用弗氏檸檬酸菌酶法合成L-酪氨酸

1、項目四 用弗氏檸檬酸菌酶法合成L-酪氨酸 預習方案 一：基礎知識弗氏檸檬酸菌直徑約1.0，長2.06.0m，單個和成對。弗氏檸檬酸桿菌隸屬腸桿菌科(Enterobacteriaceae)枸櫞酸桿菌屬(Citrobacter)。該菌革蘭氏陰性，需氧或兼性厭氧，為條件致病菌，廣泛分布于自然界中，是人和動物(哺乳類、鳥類、爬行類及兩棲類)腸道內正常的菌群。藥物敏感性試驗結果表明，該菌對氟羅沙星、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、依諾沙星、氧氟沙星、左氟沙星等7種抗生素高度敏感。L-酪氨酸中文名稱:L-酪氨酸中文別名:L-對羥苯基-丙氨酸;(2S,3R)-2-氨基-3-對羥苯基丙酸英文名稱:L-Tyros

2、ineL-酪氨酸屬氨基酸的一種，白色結晶體或結晶粉末，無味，易溶于甲酸，難溶于水，不溶于乙醇和乙醚。在稀鹽酸或稀硝酸中溶解。一種含有酚羥基的芳香族極性氨基酸。是組成蛋白質的20種氨基酸中的一種，是哺乳動物的必需氨基酸，又是生酮和生糖氨基酸?！拘誀睿骸縇-體從水中結晶出來者，無色至白色絲光針狀結晶或結晶性粉末；d-體從水中結晶者為無色晶體；dl-體從水中結晶者為有光澤的針狀晶體。純品穩(wěn)定，烴類共存下則易分解?；瘜W性較活潑。微溶于水（0.04g/100ml,25度）。溶于稀無機酸和堿性溶液。不溶于無水乙醇和乙醚。屬非必需氨基酸。【制備或來源】由含蛋白質的物質（廢絲、酪蛋白和玉米等）水解液中提取；以

3、葡萄糖為原料，經短桿菌出發(fā)誘導的l-酪氨酸生產菌發(fā)酵而得；以苯酚、丙酮酸、氨為原料，利用-酪氨酸酶催化制取【用途】a.醫(yī)藥用作甲狀腺功能亢進；b.食品添加劑。c.是一種重要的生化試劑，是合成多肽類激素、抗生素、L-多巴等藥物的主要原料。d.廣泛用于農業(yè)科學研究，也作飲料添加劑和配制人工昆蟲飼料。超聲波超聲波是物質介質中的一種彈性機械波，它是一種波動形式，因此它可以用于探測人體的生理及病理信息，既診斷超聲。同時，它又是一種能量形式，當達到一定劑量的超聲在生物體內傳播時，通過它們之間的相互作用,能引起生物體的功能和結構發(fā)生變化，即超聲生物效應。超聲對細胞的作用主要有熱效應，空化效應和機械效應。熱效

4、應是當超聲在介質中傳播時，摩擦力阻礙了由超聲引起的分子震動，使部分能量轉化為局部高熱（42-43），因為正常組織的臨界致死溫度為45.7，而腫瘤組織比正常組織敏感性高，故在此溫度下腫瘤細胞的代謝發(fā)生障礙，DNA、RNA、蛋白質合成受到影響，從而殺傷癌細胞而正常組織不受影響?？栈窃诔曊丈湎?，生物體內形成空泡，隨著空泡震動和其猛烈的聚爆而產生出機械剪切壓力和動蕩，使腫瘤出血、組織瓦解以致壞死。弗氏檸檬酸菌的培養(yǎng)及破碎革蘭氏陰性，通常以周生鞭毛運動。兼性厭氧。有呼吸和發(fā)酵兩種類型的代謝。在普通肉胨瓊脂上的菌落一般直徑24mm，光滑、低凸、濕潤、半透明或不透明，灰色，表面有光澤，邊緣整齊。偶爾

5、可見粘液或粗糙型。氧化酶陰性。接觸酶陽性?；苡袡C營養(yǎng)，能利用檸檬酸鹽作為惟一碳源。硝酸鹽還原到亞硝酸鹽。沒有賴氨酸脫羧酶。不產生苯丙氨酸脫氨酶、明膠酶、脂肪酶和DNA酶。不分解藻朊酸鹽和果膠酸鹽。發(fā)酵葡萄糖產酸產氣。甲基紅試驗陽性。VP試驗陽性。實驗材料（1）菌株 弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）（2）試劑：LB培養(yǎng)基 配方：酵母提取物 5g 蛋白胨10g NaCl 5g 瓊脂 1520g 水 1000mL pH 7.47.6實訓步驟（1）菌種培養(yǎng)配制培養(yǎng)基菌種活化待滅菌后的固體培養(yǎng)基冷卻至50時，倒入平板中，待平板凝固后，挑取菌種進行劃線接種。接種好的平板倒置放于

