重組質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

1、 山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告 2012年11月21 日 姓名 系年級(jí) 10級(jí)生命基地 組別 JD-4 同組者 科目 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 題目 重組質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定 學(xué)號(hào) 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 學(xué)習(xí)在實(shí)現(xiàn)DNA體外重組過程中，正確選擇合適的載體和限制性內(nèi)切酶并能用限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)載體和目的DNA進(jìn)行切割，產(chǎn)生利于連接的合適末端。2. 學(xué)習(xí)設(shè)計(jì)構(gòu)建重組DNA分子的基本方法，掌握載體和外源目的DNA酶切的操作。3. 學(xué)習(xí)利用T4 DNA連接酶把酶切后的載體片段和外源目的DNA片段連接起來，構(gòu)建體外DNA分子的技術(shù)，了解并掌握幾種常用的連接方式。4. 掌握利用Cacl2 制備感受態(tài)細(xì)胞的方法。5. 學(xué)習(xí)掌握熱

2、擊法轉(zhuǎn)化E.coli的原理和方法。6. 學(xué)習(xí)并掌握使用紅白菌落法篩選獲得重組子以及互補(bǔ)篩選法的原理及方法。7. 學(xué)習(xí)并掌握使用Omaga試劑盒抽提質(zhì)粒的方法及進(jìn)一步確定重組質(zhì)粒中含有外源目的DNA片段。實(shí)驗(yàn)原理：（一）限制性核酸內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)體外構(gòu)建重組DNA分子，首先要了解目的基因的酶切圖譜，選用的限制性內(nèi)切酶不能在目的基因內(nèi)部有專一的識(shí)別位點(diǎn)，否則當(dāng)用一種或兩種限制性內(nèi)切酶切割外源供體DNA時(shí)不能得到完整的目的基因。其次要選擇具有相應(yīng)的單一酶切位點(diǎn)質(zhì)?；蛘呤删w載體分子。常用的酶切方法有雙酶切法和單酶切法兩種。本實(shí)驗(yàn)采用單酶切法，即只用一種限制性內(nèi)切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段兩端

3、將產(chǎn)生相同的黏性末端或平末端，再選用同樣的限制性內(nèi)切酶處理載體。在構(gòu)建重組子時(shí)，除了形成正常的重組子外，還可能出現(xiàn)目的DNA片段以相反方向插入載體分子中，或目的DNA串聯(lián)后再插入載體分子中，甚至出現(xiàn)載體分子自連，重新環(huán)化的現(xiàn)象。單酶切法簡(jiǎn)單易行，但是后期篩選工作比較復(fù)雜。各種限制性內(nèi)切酶都有其最佳反應(yīng)條件，最主要的因素是反應(yīng)溫度和緩沖液的組成。在雙酶切體系中，如果兩種酶對(duì)鹽離子的濃度和溫度要求一致，原則上可以將這兩種酶同時(shí)加入一個(gè)反應(yīng)體系中同步酶切；如果不一致，則酶切反應(yīng)最好分步進(jìn)行，常用的酶切順序是：先低鹽后高鹽，先低溫后高溫。酶切與連接是兩個(gè)密切相關(guān)的步驟，要達(dá)到高效率的連接，必須酶切完全

4、，酶切的DNA數(shù)量要適當(dāng)。另外，酶切反應(yīng)的規(guī)模也取決于需要酶切的DNA的量，以及相應(yīng)的所需酶的量。一般的，酶切0.21.0µg的DNA分子時(shí)，反應(yīng)體積約為1520µg，DNA的量越大，反應(yīng)體積可按比例適當(dāng)放大。酶的用量參照標(biāo)準(zhǔn)：一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單位酶能在指定的緩沖液系統(tǒng)和溫度下，1h完全酶解1µg的pBR322 DNA分子。如果酶活力低，可以適當(dāng)增加酶的用量，但是最高不能超過反應(yīng)總體積的10%。因?yàn)橄拗菩院怂醿?nèi)切酶一般是保存在50%甘油的緩沖液中，如果酶切反應(yīng)體系中甘油的含量超過5%，就會(huì)抑制酶的活性。（二）載體與外源DNA的連接反應(yīng)連接反應(yīng)總是緊跟酶切反應(yīng)，外源DNA片

