微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程69084868

1、微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程目的：建立微生物限度檢查的基本操作，為微生物檢查人員提供止確的操作規(guī)程。2.依據(jù)：中華人民共和國藥典2000年版二部。中華人民共和國一衛(wèi)生部藥品t生檢驗方法am本標(biāo)準(zhǔn)適用于qc化驗室的微生物限度檢查。4. 職責(zé)：qc微生物檢驗員對本標(biāo)準(zhǔn)的實丿施負(fù)責(zé)。5. 程序：5.1. 定義：微生物限度檢查法：系指菲規(guī)定滅菌制劑及其原輔料受到微生物污染程度 的一種檢查方法，包括染菌量及控制菌的檢查。5.2. 實驗用具：電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫水溫箱、試管、刻度吸管、量筒、三角瓶、培養(yǎng)皿、試管架、 注射器、針頭、注射器盒、研缽、75%酒精棉球、紫外燈(365nm波長)。5.3. 培養(yǎng)

2、基：5.3.1. 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、 枸椽酸鹽培養(yǎng)基、磷酸鹽葡萄糖月東水培養(yǎng)基、蛋白陳水培養(yǎng)基、4甲基傘形酮葡萄糖甘酸(mug)培養(yǎng)基5.3.2. 培養(yǎng)基的管理、配制應(yīng)符合檢定菌、培養(yǎng)基管理規(guī)程(smpzl0036)、培養(yǎng)基配 制規(guī)程(sopzl0016)o5.4. 試液：甲基紅試液、a 奈酚乙醇試液、40%氫氧化鉀溶液、靛基質(zhì)試液。5.5. 稀釋劑：0.9%無菌氯化鈉溶液。5.6. 供試品溶液的制備：取供試品(供試品如為i古i體，置研缽屮研磨成細(xì)粉)放入試 管中，加入適量的稀釋劑制成1:10濃度的供試品溶液。5.7. 對照用菌液：控制菌檢查

3、均應(yīng)作相應(yīng)已知菌的對照試驗，對照菌株為大腸桿 菌cmcc (b) 44102o取相應(yīng)菌株的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物1白金耳，接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi), 培養(yǎng)1820小時，稀釋至對照菌的加入量為50j00個。58檢查法：5.8.1. 除另有規(guī)定外，細(xì)菌的培養(yǎng)溫度為30-35°c,霉菌的培養(yǎng)溫度為25-28°c,控制菌的 培養(yǎng)溫度為35±l°co5.8.2. 細(xì)菌、霉菌計數(shù)：平皿菌落計數(shù)法 取均勻供試液，進一步稀釋成1:10 1:103等適宜的稀釋級。 分別取連續(xù)三級10倍稀釋的供試液各lml,置宜徑約90mm的平皿中，再注入約45°c的培 養(yǎng)基

4、約15ml,混勻，等凝固后，倒置培養(yǎng)，每稀釋級應(yīng)作23個平皿。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細(xì)菌計數(shù)，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌計數(shù)。5822 菌數(shù)測定陰性對照試驗 取供試驗用的稀釋劑各lml,置4個無菌平皿中， 分別按細(xì)菌、霉菌計數(shù)用的培養(yǎng)基制備平板，培養(yǎng)，檢查，不得長菌。582.3. 細(xì)菌培養(yǎng)時間為48小時，分別在24小時及48小時點計菌落數(shù)，一般以48 小時菌落數(shù)為準(zhǔn)，霉菌培養(yǎng)時間為72小吋，分別在48小吋及72小吋點計菌落數(shù)，一般以 72小時菌落數(shù)為準(zhǔn)。菌落如蔓延生長成片，不宜計數(shù)。5.5.2.4. 點計后，計算各稀釋級的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌數(shù)。5.5.2.5. 菌數(shù)報告規(guī)則：細(xì)菌宜選

5、取平均菌落數(shù)在30-300之間的稀釋級，霉菌宜選取 平均菌落數(shù)在30-100之間的稀釋級，作為報告菌數(shù)計算的依據(jù)。如只有1個稀釋級菌落數(shù)在30-300 (30-100)之間時，將該稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告，如同吋有兩 個稀釋級在30-300 (30-100)之間時，按下式計算兩級比值。高稀釋級平均菌落數(shù)x稀釋倍數(shù)'低稀釋級平均菌落數(shù)x稀釋倍數(shù)當(dāng)比值w2時，以兩稀釋級的均值報告，當(dāng)比值22時以低稀釋級平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù) 報告，如同時有3個稀釋級的平均菌落數(shù)均在30-300 (30-100)之間時，以后兩個稀釋級計 算級間比值，如各稀釋級的平均菌落數(shù)均不在30-300 (30-1

