有，就說說明明這這是一是一個個營養(yǎng)營養(yǎng)缺陷型菌落。缺陷型菌落。）影印法）影印法）夾層夾層培培養(yǎng)養(yǎng)法法v夾層夾層培培養(yǎng)養(yǎng)法是先在培法是先在培養(yǎng)養(yǎng)皿上倒一皿上倒一層層基本培基本培養(yǎng)養(yǎng)基，基，冷凝后加上一冷凝后加上一層層含菌液的基本培含菌液的基本培養(yǎng)養(yǎng)基，凝固后再基，凝固后再澆澆上一薄上一薄層層的基本培的基本培養(yǎng)養(yǎng)基?；＝?jīng)經(jīng)培培養(yǎng)養(yǎng)后，在皿底后，在皿底對對首先出首先出

13、現(xiàn)現(xiàn)的菌落做的菌落做標(biāo)記標(biāo)記，然后再倒上一薄，然后再倒上一薄層層完全完全培培養(yǎng)養(yǎng)基基(或或補補充培充培養(yǎng)養(yǎng)基基)，再培，再培養(yǎng)養(yǎng)，這時這時再出再出現(xiàn)現(xiàn)的的新菌落，多新菌落，多數(shù)數(shù)即即為營養(yǎng)為營養(yǎng)缺陷型。此法缺點是，缺陷型。此法缺點是，結(jié)結(jié)果有果有時時不明確，而且不明確，而且將將缺陷型菌落缺陷型菌落從夾層從夾層中挑出中挑出并并不很容易不很容易。）夾層夾層培培養(yǎng)養(yǎng)法法）逐）逐個檢個檢出法出法v逐逐個檢個檢出法是出法是將經(jīng)過誘變處將經(jīng)過誘變處理的理的細細胞涂布在完全胞涂布在完全培培養(yǎng)養(yǎng)基平板上，待基平板上，待長長出出單個單個菌落后，用接菌落后，用接種針種針或或牙牙簽將這簽將這些些單個單個菌落逐菌落逐

14、個個依次地分依次地分別別接接種種到基本到基本培培養(yǎng)養(yǎng)基和另一完全培基和另一完全培養(yǎng)養(yǎng)基平板上?；桨迳稀＝?jīng)經(jīng)培培養(yǎng)養(yǎng)后，如后，如果在完全培果在完全培養(yǎng)養(yǎng)基上基上長長出菌落，而在基本培出菌落，而在基本培養(yǎng)養(yǎng)基上基上卻不卻不長長菌落，菌落，說說明明這這是一是一個營養(yǎng)個營養(yǎng)缺陷型菌株。缺陷型菌株。）逐）逐個檢個檢出法出法）限量）限量補補充培充培養(yǎng)養(yǎng)法法v限量補充培養(yǎng)法是將誘變處理后的細胞接種在含有微量(0.01以下)蛋白胨的基本培養(yǎng)基上。野生型菌株就會迅速生長成較大的菌落，而營養(yǎng)缺陷型菌株只能形成生長緩慢的微小菌落，因而可以識別檢出。如果想得到某一特定缺陷型菌株，則可直接在基本培養(yǎng)基上加入微量的相應(yīng)

15、物質(zhì)。4營養(yǎng)缺陷型的鑒定營養(yǎng)缺陷型的鑒定4營養(yǎng)缺陷型的鑒定營養(yǎng)缺陷型的鑒定四、營養(yǎng)缺陷型菌株的應(yīng)用四、營養(yǎng)缺陷型菌株的應(yīng)用v其在研究和實踐中都有極其重要的意義。它可作其在研究和實踐中都有極其重要的意義。它可作為研究代謝途徑和雜交、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、原生質(zhì)體為研究代謝途徑和雜交、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、原生質(zhì)體融合、質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座因子等遺傳規(guī)律所不可缺少的融合、質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座因子等遺傳規(guī)律所不可缺少的標(biāo)記菌種；也可作為氨基酸、維生素、堿基等物標(biāo)記菌種；也可作為氨基酸、維生素、堿基等物質(zhì)生物測定的實驗菌種；在生產(chǎn)中，可直接用作質(zhì)生物測定的實驗菌種；在生產(chǎn)中，可直接用作發(fā)酵生產(chǎn)核苷酸、氨基酸等代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)菌株；發(fā)酵生產(chǎn)核苷

16、酸、氨基酸等代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)菌株；也可作為菌種雜交、重組育種和利用基因工程進也可作為菌種雜交、重組育種和利用基因工程進行育種時所不可缺少的帶有特定基因標(biāo)記的親本行育種時所不可缺少的帶有特定基因標(biāo)記的親本菌株。菌株。31www.theme 笫三節(jié)笫三節(jié) 抗反饋調(diào)節(jié)突變型的篩選及應(yīng)用抗反饋調(diào)節(jié)突變型的篩選及應(yīng)用 一、反饋調(diào)節(jié)和抗反饋調(diào)節(jié)突變一、反饋調(diào)節(jié)和抗反饋調(diào)節(jié)突變 1.1. 反饋調(diào)節(jié)反饋調(diào)節(jié)2. 2. 抗反饋調(diào)節(jié)突變（解除反饋抑制和抗反饋調(diào)節(jié)突變（解除反饋抑制和/ /或反饋阻遏）或反饋阻遏）3. 3. 抗反饋調(diào)節(jié)突變株抗反饋調(diào)節(jié)突變株：是指一種對反饋抑制不敏感：是指一種對反饋抑制不敏感或?qū)ψ瓒粲?/p>