6、培養(yǎng)箱，37培養(yǎng)24h。擴大培養(yǎng)挑取上面培養(yǎng)好的菌落，放入已滅菌好的液體培養(yǎng)基的三角瓶中進行擴大培養(yǎng)。37、200r/min搖床過夜培養(yǎng)。（培養(yǎng)時間不能太長，否則細菌老化，代謝產物太多）（2）破碎細胞菌體收集取已經培養(yǎng)過夜的弗氏檸檬酸菌菌懸液于離心管中，3000r/min 離心5min，棄上清液，收集菌體。細胞破碎向離心后的沉淀中加入Tris-HCL（PBS）緩沖液（1:20），在漩渦混合器混合。然后再超聲破碎儀下破碎，功率和時間根據菌液多少確定。功率不得太高，不要起氣泡。循環(huán)次數不要太多，運行2s，間歇6s。冰上破碎效果更佳，菌液破碎鉛為乳白色，破碎后為透明。收集破碎液將破碎好的液體倒入離心

7、管中離心，3000r/min離心5min。棄沉淀，上清液備用。酪氨酸酚裂解酶的活力測定福林酚試劑是磷鉑酸鹽與磷鎢酸鹽的混合物。它在堿性條件下不穩(wěn)定，能被酪氨酸中的酚基還原，生成鉑藍、鎢藍的混合物。酪蛋白在蛋白酶作用后產生的酪氨酸可與福林酚試劑反應，所生成的藍色化合物可用比色法測定。用弗氏檸檬酸菌酶法合成L-酪氨酸酪氨酸酚裂解酶( tyrosine phenol-lyase，TPL，EC4.1992) ，也稱 -酪氨酸酶，在生物體內催化L-酪氨酸裂解生成苯酚、丙酮酸和氨，但在生物體外可將苯酚、丙酮酸和氨轉化為L-酪氨酸而L-酪氨酸常作為營養(yǎng)增補劑、苯丙酮尿癥患者的必需氨基酸，以及L-多巴、黑色素

8、、對羥基肉桂酸、對羥基苯乙烯等醫(yī)藥化工產品的制備原料。TPL催化L-酪氨酸裂解的最適pH為82，pH60時該酶基本沒有活性。一般認為這種高、低pH情況下的酶活差異是由于pKa約為78的二種催化堿的質子化引起的。TPL的作用機理 TPL催化的-消除反應機制主要包括以下步驟: 酶活性部位Lys257的-氨基與PLP共價結合形成內醛亞胺，內醛亞胺與底物 L-酪氨酸作用形成外醛亞胺，Lys257奪取外醛亞胺(底物)C質子產生醌型中間物，經底物C質子化及C-C鍵斷裂生成-氨基丙烯酸中間物，-氨基丙烯酸中間物進一步受與PLP結合的Lys257-氨基攻擊再生TPL全酶。實訓原理：TPL由4個相同的亞基組成。

9、Demidkina等將每個亞基分成N-末端臂、小結構域、大結構域及結構域間的連接區(qū)等四個部分。TPL的催化活性需要磷酸吡哆醛(pyridoxalphosphate，PLP)作為輔因子。每個亞基含有1個PLP結合位點，該位點位于一個亞基大、小結構域與結晶學相關的另一亞基大結構域之間形成的深裂內。TPL的催化活性還需要單價陽離子K+或NH4+作為激活劑。每個亞基含有1個K+結合位點，該位點位于結晶學相關的二個亞基之間相聯系的界面上，具有穩(wěn)定催化二聚體的作用。K+的配位數為7，它們是一個亞基Gly52和Asn262的羧基氧、另一個結晶學相關亞基Glu69的主鏈羧基氧與側鏈羧基氧，以及三分子水。Phi

