GBS核酸檢測學(xué)習(xí)課程

1、GBS概述概述第1頁/共33頁第一頁，編輯于星期五：二十點 三十二分。GBS概述概述 B族鏈球菌(Group B Streptococcus,GBS)學(xué)名無乳鏈球菌，革蘭氏陽性鏈球菌，正常寄居于陰道和直腸，屬于條件致病菌。 在20世紀(jì)70年代，GBS已被證實為圍產(chǎn)期母嬰感染的主要致病菌之一，在圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)中占有不可忽視的地位。第2頁/共33頁第二頁，編輯于星期五：二十點 三十二分。什么是圍產(chǎn)期什么是圍產(chǎn)期 國外研究表明 ，不同地區(qū)、不同種族的妊娠晚期婦女GBS帶菌率約為6.536.0，國內(nèi)報道的妊娠婦女GBS帶菌率為3.5%32.4，新生兒體表帶菌率與母體帶菌率相似。在一些特殊人群，如肥胖、糖耐量

2、異常、多次妊娠以及性生活活躍的婦女中帶菌率較高。人群人群GBS帶菌率帶菌率 是指懷孕28 周到產(chǎn)后一周這一分娩前后的重要時期 圍產(chǎn)期保健是指產(chǎn)前、產(chǎn)時和產(chǎn)后的一段時間內(nèi)，對母親、胎兒和新生兒進行一系列的保健工作，使母親健康和胎兒、新生兒的成長發(fā)育得到很好的保護。第3頁/共33頁第三頁，編輯于星期五：二十點 三十二分。GBS對孕婦的影響對孕婦的影響 GBS感染是胎膜早破的重要發(fā)病因素感染是胎膜早破的重要發(fā)病因素 GBS對絨毛膜有較強吸附能力和穿透能力，接種2小時內(nèi)即可吸附于母體組織，繼而侵入絨毛膜，通過炎癥細胞的吞噬作用及細菌產(chǎn)生的蛋白水解酶的直接侵襲，使胎膜局部張力減低，從而導(dǎo)致胎膜早破 。

3、GBS生殖道感染是導(dǎo)致早產(chǎn)的重要因素生殖道感染是導(dǎo)致早產(chǎn)的重要因素 GBS引起泌尿生殖道感染時，會引起磷脂酶A2和前列腺素及細胞因子的釋放，刺激子宮收縮導(dǎo)致早產(chǎn)。GBS是造成產(chǎn)褥感染的主要致病菌之一是造成產(chǎn)褥感染的主要致病菌之一 產(chǎn)褥感染是指分娩時及產(chǎn)褥期生殖道受病原體感染，引起局部和全身的炎性應(yīng)化。產(chǎn)褥感染發(fā)病率為1%7.2%，是產(chǎn)婦死亡的原因之一 。第4頁/共33頁第四頁，編輯于星期五：二十點 三十二分。GBS對新生兒的影響對新生兒的影響GBS感染是新生兒感染的主要原因感染是新生兒感染的主要原因早發(fā)型感染早發(fā)型感染 n多見于出生后1周內(nèi)。n母嬰垂直傳播是其主要傳播途徑。n主要臨床表現(xiàn)為敗血

4、癥（80%）、肺炎（7%）、腦膜炎（6%）；若治療不及時，可引發(fā)遠期后遺癥，如智力發(fā)育遲緩、視覺聽覺喪失等。 晚發(fā)型感染晚發(fā)型感染n 多發(fā)生于出生1周后。n 主要為水平傳播：可能與院內(nèi)感染或家庭接觸有關(guān)。n 常呈隱匿性發(fā)病，其特征表現(xiàn)為腦膜炎；1/3的晚發(fā)型疾病出現(xiàn)腦膜炎，故這些生存下來的新生兒中更易發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。第5頁/共33頁第五頁，編輯于星期五：二十點 三十二分。GBS的傳播與感染的傳播與感染感染GBS產(chǎn)婦 未傳染給新生兒3060%傳染給新生兒40%70%無癥狀97%早發(fā)性疾?。簲⊙Y，肺炎或腦膜炎1%3%5%會導(dǎo)致死亡第6頁/共33頁第六頁，編輯于星期五：二十點 三十二分。國內(nèi)外