17、抗性的組成型突變株，或兼而有之的或?qū)ψ瓒粲锌剐缘慕M成型突變株，或兼而有之的突變株。突變株。v抗反饋抑制突變抗反饋抑制突變 由于編碼變構(gòu)酶調(diào)節(jié)中心的由于編碼變構(gòu)酶調(diào)節(jié)中心的結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突發(fā)生突變，從而使效應(yīng)物不能再和調(diào)節(jié)中心結(jié)合。變，從而使效應(yīng)物不能再和調(diào)節(jié)中心結(jié)合。v抗阻遏突變抗阻遏突變 由于由于調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，使產(chǎn)生的阻遏蛋白使產(chǎn)生的阻遏蛋白不再能和輔阻遏物結(jié)合，或由于操縱基因發(fā)生突不再能和輔阻遏物結(jié)合，或由于操縱基因發(fā)生突變，被激活的阻遏蛋白不能作用于已突變的操縱變，被激活的阻遏蛋白不能作用于已突變的操縱基因，從而解除產(chǎn)物的阻遏作用，使產(chǎn)物得以過基因，從而解除產(chǎn)物

18、的阻遏作用，使產(chǎn)物得以過量積累。量積累。突突變變前前 突突變變后后反反饋饋抑制抑制與與抗反抗反饋饋抑制突抑制突變變型型反饋阻遏反饋阻遏抗反饋阻遏突變的機制抗反饋阻遏突變的機制結(jié)構(gòu)類結(jié)構(gòu)類似物抗性突似物抗性突變變株的株的篩選篩選及及應(yīng)應(yīng)用用(一)結(jié)構(gòu)類結(jié)構(gòu)類似物似物與與抗抗結(jié)構(gòu)類結(jié)構(gòu)類似物突似物突變變 v結(jié)構(gòu)類似物結(jié)構(gòu)類似物analog (代謝拮抗物代謝拮抗物antimetabolite ) 指那些在結(jié)構(gòu)上和代謝終產(chǎn)物相似，可起到代謝指那些在結(jié)構(gòu)上和代謝終產(chǎn)物相似，可起到代謝物所具有的調(diào)節(jié)作用而不具備其生理活性的一類化合物所具有的調(diào)節(jié)作用而不具備其生理活性的一類化合物。物。v是一種與是一種與初級

19、代謝產(chǎn)物初級代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似但缺乏生理功結(jié)構(gòu)類似但缺乏生理功能的化合物。能的化合物。例例1 1：黃色短桿菌黃色短桿菌AHVr突變株可解除突變株可解除Thr的反饋抑的反饋抑制而積累蘇氨酸制而積累蘇氨酸(AK)Brevibacterium flavumv細胞內(nèi)細胞內(nèi)Thr過剩會出現(xiàn)的正常的反饋調(diào)節(jié)過剩會出現(xiàn)的正常的反饋調(diào)節(jié)v細胞內(nèi)細胞內(nèi)AHV過剩時會出現(xiàn)的情況過剩時會出現(xiàn)的情況AHV的作用：的作用： 結(jié)構(gòu)類似結(jié)構(gòu)類似過量是能引起反饋調(diào)節(jié)，使過量是能引起反饋調(diào)節(jié)，使Thr不能合成不能合成 無生理功能無生理功能不能參與蛋白質(zhì)的生物合成不能參與蛋白質(zhì)的生物合成AHV過剩的結(jié)果過剩的結(jié)果 多數(shù)細胞多數(shù)細胞

20、死亡死亡 少數(shù)細胞少數(shù)細胞基因突變基因突變存活存活 *基因突變與基因突變與AHV的存在之間無必然關(guān)系的存在之間無必然關(guān)系問題：問題：哪個基因突變可以產(chǎn)生哪個基因突變可以產(chǎn)生AHVAHV抗性突變？抗性突變？高絲氨酸脫氫酶高絲氨酸脫氫酶(Thr+AEC)r（二）（二）抗結(jié)構(gòu)類似物突變株在代謝調(diào)控育種中的應(yīng)用抗結(jié)構(gòu)類似物突變株在代謝調(diào)控育種中的應(yīng)用 v抗結(jié)構(gòu)類似物突變在氨基酸、核苷酸和維生素等抗結(jié)構(gòu)類似物突變在氨基酸、核苷酸和維生素等初級代謝產(chǎn)物的高產(chǎn)菌株選育中被廣泛應(yīng)用初級代謝產(chǎn)物的高產(chǎn)菌株選育中被廣泛應(yīng)用 問題：次級代謝產(chǎn)物篩結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株也能次級代謝產(chǎn)物篩結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株也能得到高產(chǎn)

21、菌株嗎？為什么？得到高產(chǎn)菌株嗎？為什么？（三）抗結(jié)構(gòu)類似物突變株的篩選（三）抗結(jié)構(gòu)類似物突變株的篩選 1. 一次性篩選法一次性篩選法v 已知出發(fā)菌株的藥物的臨界致死濃度已知出發(fā)菌株的藥物的臨界致死濃度2. 梯度平板法梯度平板法(階梯性篩選法階梯性篩選法)v 不不知道臨界致死濃度知道臨界致死濃度 v 適用于篩選對昂貴藥物具有抗性的突變株適用于篩選對昂貴藥物具有抗性的突變株 藥物梯度平板的制備及生長情況藥物梯度平板的制備及生長情況 問題：問題：在低藥物濃度區(qū)生長的菌落一定沒有高產(chǎn)突變株出在低藥物濃度區(qū)生長的菌落一定沒有高產(chǎn)突變株出現(xiàn)嗎？現(xiàn)嗎？問題問題：在結(jié)構(gòu)類似物平板上生長的抗性菌落，一定是接觸在