5、段與載體分子連接的方法即DNA分子體外重組技術(shù)主要依賴限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶催化完成的。DNA連接酶催化兩雙鏈DNA片段相鄰的5-磷酸和3-OH間形成磷酸二酯鍵。在分子克隆中最有用的DNA連接酶是來自T4噬菌體的T4 DNA連接酶，它可以連接黏性末端和平末端。連接反應(yīng)時(shí)，載體DNA和外源DNA的摩爾數(shù)之比控制在1:（13）之間，可以有效地解決DNA多拷貝插入的現(xiàn)象。實(shí)際操作中，反應(yīng)溫度介于酶作用速率和末端結(jié)合速率之間，一般是16，平末端適當(dāng)提高連接反應(yīng)溫度。反應(yīng)時(shí)間與溫度有關(guān)，隨溫度的提高，反應(yīng)速度增加，所需時(shí)間會(huì)相應(yīng)減少，16下最常用的連接時(shí)間為12-16h。（三）感受態(tài)細(xì)胞的制備及

6、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化構(gòu)建好的重組DNA轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的現(xiàn)象就是轉(zhuǎn)化。能進(jìn)行轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞必須是感受態(tài)細(xì)胞，即受體細(xì)胞最容易接受外源DNA片段實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的生理狀態(tài)，它決定于受體菌的遺傳特性，同時(shí)與菌齡、外界環(huán)境等因素有關(guān)。人工轉(zhuǎn)化是通過人為誘導(dǎo)的方法使細(xì)胞具有攝取DNA的能力，或人為地將DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，該過程與細(xì)菌自身的遺傳控制無關(guān)，常用熱擊法，電穿孔法等。能否實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化還與受體細(xì)胞的遺傳特性有關(guān)，所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)的缺陷變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法有CaCl2法，制備好的感受態(tài)細(xì)胞可以加入終濃度為15%的無菌甘油，-70可保存

7、半年至一年。經(jīng)過CaCl2處理的細(xì)胞細(xì)胞膜通透性增加，允許外源DNA分子進(jìn)入。在低溫下，將攜帶有外源DNA片段的載體與感受態(tài)細(xì)胞混合，經(jīng)過熱擊或電穿孔技術(shù)，使載體分子進(jìn)入細(xì)胞。進(jìn)入受體細(xì)胞的外源DNA分子通過復(fù)制、表達(dá)，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將這些轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，即可篩選出重組子。本實(shí)驗(yàn)以E.coli- DH 5菌株為受體細(xì)胞，用CaCl2處理，使其處于感受態(tài)，然后將重組后的pUC19質(zhì)粒在42下熱擊90s，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。（四）重組子的鑒定與外源基因的表達(dá)重組DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞后，必須使用各種篩選與鑒定手段區(qū)分轉(zhuǎn)化子（接納載體或重組DNA分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞）與非轉(zhuǎn)化子（未接納載

8、體或重組DNA分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞）。而轉(zhuǎn)化子又分為含有重組DNA的轉(zhuǎn)化子（重組子）和僅含有空載體分子的轉(zhuǎn)化子（非重組子）。重組子含有的重組DNA分子中有期望重組子（含有目的基因的重組子）和非期望重組子（不含有目的基因的重組子）。本實(shí)驗(yàn)中采用的方法是平板篩選法（互補(bǔ)篩選原理）、電泳篩選法進(jìn)行初步鑒定，進(jìn)一步將采用PCR檢測(cè)以及酶切驗(yàn)證進(jìn)行較為準(zhǔn)確的鑒定。利用抗藥性篩選原理可篩選出轉(zhuǎn)化子。質(zhì)粒pUC19攜帶有氨芐青霉素抗性基因（Ampr）,在含有氨芐青霉素平板上篩選轉(zhuǎn)化子，沒有導(dǎo)入質(zhì)粒pUC19的受體細(xì)胞，在含有氨芐青霉素的平板上不生長(zhǎng)。利用互補(bǔ)篩選原理可篩選出轉(zhuǎn)化子中的重組子與非重組子?；パa(bǔ)篩選原理