5、國內(nèi)外GBS篩查現(xiàn)狀篩查現(xiàn)狀美國疾病控制中心(CDC) 制定了圍產(chǎn)期GBS預(yù)防指南該指南已經(jīng)獲得以下認可：p美國婦產(chǎn)科學(xué)院p美國兒科學(xué)會p美國護士助產(chǎn)士協(xié)會p美國家庭醫(yī)生協(xié)會p美國微生物學(xué)會p美國流行病學(xué)會p美國藥理學(xué)會在我國，2011年，中華醫(yī)學(xué)會婦產(chǎn)科學(xué)分會產(chǎn)科學(xué)組在孕前和孕期保健指南(第1版)中已將B族鏈球菌篩查作為一個備查項目。第7頁/共33頁第七頁，編輯于星期五：二十點 三十二分。圍產(chǎn)期圍產(chǎn)期GBS預(yù)防指南預(yù)防指南指出指出對所有孕婦于妊娠3537 周進行GBS篩查，結(jié)果陽性者進行預(yù)防性治療以下情況應(yīng)進行預(yù)防性治療 ：p本次妊娠有GBS 菌尿p上次新生兒GBS 感染史p 在妊娠37 周

6、之前分娩p 破膜時間超過18小時p 分娩體溫超過38.0度第8頁/共33頁第八頁，編輯于星期五：二十點 三十二分。GBS的篩查與預(yù)防的篩查與預(yù)防陽性(+)或產(chǎn)時高危因素：早產(chǎn)，產(chǎn)時發(fā)熱38 ，胎膜早破18小時不需要抗生素預(yù)防孕35-37周取陰道和直腸拭子作GBS檢測陽性(+)抗生素預(yù)防未檢測陰性()臨產(chǎn)后GBS檢測陰性( )且無產(chǎn)時高危因素抗生素預(yù)防第9頁/共33頁第九頁，編輯于星期五：二十點 三十二分。預(yù)防預(yù)防GBS疾病的抗生素使用方案舉例疾病的抗生素使用方案舉例:圍產(chǎn)期GBS預(yù)防指南指出： GBS陽性患者應(yīng)用抗生素進行預(yù)防性治療陽性患者應(yīng)用抗生素進行預(yù)防性治療 Boyer在1989年研究中

7、指出，產(chǎn)時氨芐青霉素使用超過1小時就可以使得新生兒感染從28%減少到4%。LIN在2001年的研究中表明，與無產(chǎn)時應(yīng)用抗生素相比，抗生素預(yù)防超過2小時的有效率是89%，不足2小時的有效率為71%。挑戰(zhàn)：我媽媽會進行IAP治療嗎？第10頁/共33頁第十頁，編輯于星期五：二十點 三十二分。有無青霉素過敏否是青霉素G，首次劑量500萬單位（靜脈注射）然后每4小時250300萬單位，直至分娩或者氨芐青霉素，首次劑量2g（靜脈注射），然后每4個小時1g，直到分娩病人在接受青霉素或頭孢菌素時有無出現(xiàn)下列任一癥狀？過敏癥、血管性水腫、呼吸窘迫、蕁麻疹否是頭孢唑啉，首次劑量2G，然后每8個小時1g，直到分娩紅

8、霉素和克林霉素治療是否有效否是萬古霉素每12小時1g（靜脈注射）直至分娩克林霉素每8小時900mg（靜脈注射）直至分娩圍產(chǎn)期GBS預(yù)防指南第11頁/共33頁第十一頁，編輯于星期五：二十點 三十二分。GBS檢測方法比較檢測方法比較方法學(xué)具體方法優(yōu)勢劣勢細菌培養(yǎng)選擇肉湯培養(yǎng)液18-24h，血平皿培養(yǎng)18-36h；后 續(xù) 藥 敏 學(xué) 實 驗 ：STAEP簽定板條培養(yǎng)4-24h后，藥敏學(xué)分析。結(jié)果判讀直觀，易開展，成本低，可進行藥敏學(xué)分析。周期長（18-60h)，特別不適合臨產(chǎn)時孕婦不知道自身是否有GBS感染的情況；靈敏度較低；實驗操作人員需要較深的經(jīng)驗。細菌抗原檢 測乳膠微粒凝集試驗、協(xié)同凝集試驗、