22、結(jié)構(gòu)類似物平板上生長的抗性菌落，一定是接觸反饋調(diào)節(jié)的高產(chǎn)突變株嗎？反饋調(diào)節(jié)的高產(chǎn)突變株嗎？3.3. 篩選抗結(jié)構(gòu)類似物突變株應(yīng)注意的問題篩選抗結(jié)構(gòu)類似物突變株應(yīng)注意的問題 如果終產(chǎn)物是和其它分支途徑的終產(chǎn)物通過協(xié)如果終產(chǎn)物是和其它分支途徑的終產(chǎn)物通過協(xié)同反饋抑制對共同前體合成途徑進行調(diào)節(jié)，則要同反饋抑制對共同前體合成途徑進行調(diào)節(jié)，則要在基本培養(yǎng)基中添加起協(xié)同反饋抑制作用的產(chǎn)物在基本培養(yǎng)基中添加起協(xié)同反饋抑制作用的產(chǎn)物或其結(jié)構(gòu)類似物或其結(jié)構(gòu)類似物。 抗結(jié)構(gòu)類似物突變是由多基因控制的，屬于數(shù)抗結(jié)構(gòu)類似物突變是由多基因控制的，屬于數(shù)量性狀，可通過逐漸提高結(jié)構(gòu)類似物的濃度使產(chǎn)量性狀，可通過逐漸提高結(jié)構(gòu)類

23、似物的濃度使產(chǎn)物的積累水平逐漸提高。物的積累水平逐漸提高。 抗結(jié)構(gòu)類似物突變和營養(yǎng)缺陷型突變等共同使抗結(jié)構(gòu)類似物突變和營養(yǎng)缺陷型突變等共同使用，提高產(chǎn)量的效果會更好。用，提高產(chǎn)量的效果會更好。 不同類型突變株積累不同類型突變株積累L-L-賴氨酸的水平賴氨酸的水平鈍齒鈍齒棒桿菌棒桿菌AECr20.0AECr, Hse-50.0北京棒桿菌北京棒桿菌Hse-36.6Hse-,AECr45.0突突變變菌株菌株突突變變型型產(chǎn)產(chǎn)量量(mg/ml)鈍齒鈍齒棒桿菌棒桿菌Hse-17.93鈍齒鈍齒棒桿菌棒桿菌Thr -2.33鈍齒鈍齒棒桿菌棒桿菌Thr - +Met -2.003.3.抗反饋調(diào)節(jié)突變株的篩選抗反

24、饋調(diào)節(jié)突變株的篩選v 通過篩選抗結(jié)構(gòu)類似物突變通過篩選抗結(jié)構(gòu)類似物突變v 通過回復(fù)突變通過回復(fù)突變（1）初級代謝產(chǎn)物營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變）初級代謝產(chǎn)物營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變（2 2）次級代謝產(chǎn)物營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變次級代謝產(chǎn)物營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變 DulaneyDulaney等使用等使用“原養(yǎng)型原養(yǎng)型營養(yǎng)缺陷型營養(yǎng)缺陷型原養(yǎng)型原養(yǎng)型”的路線，來篩選抗生素產(chǎn)量較高的突變株的路線，來篩選抗生素產(chǎn)量較高的突變株（3 3） 次級代謝產(chǎn)物零產(chǎn)量回復(fù)突變篩選抗反饋調(diào)次級代謝產(chǎn)物零產(chǎn)量回復(fù)突變篩選抗反饋調(diào)節(jié)突變株節(jié)突變株 采用采用“高產(chǎn)株高產(chǎn)株零變株零變株高產(chǎn)株高產(chǎn)株”選育途徑選育途徑代謝調(diào)控育種代謝調(diào)控育種代謝調(diào)控

25、育種的措施和原理代謝調(diào)控育種的措施和原理v 營養(yǎng)缺陷型突變，營養(yǎng)缺陷型突變，條件條件解除反饋抑制解除反饋抑制v 滲漏營養(yǎng)缺陷型，解除反饋抑制滲漏營養(yǎng)缺陷型，解除反饋抑制v 結(jié)構(gòu)類似物抗性突變，解除反饋調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)類似物抗性突變，解除反饋調(diào)節(jié)v 營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變，解除反饋調(diào)節(jié)營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變，解除反饋調(diào)節(jié)48www.theme 笫四節(jié)笫四節(jié) 其它突變型的篩選及應(yīng)用其它突變型的篩選及應(yīng)用 一、一、組組成型突成型突變變株的株的篩選篩選誘導(dǎo)酶誘導(dǎo)酶:只有在誘導(dǎo)底物存在時才能合成相應(yīng)的酶。只有在誘導(dǎo)底物存在時才能合成相應(yīng)的酶。1、誘導(dǎo)型酶在生產(chǎn)上的缺點、誘導(dǎo)型酶在生產(chǎn)上的缺點 誘導(dǎo)物往往價格昂貴誘導(dǎo)物往

26、往價格昂貴 受誘導(dǎo)物種類，濃度及分解產(chǎn)物的影響受誘導(dǎo)物種類，濃度及分解產(chǎn)物的影響2、篩選原理、篩選原理 通過誘變處理，使調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，不產(chǎn)通過誘變處理，使調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，不產(chǎn)生有活性的阻遏蛋白，或者操縱基因發(fā)生突變不生有活性的阻遏蛋白，或者操縱基因發(fā)生突變不再能與阻遏物相結(jié)合，從而使誘導(dǎo)型酶變?yōu)榻M成再能與阻遏物相結(jié)合，從而使誘導(dǎo)型酶變?yōu)榻M成型酶。（型酶。（酶的結(jié)構(gòu)基因未發(fā)生改變酶的結(jié)構(gòu)基因未發(fā)生改變）3、篩選篩選方法方法v 創(chuàng)造一種有利于組成型菌株生長而不利于創(chuàng)造一種有利于組成型菌株生長而不利于誘導(dǎo)型菌株生長的培養(yǎng)條件，造成對組成型的誘導(dǎo)型菌株生長的培養(yǎng)條件，造成對組成型的選擇優(yōu)勢，從而