9、是根據(jù)菌落顏色篩選含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。據(jù)菌落顏色篩選含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，利用-半乳糖苷酶篩選系統(tǒng)來選擇。載體上帶有一個(gè)來自大腸桿菌的lac操縱子的DNA區(qū)段，這一區(qū)段編碼-半乳糖苷酶氨基端的一個(gè)蛋白片段。IPTG(異丙基-D-硫代半乳糖苷)可以誘導(dǎo)該片段的合成，而該片段能與宿主細(xì)胞所編碼的-半乳糖苷酶羧基端的一個(gè)蛋白片段互補(bǔ)(互補(bǔ))。故暴露于誘導(dǎo)物IPTG的細(xì)菌含有編碼lac Z基因的質(zhì)粒可同時(shí)合成該酶的兩種片段，該菌在麥康凱培養(yǎng)基上利用乳糖產(chǎn)酸生成紅色菌落。在外源DNA插人質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，使編碼-半乳糖苷酶氨基端片段的基因失去作用，從而破壞了互補(bǔ)作用，使重組子菌落顯白色。利用這種篩選

10、方法可方便地將含目的基因的重組子篩選出來。 實(shí)驗(yàn)材料1. 菌株： E.coli DH 52. 培養(yǎng)基： LB培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基3. 試劑材料：酶切反應(yīng)：（DNA pUC19 質(zhì)粒，酶切10×buffer，Hind ,重蒸水， DNA。）連接反應(yīng)：（酶切后的DNA（pUC19 質(zhì)粒和 DNA），連接10×buffer，T4 連接酶，重蒸水。）感受態(tài)細(xì)胞的制備：（0.1M CaCl2 ）轉(zhuǎn)化：（連接液和感受態(tài)細(xì)胞，0.1M CaCl2，冰塊。）瓊脂糖電泳：瓊脂糖，TAE緩沖液（50×），上樣緩沖液（10×），溴化乙錠（EB）染液。4. 儀器器材：恒溫振蕩培

11、養(yǎng)箱，高速冷凍離心機(jī)，漩渦振蕩器，恒溫水浴鍋，Eppendorf管，微量移液器，培養(yǎng)皿，三角瓶，酒精燈，量筒，接種環(huán)，涂布器，電子天平，微波爐，電泳儀，制膠槽，電泳槽，凝膠成像檢測(cè)儀，瓊脂糖凝膠梳子，手套。實(shí)驗(yàn)步驟（一）載體與外源片段限制性酶切反應(yīng)1.在1.5ml的Eppendorf管中依次加入酶切反應(yīng)的各種成分：表1 pUC19質(zhì)粒及DNA酶切反應(yīng)體系 試劑（用量單位：µl）pUC19(載體)DNA（目的基因）pUC19（商品）重蒸水13.066.037.510×buffer2.010.05.0DNA3.515.05.0Hind(1.5U/µl)1.59.02.

12、5總計(jì)20.0100.050.0體系混勻后，1000rpm離心1min，37水浴2小時(shí)2.電泳檢測(cè)：10.0µl樣品+2.0µl loading buffer ，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果。（二）載體與外源片段連接反應(yīng)1.在1.5ml的Eppendorf管中依次加入連接反應(yīng)的各種成分：表2 連接反應(yīng)體系編號(hào) 試劑 體積/µl1ddH2O 3.22 10×Ligase Buffer 1.03pUC19DNA/Hind1.2（1.0-1.5）4DNA/Hind 3.8（3.5-4.4）5T4-DNA連接酶 0.8 總計(jì)連接體系10.0 適當(dāng)離心，16水浴12