9、對流免疫電泳試驗及酶聯(lián)免疫試驗等。操作比培養(yǎng)法簡便，成本低。由于B族鏈球菌血清型較多，容易造成漏檢，靈敏度相對較低。熒光PCR方法檢測熒光探針，PCR法擴增核酸。采用的是所有B族鏈球菌cfb基因保守序列，所有GBS都存在；靈敏度最高，出結(jié)果快（2h），操作簡單。需要專門的PCR實驗室及熒光PCR儀。第12頁/共33頁第十二頁，編輯于星期五：二十點 三十二分。PCR介紹介紹第13頁/共33頁第十三頁，編輯于星期五：二十點 三十二分。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)，簡稱PCR，是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大擴增特定的DNA片段；可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。

10、 什么是什么是PCR PCR原理原理PCR一般由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：DNA變性變性：（90-96）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA 。退火退火 ：（25-65）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。 延伸延伸：（70-75）：在Taq酶的作用下，以dNTP為原料，從引物的3端5端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。 每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍;23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。 第14頁/共33頁第十四頁，編輯于星期五：二十點 三十二分。PCR原理原理變性，退火，延伸一次循環(huán)二次循環(huán)三次循環(huán)第15頁/共33頁第十

11、五頁，編輯于星期五：二十點 三十二分。PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系中的主要試劑有： 緩沖液緩沖液 一般酶試劑會有配套緩沖液，通常含有Mg2+dNTP通常包括通常包括dATP, dGTP, dTTP, dCTP引物引物與待擴增DNA鏈互補的DNA片段純化水純化水水的純度要求很高，最好只有水分子，不含其它成份酶酶一般為Taq酶模板模板待擴增DNA鏈第16頁/共33頁第十六頁，編輯于星期五：二十點 三十二分。PCR擴增儀擴增儀 PCR溫度循環(huán)至關(guān)重要，PCR擴增儀各參數(shù)必須準(zhǔn)確。 現(xiàn)已有幾十家不同的廠家在國內(nèi)外生產(chǎn)和銷售PCR擴增儀。國外廠家：Bio-Rad，ABI, Roche 國內(nèi)廠家：

12、杭州朗基 ，杭州博日第17頁/共33頁第十七頁，編輯于星期五：二十點 三十二分。PCR反應(yīng)特點反應(yīng)特點特異性強特異性強：引物與模板DNA特異正確結(jié)合 ，堿基配對原則 ，Taq DNA聚合酶忠實性擴增靈敏度高靈敏度高 ：PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12）量級的起始待測模板擴增到微克（g=10-6）水平 簡便快速簡便快速：一般在14 小時完成擴增反應(yīng) 模板純度要求低模板純度要求低 ：不需要分離病毒/細菌/培養(yǎng)細胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴增模板 第18頁/共33頁第十八頁，編輯于星期五：二十點 三十二分。1. 每擴增一條DNA鏈，就切斷一個探針2. 每切斷一

13、個探針，就產(chǎn)生一個單位熒光信號3. 熒光信號強度與結(jié)合探針的DNA分子數(shù)成正比實時熒光PCR技術(shù)：是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過擴增曲線對模板進行分析的方法。 第19頁/共33頁第十九頁，編輯于星期五：二十點 三十二分。GBS核酸檢測產(chǎn)品核酸檢測產(chǎn)品第20頁/共33頁第二十頁，編輯于星期五：二十點 三十二分。熒光熒光PCRPCR檢測檢測B B族鏈球菌（族鏈球菌（GBSGBS） 第21頁/共33頁第二十一頁，編輯于星期五：二十點 三十二分。B B族鏈球菌族鏈球菌(GBS)(GBS)核酸檢測試劑盒核酸檢測試劑盒(PCR-(PCR-熒光探針法熒

14、光探針法) )第22頁/共33頁第二十二頁，編輯于星期五：二十點 三十二分。 Taqman 探針實時PCR技術(shù) 選擇B族鏈球菌基因組特異且無高頻SNP位點的序列區(qū)域cAMP因子，設(shè)計特異性引物和探針 內(nèi)參照系統(tǒng)排除PCR反應(yīng)過程中可能的假陰性結(jié)果 UNG酶避免擴增污染物造成的假陽性 適用儀器：Roche LightCycler 480，ABI 7500，Bioer Line-Gene K等多色熒光PCR儀產(chǎn)品特點產(chǎn)品特點第23頁/共33頁第二十三頁，編輯于星期五：二十點 三十二分。規(guī)格：20人份/盒有效期：18 以下避光保存6個月試劑：DNA提取液、GBS PCR反應(yīng)液、GBS陽性對照品，空白