27、篩選出組成型突變株。選擇優(yōu)勢，從而篩選出組成型突變株。v 選擇適當(dāng)?shù)蔫b別培養(yǎng)基，直接在平板上識選擇適當(dāng)?shù)蔫b別培養(yǎng)基，直接在平板上識別組成型突變株。別組成型突變株。具體的具體的篩選篩選方法方法1）限量誘導(dǎo)物恒化培養(yǎng)法：限量誘導(dǎo)物恒化培養(yǎng)法： 控制低于誘導(dǎo)濃度的誘導(dǎo)物作碳源進行恒化連控制低于誘導(dǎo)濃度的誘導(dǎo)物作碳源進行恒化連續(xù)培養(yǎng)。誘導(dǎo)型菌株不生長，而變異株由于能產(chǎn)續(xù)培養(yǎng)。誘導(dǎo)型菌株不生長，而變異株由于能產(chǎn)分解底物的酶分解底物的酶而得以生長而得以生長。通過連續(xù)不斷加入新通過連續(xù)不斷加入新鮮基質(zhì)，使變異株數(shù)量逐漸增多，最后達到能分鮮基質(zhì)，使變異株數(shù)量逐漸增多，最后達到能分離的濃度。離的濃度。例：在低濃

28、度乳糖的恒化器中，經(jīng)連續(xù)培養(yǎng)生長例：在低濃度乳糖的恒化器中，經(jīng)連續(xù)培養(yǎng)生長的大腸桿菌突變株，它不用誘導(dǎo)物，也能生成的大腸桿菌突變株，它不用誘導(dǎo)物，也能生成-半乳糖苷酶，生成量達細胞總蛋白的半乳糖苷酶，生成量達細胞總蛋白的25%25%。2 2）循環(huán)培養(yǎng)法：循環(huán)培養(yǎng)法：不含不含誘導(dǎo)誘導(dǎo)物培物培養(yǎng)養(yǎng)基基 含含誘導(dǎo)誘導(dǎo)物培物培養(yǎng)養(yǎng)基基(普通普通碳碳源或源或氮氮源源） （誘導(dǎo)誘導(dǎo)物作唯一物作唯一碳碳源或源或氮氮源源）兩菌都能生長，但組兩菌都能生長，但組成型變異株已能合成成型變異株已能合成特定的酶，親株不能特定的酶，親株不能變異株調(diào)整期短，親株調(diào)變異株調(diào)整期短，親株調(diào)整期長，短時間培養(yǎng)后，整期長，短時間培

29、養(yǎng)后，變異株所占比例增大變異株所占比例增大 反復(fù)循環(huán)培養(yǎng)幾次后，變異株所占比反復(fù)循環(huán)培養(yǎng)幾次后，變異株所占比例逐漸提高，然后進行分離。例逐漸提高，然后進行分離。3 3）誘導(dǎo)抑制劑法：誘導(dǎo)抑制劑法： 誘導(dǎo)物作唯一碳源或氮源，添加誘導(dǎo)抑制劑，誘導(dǎo)物作唯一碳源或氮源，添加誘導(dǎo)抑制劑，只有變異株能合成酶利用底物進行生長。只有變異株能合成酶利用底物進行生長。v誘導(dǎo)抑制劑：誘導(dǎo)抑制劑：能阻止某些酶的誘導(dǎo)合成的一些能阻止某些酶的誘導(dǎo)合成的一些化合物。化合物。例：例：E.coli E.coli 的的-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 誘導(dǎo)物：乳糖誘導(dǎo)物：乳糖 誘導(dǎo)抑制劑：誘導(dǎo)抑制劑：-硝基苯基硝基苯基- -巖藻糖苷巖藻糖

30、苷4）低誘導(dǎo)能力底物培養(yǎng)法：低誘導(dǎo)能力底物培養(yǎng)法：v利用誘導(dǎo)能力很低但能作為良好碳源的底物作為利用誘導(dǎo)能力很低但能作為良好碳源的底物作為唯一碳源對誘導(dǎo)后的菌液進行培養(yǎng)，組成型突變唯一碳源對誘導(dǎo)后的菌液進行培養(yǎng)，組成型突變株由于能合成分解該底物的酶，因此能生長；而株由于能合成分解該底物的酶，因此能生長；而需要誘導(dǎo)的野生型菌則不能生長，從而可以篩選需要誘導(dǎo)的野生型菌則不能生長，從而可以篩選出組成型突變株。出組成型突變株。5）鑒別培養(yǎng)基法（）鑒別培養(yǎng)基法（平板菌落識別法平板菌落識別法）例：例：篩選篩選E.coli -E.coli -半乳糖苷酶組成型突變株半乳糖苷酶組成型突變株v 將誘變后的細胞涂布接

31、種到以將誘變后的細胞涂布接種到以甘油為唯一甘油為唯一碳源碳源的平板上；的平板上；v培養(yǎng)后在長出的菌落上噴灑鄰硝基苯基半乳培養(yǎng)后在長出的菌落上噴灑鄰硝基苯基半乳糖苷糖苷( (OPNG) )， -半乳糖苷酶能分解半乳糖苷酶能分解無色無色的的OPNG，產(chǎn)生，產(chǎn)生黃色黃色鄰硝基苯基；鄰硝基苯基；v 組成型菌落呈黃色，誘導(dǎo)型菌落呈白色組成型菌落呈黃色，誘導(dǎo)型菌落呈白色（一）（一）降解代謝物阻遏降解代謝物阻遏 1 1、分解代謝物阻遏（葡萄糖效應(yīng)）、分解代謝物阻遏（葡萄糖效應(yīng)）v微生物代謝中，一些易分解利用的碳源或氮源及其微生物代謝中，一些易分解利用的碳源或氮源及其降解代謝產(chǎn)物阻遏與較難分解的碳氮源利用相關(guān)