10、llips等認為，Lys256緊鄰PLP結合位點Lys257，在單價陽離子結合位點的形成中具有關鍵作用。不同陽離子與配位體在距離上的微小差異，引起了活性部位構象的細微改變，這可能是不同陽離子對TPL活性具有不同效應的原因。L-酪氨酸是目前仍采用酸水解法生產的少數氨基酸之一，收率低，環(huán)境污染嚴重，應用酶法取代水解法生產L-酪氨酸具有重要的應用價值。用TPL合成L-酪氨酸，首先開展的工藝是丙酮酸路線。Para等將包埋于聚丙烯酰胺凝膠中的Cintermiedius固定化細胞作為催化劑，分批添加底物，建立75mmol/L丙酮酸鈉、45mmol/L硫酸銨、45mmol/L氯化銨和55mmol/L苯酚的轉

11、化體系，反應5h后可積累L-酪氨酸10g/L。若將反應體系置于連續(xù)的柱反應器內，苯酚對L-酪氨酸的轉化率達90%，且穩(wěn)定性可維持5d。酶法合成產物L-酪氨酸的分析鑒定酪氨酸酪氨酸的測定層析法方法原理：紙層析法是利用各物質不同的分配系數，使混合物隨流動相時而得到分離的方法。紙層析法是以濾紙作為惰性支持物的。濾紙纖維與水親和力較強，而與有機溶劑親和力弱，所以紙層析以濾紙纖維和結合水為固定相，以有機溶劑為流動相。當有機相沿濾紙流動經過樣品點時，樣品點上的溶液在水相和有機相之間進行分配，樣品移動速率與樣品的極性及水親和力有關，因此，極性氨基酸移動較慢，而非極性氨基酸移動較快。在一定的條件下某種物質的R

12、f值是常數。 Rf值的大小與物質的結構、性質、溶劑系統、層析濾紙的質量和層析溫度等因素有關。實驗試劑1. 展層劑和平衡液正丁醇:冰醋酸:水=4:1:5，充分搖勻，用分液漏斗取上層液作展層劑；下層液作平衡液(棄去)。2. 樣品液用水配成每ml含有絲氨酸、亮氨酸、脯氨酸各4mg/ml的氨基酸溶液，以及上述四種氨基酸的混合液(各4mg/ml)。3. 茚三酮按展層劑0.25%的比例將茚三酮加入展層劑中，使其溶解。實訓器材及試劑：（1）層析缸 （2）毛細管：5只 （3）培養(yǎng)皿：1只（4）層析濾紙（長16cm、寬16cm的） （5）直尺、鉛筆 （6）電吹風：1只 （7）針、白線 （8）小試管：4只 （9）

13、 移液管等常規(guī)儀器 （10）噴霧器 實訓步驟：（1）檢查培養(yǎng)皿是否干燥、潔凈；若否，將其洗凈并置于干燥箱內120烘干。（2）規(guī)劃：取寬約16cm、高約16cm的層析濾紙一張。在紙的下端距邊緣2cm處輕輕用鉛筆劃一條平行于底邊的直線A，在直線上做4個記號，記號之間間隔2cm，這就是原點的位置。另在距左邊緣1cm處畫一條平行于左邊緣的直線B，在B線上以A、B兩線的交點為原點標明刻度（以厘米為單位）（3）點樣：在每個圈下用鉛筆記上每種氨基酸的代號(混合樣可寫M)，然后用毛細管吸取樣品，輕輕地點到相應的氨基酸圈內，待晾干或用冷風吹干后再點第二次。前三種氨基酸各點3次，混合液點6次。將點過樣的濾紙用針線

14、卷成筒狀（點樣面向內），注意紙的兩邊不能接觸，留一定縫隙。 注意： 點樣用的毛細管和試劑瓶上的氨基酸是一一對應的，千萬不能混淆，以免污染。（4）層析：將培養(yǎng)皿中放入2/3量的展層劑，迅速放置于層析缸中。把濾紙筒轉移到此培養(yǎng)皿內，樣品端向下垂直放置，切勿使展層劑浸到樣品點。當溶劑前沿到達濾紙2/3處，取出濾紙，用鉛筆描出溶劑前沿。注意：點樣端朝下，點樣處不能沒 入層析液中，濾紙不能貼壁。（5）顯色：熱風吹干濾紙至顯出氨基酸斑點，用鉛筆描出輪廓。參考文獻:1?？】?劉均忠,劉茜,焦慶才. 重組酪氨酸酚裂解酶全細胞催化合成L-酪氨酸J. 精細化工,20132李偉平. 構建重組大腸桿菌生物合成左旋多巴D.江南大學,2005. 3RobertS、Phillips ,劉序章. 用酪氨酸苯酚裂合酶催化苯酚和 S