6、00)之間，以最接近30或300 的稀釋級平均菌數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告，如各稀釋級平均菌落數(shù)均在300 (100)之上，按最高 稀釋級菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告，如各稀釋級平均菌落數(shù)均小于30時，一般按最低稀釋級 的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告，如當(dāng)1:10(1:100)稀釋級平均菌落數(shù)等于或大于原液(或1:10) 時，應(yīng)以培養(yǎng)基稀釋法測定，按測定結(jié)果報告菌數(shù)。5826 培養(yǎng)基稀釋法：取供試液(原液或1:10供試液)3份，每份各51,分別注入 5個平川1內(nèi)(每肌各0. 2ml)每個平川l中傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15ml,混勻，凝固后倒置培 養(yǎng)，計數(shù)，每51注入的5個平板點計的菌落數(shù)之和即為每51的菌落數(shù)，共得

7、3組數(shù)據(jù)， 以3份供試液菌落數(shù)的平均值乘以稀釋倍數(shù)報告。如各稀釋級平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級平均菌落數(shù)小于1吋，則報告菌數(shù)為小 于10個。5.8.3. 控制菌檢查 除另有規(guī)定外，取供試液10ml （相當(dāng)于供試品lg> lml、cm2）, 直接或處理后接種，經(jīng)增菌、分離培養(yǎng)后，進行革蘭氏染色、生化試驗等項檢查。大腸桿菌：5.8.3.1.1 取膽鹽乳糖培養(yǎng)基3份，每份100ml, 2份分別加入規(guī)定量的供試液，其中1份加入對照菌50100個作陽性對照，第3份加入與供試液等量的稀釋液作陰性對照。 培養(yǎng)1824小時（必耍吋可延至48小吋）。陰性對照應(yīng)無菌生長。取上述3份的培養(yǎng)物各0.2ml,

8、 分別接種至5mlmug培養(yǎng)基管內(nèi)培養(yǎng)，分別于5小吋與24小時時，取未接種的mug培養(yǎng) 基管作木底對照，將各管置365nm紫外光下觀察。陽性對照呈現(xiàn)熒光，mug陽性。供試液 的mug管呈現(xiàn)熒光，mug陽性；無熒光，mug陰性。然后加數(shù)滴靛基質(zhì)試液于mug管 內(nèi)，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑木色為陰性。當(dāng)陰性對照呈陰性，陽性對照正常生長，供試液膽鹽乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)液澄明，并證明無菌生長，判未檢出大腸桿菌。供試液mug陽性，靛基質(zhì)陽性，判檢出 大腸桿菌；mug陰性，靛基質(zhì)陰性，判未檢出大腸桿菌。如mug陽性、靛基質(zhì)陰性，或mug陰性、靛基質(zhì)陽性，均應(yīng)取供試液膽鹽乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)物劃線于麥康凱瓊指平板，

9、培養(yǎng)1824小時，如上述供試液培養(yǎng)物的 分離平板無菌落生長，判未檢岀大腸桿菌?；蛴芯渖L，應(yīng)挑選23可疑菌落作靛基質(zhì)試 驗（i）、甲基紅試驗（m）、乙酰甲基甲醇生成試驗（vp）、枸椽酸鹽利用試驗（c）及革 蘭氏染色、鏡檢，按表1規(guī)定判斷結(jié)果。tmvic 試驗：靛基質(zhì)試驗：（t）取上述斜面培養(yǎng)物，接種于蛋白腺水培養(yǎng)物中，培養(yǎng)24 小時，沿管壁加入靛基質(zhì)試液數(shù)滴，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑木色為陰性。甲基紅試驗（m）：取上述斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖腺水培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)48±2小時，于管內(nèi)加入甲基紅指示劑數(shù)滴，立即觀察，呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈 黃色為陰性。乙酰甲基甲醇生成試驗