32、的降解代謝產(chǎn)物阻遏與較難分解的碳氮源利用相關(guān)的酶的合成，稱為降解代謝物阻遏效應(yīng)。酶的合成，稱為降解代謝物阻遏效應(yīng)。v 舉例舉例v在工業(yè)生產(chǎn)中，避開降解代謝物阻遏的方法：在工業(yè)生產(chǎn)中，避開降解代謝物阻遏的方法： 一般使用緩慢利用的碳氮源（如多糖或黃豆粉等）一般使用緩慢利用的碳氮源（如多糖或黃豆粉等）或流加低濃度的易利用碳氮源（如流加葡萄糖和氨）或流加低濃度的易利用碳氮源（如流加葡萄糖和氨）的方法避開降解代謝物阻遏作用。的方法避開降解代謝物阻遏作用。 二、二、抗降解代謝物阻遏突變株的篩選與應(yīng)用抗降解代謝物阻遏突變株的篩選與應(yīng)用 Diauxic growth of E. coli（二）（二）抗碳源降

33、解代謝物阻遏突變株的篩選抗碳源降解代謝物阻遏突變株的篩選1. 選育抗葡萄糖結(jié)構(gòu)類似物突變株的方法篩選抗選育抗葡萄糖結(jié)構(gòu)類似物突變株的方法篩選抗碳源降解代謝物阻遏突變型碳源降解代謝物阻遏突變型 v 葡萄糖結(jié)構(gòu)類似物包括葡萄糖結(jié)構(gòu)類似物包括： 2-脫氧脫氧-D-葡萄糖（葡萄糖（2-dG） 3-甲基甲基-D-葡萄糖（葡萄糖（3-mG）v 葡萄糖結(jié)構(gòu)類似物會阻遏誘導(dǎo)酶的合成葡萄糖結(jié)構(gòu)類似物會阻遏誘導(dǎo)酶的合成 v 篩選方法：篩選方法：將誘變后的菌涂布在含葡萄糖結(jié)構(gòu)將誘變后的菌涂布在含葡萄糖結(jié)構(gòu)類似物的瓊脂培養(yǎng)基類似物的瓊脂培養(yǎng)基*上上 ( (三三) ) 抗氮源降解代謝物阻遏突變株的篩選抗氮源降解代謝物阻

34、遏突變株的篩選 v 氮源降解代謝物阻遏主要是指分解含氮底物的氮源降解代謝物阻遏主要是指分解含氮底物的酶受快速利用氮源的阻遏。酶受快速利用氮源的阻遏。v解除這種阻遏的方法：解除這種阻遏的方法：篩選氨結(jié)構(gòu)類似物和氨基篩選氨結(jié)構(gòu)類似物和氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株v甲胺是最常用的氨結(jié)構(gòu)類似物甲胺是最常用的氨結(jié)構(gòu)類似物 v舉例：舉例： 螺旋霉素的生物合成受螺旋霉素的生物合成受NHNH4 4+ +的阻遏，選的阻遏，選育耐甲胺突變株可以解除此阻遏作用，提高螺旋霉育耐甲胺突變株可以解除此阻遏作用，提高螺旋霉素的發(fā)酵效價。素的發(fā)酵效價。 三、細胞膜透性突變株的篩選與應(yīng)用三、細胞膜透性突變株

35、的篩選與應(yīng)用 u 提提高細胞膜透性的優(yōu)點高細胞膜透性的優(yōu)點使胞內(nèi)產(chǎn)物濃度維持較低的水平，有利于酶促反使胞內(nèi)產(chǎn)物濃度維持較低的水平，有利于酶促反應(yīng)的進行，提高產(chǎn)物的生成量應(yīng)的進行，提高產(chǎn)物的生成量使胞內(nèi)產(chǎn)物濃度維持低于發(fā)生反饋抑制或阻遏的使胞內(nèi)產(chǎn)物濃度維持低于發(fā)生反饋抑制或阻遏的程度，以積累過量的產(chǎn)物程度，以積累過量的產(chǎn)物u 提高提高細細胞膜透性胞膜透性 的措施的措施1 1、利用生物素營養(yǎng)缺陷型改變細胞膜透性、利用生物素營養(yǎng)缺陷型改變細胞膜透性1）生物素與細胞膜合成的關(guān)系生物素與細胞膜合成的關(guān)系v 生物素是乙酰輔酶生物素是乙酰輔酶A A羧化酶的輔酶羧化酶的輔酶，影響影響磷脂的合成和細胞膜結(jié)構(gòu)的完

36、整性。磷脂的合成和細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性。例例1 1：谷氨酸生產(chǎn)谷氨酸生產(chǎn) 生物素對于細胞膜（脂肪酸）的合成是必生物素對于細胞膜（脂肪酸）的合成是必需的篩選需的篩選BioBio- -，在限量添加生物素的情況下可使在限量添加生物素的情況下可使合成的谷氨酸大量分泌到胞外，使谷氨酸得以合成的谷氨酸大量分泌到胞外，使谷氨酸得以過量積累。過量積累。 2 利用油酸營養(yǎng)缺陷型改變細胞膜透性利用油酸營養(yǎng)缺陷型改變細胞膜透性1 1）油酸與細胞膜透性的關(guān)系）油酸與細胞膜透性的關(guān)系v 油酸是細胞膜主要組成物質(zhì)磷脂的重要組成成油酸是細胞膜主要組成物質(zhì)磷脂的重要組成成分，分，油酸的缺陷型將因為失去合成油酸的能力而不油酸的缺

