蛋白質(zhì)檢測(cè)(Lowry)--方法學(xué)驗(yàn)證

1、lowry 法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量本法用于微量蛋白質(zhì)的含量測(cè)定。蛋白質(zhì)在堿性溶液中可形成銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物，此復(fù)合物加入酚試劑后，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，該化合物在波長650nm 處的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，根據(jù)供試品的吸光度，計(jì)算供試品的蛋白質(zhì)含量。1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.1 確保 lowry 法的準(zhǔn)確、可重復(fù)并耐用，為建立檢驗(yàn)操作程序提供依據(jù)。2材料與儀器2.1 待測(cè)樣品：蛋白純化后樣品2.2 實(shí)驗(yàn)試劑100g /ml 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液的制備：取20.5mg bsa 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（中檢所），加入注射水2.05ml 溶解，即為10mg/ml 的蛋白標(biāo)儲(chǔ)備液；在精密量取儲(chǔ)備液液0.50ml 置 50ml 容量瓶中，用純化水

2、定容至刻度線，搖勻，即為100g/ml 的標(biāo)準(zhǔn)蛋白工作液。4%碳酸鈉溶液：準(zhǔn)確稱取碳酸鈉4.00g，在容量瓶中定容至100ml。0.8%氫氧化鈉溶液：準(zhǔn)確稱取氫氧化鈉0.80g，在容量瓶中定容至100ml。0.1mol/l 酒石酸鉀溶液：準(zhǔn)確稱取酒石酸鉀 2.36g， 在容量瓶中定容至 100ml。0.04mol/l 硫酸銅溶液：準(zhǔn)確稱取硫酸銅1.00g，在容量瓶中定容至100ml。酚試劑：取自質(zhì)檢部2.3 儀器：紫外分光光度計(jì)、移液器2.4 器具：移液管、試管架、一次性吸頭、卷紙3實(shí)驗(yàn)步驟3.1 按照下表平行配置兩份蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液：0 1 2 3 4 5 蛋白質(zhì)濃度 g /ml 0 20

3、40 60 80 100 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)加量ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 加水量 ml 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 3.2 堿性銅溶液配制：按4%碳酸鈉溶液： 0.8%氫氧化鈉溶液： 0.1mol/l 酒石酸鉀溶液： 0.04mol/l 硫酸銅溶液 =50:50:1:1的體積比進(jìn)行配液（現(xiàn)用現(xiàn)配） ；3.3 酚試劑：使用前，用純水按體積比1:1 稀釋。3.4 取待測(cè)樣品稀釋至蛋白濃度在50ug/ml 左右，取兩支試管中，每管加入1ml待測(cè)樣品；3.5 在向每支試管中加入5.0ml 的堿性銅溶液，混勻，靜置10min；3.6 向每支試管中快速加0.5ml 的酚試劑

4、，混勻，室溫靜置30min；3.7 使用紫外分光光度計(jì)測(cè)量每管溶液在波長650nm處的吸光度。4 方法學(xué)驗(yàn)證4.1 精密度實(shí)驗(yàn)：將樣品按照需要稀釋到線性范圍內(nèi)（約50g/ml ）后取 0.5ml再加入等體積 60g/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（ 0.5ml） 。平行制備 7 份，按上述“ 3”方法操作，再分別檢測(cè)其od650 吸光度，計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。序號(hào)加樣后測(cè)定值原樣測(cè)定值標(biāo)準(zhǔn)品濃度加樣回收率1 2 3 4 5 6 7 加樣回收率平均值加樣回收率 rsd% 判斷標(biāo)準(zhǔn)：測(cè)得的加樣回收率的平均值要在80%-120%之間， rsd3%。4.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：4.2.1 不同濃度的樣品的回收率（40g/ml 、

5、60g/ml 、80g/ml ） ：將樣品按照需要稀釋到線性范圍內(nèi)（約 50g/ml ） 后取 0.5ml， 再依次分別加入等體積的60g/ml 、80g/ml 、100g/ml 3 個(gè)濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（ 0.5ml） 。按上述“ 3”方法操作，再分別檢測(cè)其 od650 吸光度，計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。注：平行復(fù)孔加入標(biāo)準(zhǔn)品濃度加樣后測(cè)定值原樣測(cè)定值加樣回收率40 g/ml60 g/ml80 g/ml判斷標(biāo)準(zhǔn)：測(cè)得的加樣回收率的要在80%-120%之間。4.2.2 不同的供試樣品濃度的回收率（樣品稀釋倍數(shù)0、2、4） ：將已知蛋白質(zhì)濃度的樣品按照需要分別稀釋0、2、4 倍后取 0.5ml，再依次分別加

6、入等體積的60g/ml 濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 （0.5ml） 。 按上述“3” 方法操作，再分別檢測(cè)其 od650吸光度，計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。注：平行復(fù)孔樣品濃度 g/ml標(biāo)準(zhǔn)品濃度加樣后測(cè)定值加樣回收率0 倍稀釋60.00 g/ml2 倍稀釋4 倍稀釋判斷標(biāo)準(zhǔn)：測(cè)得的加樣回收率的平均值要在80%-120%之間。4.3 方法的重復(fù)性研究4.3.1 3批不同樣品的回收率：將樣品按照需要稀釋到線性范圍內(nèi)（約50g/ml ）后取 0.5ml，再依次分別加入等體積的 60g /ml 濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（ 0.5ml） 。按上述“ 3”方法操作，再分別檢測(cè)其 od650 吸光度，計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。注：平行復(fù)孔樣品批

7、次樣品濃度 g/ml標(biāo)準(zhǔn)品濃度加樣后測(cè)定值加樣回收率1 60.00g/ml2 3 判斷標(biāo)準(zhǔn)：測(cè)得的加樣回收率的平均值要在80%-120%之間。4.3.2 三個(gè)人同一批次的樣品的回收率：三個(gè)人分別同時(shí)操作， 將樣品按照需要稀釋到線性范圍內(nèi)（約50g/ml ）后取 0.5ml，再依次分別加入等體積的60g/ml濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（ 0.5ml） 。按上述“ 3”方法操作，再分別檢測(cè)其od650 吸光度，計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。注：平行復(fù)孔姓 名樣品濃度 g/ml標(biāo)準(zhǔn)品濃度加樣后測(cè)定值加樣回收率60.00g/ml判斷標(biāo)準(zhǔn)：測(cè)得的加樣回收率的平均值要在80%-120%之間。5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立： 以 0g/ml 、 20g/ml 、 40g/ml 、 60g/ml 、 80g/ml 、 100g/ml標(biāo)準(zhǔn)