10、（v-p試驗）：取上述斜面培養(yǎng)物，接種丁磷酸鹽葡 萄糖腺水培養(yǎng)基，培養(yǎng)48±2小吋，每2nd培養(yǎng)液中加入ci-奈酚乙醇試液1ml混勻，再加 40%氫氧化鉀溶液0. 4ml,充分振搖，在4小吋內(nèi)，如出現(xiàn)紅色應(yīng)判為陽性，無紅色應(yīng)為陰性。枸椽酸鹽利用試驗(c)：取上述斜面培養(yǎng)物，接種于枸椽酸鹽培養(yǎng)基的斜 面上，培養(yǎng)4872小吋，培養(yǎng)基斜面有菌苔生長，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樘m色吋為陽性，培養(yǎng)基 顏色無改變時為陰性。結(jié)果判斷見表lo對與mug-1反應(yīng)不符的可疑菌株，應(yīng)重新分離培養(yǎng)，再作 生化試驗證實。當(dāng)空白對照試驗呈陰性；供試品檢查為革蘭氏陰性無芽砲桿菌，乳糖發(fā)酵產(chǎn) 酸產(chǎn)氣或產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；imvic試

11、驗為陽性、陽性、陰性、陰性或陰性、陽性、陰性、陰性， 可判為檢出人腸桿菌。農(nóng)1mug的結(jié)果判斷mug-1曙紅亞甲藍瓊脂imvic結(jié)果+ +檢出人腸桿菌- -未檢川1人腸桿菌+ -無菌生長未檢川1人腸桿菌+ -有菌生長檢出大腸桿菌-+有菌生長+ + (2)檢出大腸桿菌注：如出現(xiàn)+-或出現(xiàn)-+-，均應(yīng)重新分離菌株，再作比gt和tmvic試驗。革蘭陰性桿菌。5.8.3.1.4.1. 結(jié)果判斷：5.9.1. 細(xì)菌菌落數(shù)、霉菌菌落數(shù)、控制菌三項均符合該品種微生物限度項下的規(guī)定，應(yīng) 判為供試品符合規(guī)定；其中任何一項不符合該品種項下規(guī)定，應(yīng)判供試品不符合規(guī)定。5.9.2. 細(xì)菌菌落數(shù)、霉菌菌落數(shù)第一次測定超

12、過該品種項下微生物限度規(guī)定時，應(yīng)從同 一批號樣品中隨機抽樣，復(fù)試兩次，以三次結(jié)果平均值報告。5.9.3. 如營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上生長霉菌菌落數(shù)或玫塊紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上生長細(xì) 菌菌落數(shù)超過該品種項下微生物限度規(guī)定時，經(jīng)復(fù)試2次，如3次結(jié)果平均值仍超過規(guī)定應(yīng) 判為供試品不符合規(guī)定。5.9.4. 各類制劑檢岀控制菌或其他致病菌時，按第一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不再抽樣復(fù)試, 即應(yīng)判該供試品不符合規(guī)定。5.8.3.1.4.2. 活嫡檢查法：設(shè)備和材料：顯微鏡、放大鏡、解剖針、發(fā)絲針、小毛筆、載玻片、蓋玻片、30%甘汕水、培養(yǎng)皿或 小搪瓷盤。檢查法：取供試品放在預(yù)先襯有潔凈黑紙的培養(yǎng)皿或小搪瓷盤中。先用肉眼觀

13、察，有無疑似活哺的白點或其它顏色的點狀物，再用510倍 放人鏡或雙筒實體顯微鏡檢視，有哺者，用解剖針或者發(fā)絲針或小毛筆挑取活哺放在滴 有一滴甘汕水的載玻片上，置顯微鏡下觀察。50.2.3.活嫡卵的檢驗方法：蛹卵極小，一般在0.1mm以下，呈乳白色，橢圓形 或卵圓形。須用1020倍放人鏡或顯微鏡方可查見。嚇卵常見丁活嚇群的周圍，但在未檢岀 活嚇的樣品中，亦有檢出嚇卵者。一般在供試品中已經(jīng)檢出活廟，不再進行嚇卵的檢查，對可 疑供試品，未檢出活嚇吋,可注意檢查活哺卵。檢驗方法：可采用檢驗活嚇項下的育檢法或漂浮法檢查。凡用上述兩種方法檢查，如發(fā) 現(xiàn)可疑嫡卵吋，用發(fā)絲針小心挑取。取一塊凹形載玻片，在凹窩中央滴入2滴甘汕水，將挑 取物放入甘汕水中，置顯微鏡下檢查。為確證挑取物是否為活嚇卵，可將上述載玻片置培養(yǎng) 皿中，加蓋，于2230°c培養(yǎng)38天，每天上、下午定吋用低倍顯微鏡觀察，如在甘汕水液 中孵出幼!w,則判斷為檢出活嫡卵。供試品檢驗報告：凡供試品按上述方法檢驗，發(fā)現(xiàn)活嚇者，應(yīng)作檢出活嚇報告。在供試品中未檢出活嚇，但檢出活滿卵時