37、陷型將因為失去合成油酸的能力而不能合成磷脂。能合成磷脂。 u 舉例：舉例：在棒桿菌谷氨酸發(fā)酵中，利用油酸營養(yǎng)缺陷型，并在發(fā)酵在棒桿菌谷氨酸發(fā)酵中，利用油酸營養(yǎng)缺陷型，并在發(fā)酵培養(yǎng)基中控制亞適量的油酸，提高谷氨酸產(chǎn)量。培養(yǎng)基中控制亞適量的油酸，提高谷氨酸產(chǎn)量。 3 3、利用甘油營養(yǎng)缺陷型改變細胞膜透性、利用甘油營養(yǎng)缺陷型改變細胞膜透性v甘油營養(yǎng)缺陷型由于喪失了自身合成甘油的能力，甘油營養(yǎng)缺陷型由于喪失了自身合成甘油的能力，從而也就喪失了合成磷脂的能力從而也就喪失了合成磷脂的能力 v通過控制培養(yǎng)基中甘油的添加量，也就可以改變通過控制培養(yǎng)基中甘油的添加量，也就可以改變細胞膜的透性。細胞膜的透性。 4

38、 4、利用溫度敏感突變株改變細胞膜透性利用溫度敏感突變株改變細胞膜透性v溫度敏感突變株是一種條件致死突變株溫度敏感突變株是一種條件致死突變株v細胞生長必需的任何酶或蛋白發(fā)生對溫度變化細胞生長必需的任何酶或蛋白發(fā)生對溫度變化更敏感的突變都可能形成這種條件致死突變型。更敏感的突變都可能形成這種條件致死突變型。其中，細胞膜結(jié)構(gòu)或功能的缺損就是主要原因其中，細胞膜結(jié)構(gòu)或功能的缺損就是主要原因之一。之一。5 5、利用溶菌酶敏感突變株提高細胞膜透性、利用溶菌酶敏感突變株提高細胞膜透性 四、次生代謝障礙突變株的篩選與應(yīng)用四、次生代謝障礙突變株的篩選與應(yīng)用1、利用次生代謝障礙突變合成同系新抗生素利用次生代謝障

39、礙突變合成同系新抗生素 v 在抗生素合成途徑中某一途徑由結(jié)構(gòu)基因突變在抗生素合成途徑中某一途徑由結(jié)構(gòu)基因突變引起的代謝障礙性改變（稱為引起的代謝障礙性改變（稱為區(qū)段突變區(qū)段突變），使抗），使抗生素結(jié)構(gòu)發(fā)生某些變化，從而導(dǎo)致形成同系物新生素結(jié)構(gòu)發(fā)生某些變化，從而導(dǎo)致形成同系物新抗生素?？股?。 u 四環(huán)素產(chǎn)生菌經(jīng)誘變育種獲得的蛋氨酸營養(yǎng)缺陷型突變四環(huán)素產(chǎn)生菌經(jīng)誘變育種獲得的蛋氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株具有了產(chǎn)生去甲基金霉素的能力株具有了產(chǎn)生去甲基金霉素的能力。 2、利用次生代謝障礙突變合成抗生素中間體、利用次生代謝障礙突變合成抗生素中間體v 區(qū)段突變還可以導(dǎo)致次級代謝產(chǎn)物合成途徑的阻區(qū)段突變還可以導(dǎo)致

40、次級代謝產(chǎn)物合成途徑的阻斷，從而積累中間體。斷，從而積累中間體。3、利用次生代謝障礙突變和人工前體合成新抗生素利用次生代謝障礙突變和人工前體合成新抗生素v 突變生物合成或突變合成（突變生物合成或突變合成（mutasynthesis）：）：v 篩選喪失了合成天然前體能力的突變株，加入前篩選喪失了合成天然前體能力的突變株，加入前體的結(jié)構(gòu)類似物，有可能把這種結(jié)構(gòu)類似物結(jié)合體的結(jié)構(gòu)類似物，有可能把這種結(jié)構(gòu)類似物結(jié)合到抗生素分子中，從而形成新的半合成抗生素。到抗生素分子中，從而形成新的半合成抗生素。 4、利用次生代謝障礙突變改善抗生素的組分利用次生代謝障礙突變改善抗生素的組分v通過次生代謝障礙突變株的篩

41、選，可以阻斷這些通過次生代謝障礙突變株的篩選，可以阻斷這些無益組分的合成途徑，從而提高產(chǎn)品產(chǎn)量，簡化無益組分的合成途徑，從而提高產(chǎn)品產(chǎn)量，簡化生產(chǎn)工藝，改善產(chǎn)品質(zhì)量。生產(chǎn)工藝，改善產(chǎn)品質(zhì)量。 巴龍霉胺慶大霉素A慶大霉素X2慶大霉素C2b慶大霉素C1五、其它抗性突變株的篩選與應(yīng)用五、其它抗性突變株的篩選與應(yīng)用 (一)抗藥突變株抗藥突變株1、抗藥突變株的用途、抗藥突變株的用途v 作為育種工作中最常使用的遺傳標(biāo)記作為育種工作中最常使用的遺傳標(biāo)記v 有些發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)量與生產(chǎn)菌株的抗藥性密切有些發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)量與生產(chǎn)菌株的抗藥性密切相關(guān)相關(guān) v 通過篩選抗自身藥物的抗藥性突變，以解除終通過篩選抗自身藥物的