13、-16小時(shí)備注pUC19/Hind先60水浴10min，打開自連接，也可使酶Hind失活，然后冰浴，再配置連接體系（三）感受態(tài)細(xì)胞的制備 1. 甘油管E.coli DH5（APS)接LB平板（過夜）37，12-16小時(shí)接單菌落于LB平板37，過夜劃線于AP平板37，過夜不生長(zhǎng)。2. LB平板上挑單菌落至20ml LB培養(yǎng)基37 250rpm 過夜取1%轉(zhuǎn)至新20ml LB培養(yǎng)基37 180rpm 2-3小時(shí)冰浴10min收集菌體于兩EP管菌體離心4000rpm 5min棄上清再次補(bǔ)加菌液離心4000rpm 5min棄上清渦旋細(xì)胞3. 加800µlCaCl2 (0.1M)顛倒混勻400

14、0rpm離心5min棄上清加100µlCaCl2 輕懸細(xì)胞（慢慢敲打）冰浴20min最終得到2管100µl感受態(tài)細(xì)胞（四）質(zhì)粒轉(zhuǎn)化1. 將上述制備好的感受態(tài)細(xì)胞分為三管，分別為50µl,50µl,100µl，對(duì)三管分別進(jìn)行一下處理：受體菌對(duì)照組：50µl感受態(tài)細(xì)胞pUC質(zhì)粒對(duì)照組：50µl感受態(tài)細(xì)胞 + pUC19質(zhì)粒DNA 1.0µl重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化組：100µl感受態(tài)細(xì)胞 + 重組質(zhì)粒5.0µl2. 用槍尖緩慢吹打混勻，三管均于冰上放置10min，在42水浴中熱擊90s，然后迅速置于冰上， 質(zhì)粒

15、已經(jīng)吸附到感受態(tài)細(xì)胞的表面，此時(shí)不能劇烈振蕩，以增加轉(zhuǎn)化效率； 3.向上述3管中分別加入450µl(50µl管）和900µl（100µl管）新鮮的LB培養(yǎng)基，混勻后，37搖床培養(yǎng)1h，使受體菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)。 （五）稀釋和涂布平板及重組質(zhì)粒的初步篩選（AP+抗性篩選與互補(bǔ)篩選法） 1.無菌操作，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞溶液按以下操作涂布平板： 受體菌對(duì)照組：取50µl受體菌液分別涂布AP+和AP-的麥康凱培養(yǎng)基，各1個(gè)。pUC19質(zhì)粒對(duì)照組：取50µl培養(yǎng)液涂布于AP+的麥康凱培養(yǎng)基。 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化組：取50µl、100µl、

16、150µl培養(yǎng)液分別涂布AP+的麥康凱培養(yǎng)基（各3、4、3個(gè)）。2. 當(dāng)菌液完全被培養(yǎng)基吸收后（大約10min）倒置培養(yǎng)皿，于37恒溫培養(yǎng)2436h，觀察菌落生長(zhǎng)情況。 （六）重組子的挑取與復(fù)證 1.取一個(gè)含有氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基平板，在底部劃線分成6個(gè)區(qū)域，并分別編號(hào)； 2.在涂有重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化組的平板上分別選取6個(gè)單個(gè)的白色轉(zhuǎn)化子，用牙簽挑取單菌落點(diǎn)接到平分成6份的含有氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基平板上，37過夜培養(yǎng)。同時(shí)，在點(diǎn)接6個(gè)單菌落時(shí)隨機(jī)選取4個(gè)，分別接種到含有5ml帶氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基的試管中，37振蕩培養(yǎng)過夜。3.觀察培養(yǎng)后的平板，看菌落是否均為白色。從4支試管