15、對照品標(biāo)本類型：生殖道/直腸等部位帶上皮細胞的分泌物標(biāo)本試劑盒介紹試劑盒介紹第24頁/共33頁第二十四頁，編輯于星期五：二十點 三十二分。 溶血樣本、保婦康栓、皮炎平對檢測結(jié)果有顯著影響，應(yīng)盡量避免這些樣本的檢測。 其他常見干擾物質(zhì)（粘液和膿液）以及常用藥物（青霉素G、阿奇霉素、強力霉素及氧氟沙星、聚甲酚磺醛溶液、潔爾陰洗液、黃硝呋太爾制霉素陰道軟膠囊、肛泰軟膏、開塞露）均無明顯影響。待測樣本在2-8保存不應(yīng)超過24小時；-18以下保存不超過4天。標(biāo)本要求標(biāo)本要求標(biāo)本標(biāo)本保存保存第25頁/共33頁第二十五頁，編輯于星期五：二十點 三十二分。檢測流程（檢測流程（ 2 h ）35 min5 min

16、1h 10minn PCR擴增n 結(jié)果分析n 分裝GBS PCR反應(yīng)液n 加DNA模板PCR反應(yīng)體系配制PCR擴增及結(jié)果分析DNA 提取n 標(biāo)本n GBS陽性對照品n 空白對照品第26頁/共33頁第二十六頁，編輯于星期五：二十點 三十二分。DNA提取提取1mL標(biāo)本沉淀+1mL生理鹽水沉淀+ 50L DNA提取液99-100 加熱10min取上清至1.5mL離心管中保存13,000 rpm 10 min13,000 rpm 5 min13,000 rpm 10 min標(biāo)本，GBS陽性對照品，空白對照品均需要提取DNA。第27頁/共33頁第二十七頁，編輯于星期五：二十點 三十二分。PCR體系配制體

17、系配制40 L 體系：體系：35 L PCR反應(yīng)液反應(yīng)液 + 5 L DNA模板模板PCR擴增擴增程序： 50 2min 95 5min（ 95 15s60 35s ）45 cycles實時監(jiān)測PCR擴增過程FAM 通道 HEX通道第28頁/共33頁第二十八頁，編輯于星期五：二十點 三十二分。 FAM通道檢測結(jié)果：分析樣本，空白對照品： Ct值不顯示；陽性對照品： Ct30.00； HEX通道檢測結(jié)果： 分析內(nèi)參照基因，Ct35.00 陰性陰性：樣品的FAM通道無Ct值顯示, HEX通道Ct35.00 陽性陽性： 樣品的FAM通道 Ct38.00， HEX通道Ct35.00備注備注：若樣品的F

18、AM通道 38.00Ct45.00，建議重新檢測該樣本， 若重檢結(jié)果仍為38.00Ct45.00或Ct38.00，判定為陽性陽性； 若Ct不顯示且HEX通道Ct35.00，判定為陰性陰性。結(jié)果有效性判定結(jié)果有效性判定結(jié)果分析結(jié)果分析以上要求需在同一次實驗中同時滿足以上要求需在同一次實驗中同時滿足第29頁/共33頁第二十九頁，編輯于星期五：二十點 三十二分。產(chǎn)品優(yōu)勢一產(chǎn)品優(yōu)勢一 靈敏度高：靈敏度高：采用PCR方法檢測DNA，試劑與國際領(lǐng)先試劑性能相同 特異性強：特異性強：不與臨床常見其它各類病原體產(chǎn)生交叉反應(yīng) 穩(wěn)定性好：穩(wěn)定性好：樣本DNA提取質(zhì)量高，陽性對照品、空白對照品內(nèi)參基因擴增曲線高度吻合，試劑穩(wěn)定 無污染：無污染：全封閉PCR體系，避免實驗室其它PCR產(chǎn)物污染 易操作：易操作：操作簡便，采用預(yù)制PCR反應(yīng)液，無需額外加入內(nèi)參照基因、酶等 速度快：速度快：檢測周期短，從核酸提取到PCR結(jié)束實驗過程不到2小時第30頁/共33頁第三十頁，編輯于星期五：二十點 三十二分。產(chǎn)品優(yōu)勢二產(chǎn)品優(yōu)勢二 公司GB