42、抗藥性突變，以解除終產(chǎn)物對合成途徑的反饋調(diào)節(jié)作用，從而提高產(chǎn)量產(chǎn)物對合成途徑的反饋調(diào)節(jié)作用，從而提高產(chǎn)量2 2、篩選方法篩選方法 (二二) 抗噬菌體突變株抗噬菌體突變株 1、用途、用途 通過篩選抗噬菌體突變株來降低污染噬菌體的可通過篩選抗噬菌體突變株來降低污染噬菌體的可能性能性 ( (三三) ) 耐自身產(chǎn)物突變株耐自身產(chǎn)物突變株v 在酒精發(fā)酵和乳酸發(fā)酵等發(fā)酵過程，高濃度的在酒精發(fā)酵和乳酸發(fā)酵等發(fā)酵過程，高濃度的產(chǎn)物都會對產(chǎn)生菌產(chǎn)生抑菌或殺菌作用。產(chǎn)物都會對產(chǎn)生菌產(chǎn)生抑菌或殺菌作用。 ( (四四) )耐前體或前體結(jié)構(gòu)類似物突變株耐前體或前體結(jié)構(gòu)類似物突變株 v 主要應(yīng)用于抗生素生產(chǎn)菌的選育主要應(yīng)

43、用于抗生素生產(chǎn)菌的選育v 抗生素合成中的前體抗生素合成中的前體外源性、內(nèi)源性外源性、內(nèi)源性v 過量的前體往往對產(chǎn)生菌有毒性過量的前體往往對產(chǎn)生菌有毒性或具有反饋調(diào)或具有反饋調(diào)節(jié)作用節(jié)作用 外源性前體外源性前體，苯乙酸和苯氧乙酸加入到產(chǎn)黃青霉菌的發(fā)，苯乙酸和苯氧乙酸加入到產(chǎn)黃青霉菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別用于合成青霉素酵培養(yǎng)基中，分別用于合成青霉素G G和青霉素和青霉素V V 內(nèi)源性前體內(nèi)源性前體青霉素和頭孢霉素的生物合成中，所需要的青霉素和頭孢霉素的生物合成中，所需要的由由 - -氨基己酸、半胱氨酸和纈氨酸組成的三肽前體就是由氨基己酸、半胱氨酸和纈氨酸組成的三肽前體就是由產(chǎn)生菌自身合成的產(chǎn)生菌自身

44、合成的 六、無泡沫突變株的篩選與應(yīng)用六、無泡沫突變株的篩選與應(yīng)用1、用途：可以增加發(fā)酵罐的裝液量用途：可以增加發(fā)酵罐的裝液量v 酵母酒精發(fā)酵時大量泡沫的形成，使發(fā)酵罐的充酵母酒精發(fā)酵時大量泡沫的形成，使發(fā)酵罐的充滿系數(shù)受到很大的限制。滿系數(shù)受到很大的限制。2 2、篩選方法：、篩選方法：v 通常采用氣泡上浮法篩選通常采用氣泡上浮法篩選v 用凝集法進行篩選用凝集法進行篩選v 用苯胺藍染色法可篩選產(chǎn)生泡沫少的酵母突變株用苯胺藍染色法可篩選產(chǎn)生泡沫少的酵母突變株 73www.theme 第五節(jié)第五節(jié) 防止菌種的退化防止菌種的退化（菌種退化及其防止）（菌種退化及其防止）一、菌種退化及其表現(xiàn)一、菌種退化及

45、其表現(xiàn) 1、菌種退化、菌種退化 指生產(chǎn)菌種、優(yōu)良菌種或典型菌種經(jīng)傳代或保指生產(chǎn)菌種、優(yōu)良菌種或典型菌種經(jīng)傳代或保藏后，由于藏后，由于自發(fā)突變自發(fā)突變的結(jié)果，而使其群體中原有的的結(jié)果，而使其群體中原有的一系列生物學(xué)性狀減退或消失的現(xiàn)象。一系列生物學(xué)性狀減退或消失的現(xiàn)象。 2 2、菌種退化的具體表現(xiàn)：、菌種退化的具體表現(xiàn)：v 原有的形態(tài)性狀變得不典型原有的形態(tài)性狀變得不典型 v 生長速度變慢生長速度變慢v 代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)能力下降代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)能力下降v 致病菌對宿主侵染能力的下降致病菌對宿主侵染能力的下降 v 對外界不良條件的抵抗能力的下降對外界不良條件的抵抗能力的下降v 遺傳標(biāo)記丟失遺傳標(biāo)記丟失

46、 二、菌種退化的原因二、菌種退化的原因1 1、主要原因、主要原因基因（自發(fā)）突變基因（自發(fā)）突變 退化是發(fā)生在群體細胞中的一個從量變到質(zhì)退化是發(fā)生在群體細胞中的一個從量變到質(zhì)變的逐步演變過程，由于個別突變細胞表現(xiàn)生長變的逐步演變過程，由于個別突變細胞表現(xiàn)生長優(yōu)勢，導(dǎo)致在群體中最后數(shù)量占優(yōu)勢。優(yōu)勢，導(dǎo)致在群體中最后數(shù)量占優(yōu)勢。由表型延遲造成的誘變后菌株遺傳性不純引起的由表型延遲造成的誘變后菌株遺傳性不純引起的退化退化控制產(chǎn)量或遺傳標(biāo)記的質(zhì)粒脫落造成的退化控制產(chǎn)量或遺傳標(biāo)記的質(zhì)粒脫落造成的退化 2、重要原因重要原因v 傳代次數(shù)傳代次數(shù)v 不適宜的培養(yǎng)條件和保藏條件不適宜的培養(yǎng)條件和保藏條件 舉例：

47、米曲霉的異核體培養(yǎng)在含有酪蛋白的培養(yǎng)基上，異舉例：米曲霉的異核體培養(yǎng)在含有酪蛋白的培養(yǎng)基上，異核體中帶有酪蛋白酶基因的核，在數(shù)量上也會由劣勢轉(zhuǎn)變核體中帶有酪蛋白酶基因的核，在數(shù)量上也會由劣勢轉(zhuǎn)變?yōu)閮?yōu)勢，而在酪蛋白水解物培養(yǎng)基上，就處于劣勢。為優(yōu)勢，而在酪蛋白水解物培養(yǎng)基上，就處于劣勢。 產(chǎn)腺苷的黃嘌呤缺陷型菌株在接種傳代中產(chǎn)量和回復(fù)子頻率之間的關(guān)系產(chǎn)腺苷的黃嘌呤缺陷型菌株在接種傳代中產(chǎn)量和回復(fù)子頻率之間的關(guān)系 傳代數(shù)傳代數(shù)每代斜面保存時間（每代斜面保存時間（d） 回復(fù)子頻率回復(fù)子頻率 腺苷產(chǎn)量腺苷產(chǎn)量 （g/L） 11472.210-713.2 213314 4.210-7 14.9 6473

48、937114 4.510-6 10.7 74739313.58.14 2.910-713.1 94739313 834714 1.910-4 8.1 124739313 834146631 1.010-3 7.4 三、防止菌種退化的措施三、防止菌種退化的措施( (一一) )、從菌種選育方法上考慮、從菌種選育方法上考慮u 進行充分的后培養(yǎng)及分離純化進行充分的后培養(yǎng)及分離純化u 增加突變位點，減少基因回復(fù)突變的幾率增加突變位點，減少基因回復(fù)突變的幾率 ( (二二) )、從菌種使用及保藏方式上考慮、從菌種使用及保藏方式上考慮 盡量減少傳代次數(shù)盡量減少傳代次數(shù) 創(chuàng)造適宜的培養(yǎng)條件創(chuàng)造適宜的培養(yǎng)條件 利

49、用不易退化的細胞傳代利用不易退化的細胞傳代 采用有效的菌種保藏方法采用有效的菌種保藏方法( (三三) )、從菌種管理的措施上考慮、從菌種管理的措施上考慮v 狹義的復(fù)壯狹義的復(fù)壯是指在菌種已經(jīng)發(fā)生退化的情況下，是指在菌種已經(jīng)發(fā)生退化的情況下，通過純種分離和篩選，從已經(jīng)退化的群體中篩選通過純種分離和篩選，從已經(jīng)退化的群體中篩選出尚未退化的個體，以達到回復(fù)原菌株固有性狀出尚未退化的個體，以達到回復(fù)原菌株固有性狀的措施。的措施。 v 廣義的復(fù)壯廣義的復(fù)壯生產(chǎn)育種生產(chǎn)育種 是在菌種的典型特征或生產(chǎn)性狀尚未退化前，經(jīng)是在菌種的典型特征或生產(chǎn)性狀尚未退化前，經(jīng)常有意識地進行純種分離和篩選，以期從中選擇常有意

50、識地進行純種分離和篩選，以期從中選擇到自發(fā)的正突變個體或淘汰掉少量已退化的個體到自發(fā)的正突變個體或淘汰掉少量已退化的個體 四、四、退化菌種的復(fù)壯退化菌種的復(fù)壯 rejuvenation1、純種純種分離分離純種純種分離法分離法菌落菌落純純(“ “菌菌種種” ”純純)平板表面涂布法平板表面涂布法平板平板劃線劃線分離法分離法傾傾注平板分離法注平板分離法細細胞胞純純(“ “菌株菌株” ”純純)“ “分離小室分離小室” ”單細單細胞分離法胞分離法顯顯微操微操縱儀單細縱儀單細胞分離法胞分離法菌菌絲絲尖端切割分離法尖端切割分離法補充：補充：Ames試驗試驗vAmes教授首先發(fā)明教授首先發(fā)明 v利用細菌突變來

51、檢測環(huán)境中存在的致癌物質(zhì)的一利用細菌突變來檢測環(huán)境中存在的致癌物質(zhì)的一種種簡便、快速、靈敏簡便、快速、靈敏的方法。的方法。v可以通過某待測物質(zhì)對微生物的誘變能力間接判可以通過某待測物質(zhì)對微生物的誘變能力間接判斷其致癌能力。斷其致癌能力。一、一、誘變作用測定方法概論誘變作用測定方法概論1 1、靈敏度、靈敏度v鏈霉素依賴型鏈霉素依賴型非依賴型非依賴型v藥物敏感藥物敏感抗性抗性v營養(yǎng)缺陷型營養(yǎng)缺陷型非缺陷型非缺陷型2 2、代表性、代表性v誘變作用的生物專一性誘變作用的生物專一性v誘變作用的基因?qū)Ｒ恍哉T變作用的基因?qū)Ｒ恍栽碓?誘變劑的共性原則，即化學(xué)藥劑對細菌的誘誘變劑的共性原則，即化學(xué)藥劑對細菌

52、的誘變率與其對動物的致癌性成正比。變率與其對動物的致癌性成正比。v 該試驗是利用鼠傷寒沙門氏菌該試驗是利用鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhmurium)的的組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株(his-)的回復(fù)突變性能來進行的。的回復(fù)突變性能來進行的。3 3、測定方法：快速、簡單、測定方法：快速、簡單A AB BSalmonella typhmuriumSalmonella typhmurium hishis- - 在不含在不含組氨組氨酸平板上的生酸平板上的生長長A A平板：平板：濾紙濾紙上無化上無化學(xué)藥學(xué)藥物物B B平板：平板：濾紙濾紙上有化上有化學(xué)藥學(xué)藥物物1、指示菌株指示菌株：一組具有不同結(jié)構(gòu)改變的組氨酸缺陷型菌株：一組具有不同結(jié)構(gòu)改變的組氨酸缺陷型菌株TA1535(rfa,uvrB,hisG46)hisG46 是堿基置換突變是堿基置