17、中，選擇平板上白色菌落所對(duì)應(yīng)的任意兩試管，分別取3ml菌液，用Omega試劑盒抽提重組質(zhì)粒DNA，具體步驟見說明書； 4.電泳檢測(cè)：2.0µl重組質(zhì)粒 + 1.5µl loading buffer + 1.5µl重蒸水，混合均勻，點(diǎn)樣。注意事項(xiàng)Ø 本實(shí)驗(yàn)屬于微量操作，用量極少的步驟必須嚴(yán)格注意吸取量的準(zhǔn)確性并確保樣品全部加入反應(yīng)體系中。Ø 實(shí)驗(yàn)中所用塑料器材都必須是新的，并且經(jīng)過高溫滅菌，操作時(shí)打開使用，操作過程中要注意環(huán)境干凈，戴手套操作，盡量減少走動(dòng)，縮短Ep管開蓋的時(shí)間。Ø 不論是酶切還是連接反應(yīng)，加樣的順序應(yīng)該是：先加雙蒸水，

18、其次是緩沖液和DNA，最后加酶。且前幾步要把樣品加到管底的側(cè)壁上，加完后可適當(dāng)離心將其甩到管底，而酶液要在加入前從-20的冰箱取出，酶管放置冰上，取酶液時(shí)吸頭應(yīng)從表面吸取，防止由于插入過深而使吸頭外壁沾染過多的酶液。取出的酶液應(yīng)立即加入反應(yīng)混合液的液面以下，并充分混勻。Ø Ep管的蓋子應(yīng)蓋緊，防止水浴過程中水汽進(jìn)入管內(nèi)，并做好標(biāo)記以防樣品混淆。Ø 制備凝膠時(shí)，應(yīng)避免瓊脂糖溶液在微波爐里加熱時(shí)間過長(zhǎng)，否則溶液將會(huì)暴沸蒸發(fā)，影響瓊脂糖濃度。制膠前需要把制膠槽擦拭干凈，倒膠時(shí)要迅速并避免氣泡產(chǎn)生。Ø 上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞康哪z刺穿。也不要快速擠出

19、吸頭內(nèi)的樣品，避免擠出的空氣將樣品沖出樣品孔。Ø 溴化乙錠是一種強(qiáng)烈的誘變劑，有毒性，使用含有這種染料的溶液時(shí)，應(yīng)帶上乳膠手套進(jìn)行操作。勿將溶液滴灑在臺(tái)面上，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用水徹底沖洗干凈。Ø 實(shí)驗(yàn)中加樣后應(yīng)及時(shí)更換槍頭，以避免試劑的污染。Ø PCR反應(yīng)高度靈敏，應(yīng)設(shè)法避免污染，如戴一次性手套操作，使用一次性PCR管和吸頭，反應(yīng)加樣區(qū)應(yīng)與DNA模板制備區(qū)及PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)區(qū)分開。Ø PCR管單加樣時(shí)，對(duì)于非常微量的樣品一定將樣品加在管壁上或者液體中，防止漏樣。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析（一）載體與外源片段限制性酶切反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 表3：電泳中從左至右點(diǎn)樣順序表泳道12

20、3456781617樣品/Hind(Marker)DNA/HindpUC19pUC19/HindJD-1JD-2JD-3pUC19/Hind/Hind樣量（µl）10.010.010.010.0 圖1：酶切電泳圖第1泳道是標(biāo)準(zhǔn)DNA酶切產(chǎn)物的條帶，第2泳道為未酶切的DNA的條帶，第3泳道和第17泳道是自己的DNA經(jīng)HindIII酶切后的產(chǎn)物的條帶，第4泳道是未酶切的pUC19質(zhì)粒，第5泳道為商品pUC19經(jīng)HindIII酶切產(chǎn)物的條帶，第16泳道為之前的實(shí)驗(yàn)中pUC19酶切產(chǎn)物的條帶，其余泳道均為各小組堿變性法提取的pUC19質(zhì)粒經(jīng)HindIII酶切后的產(chǎn)物的條帶。第9泳道為我們小組

21、提取的pUC19質(zhì)粒經(jīng)HindIII酶切產(chǎn)物的條帶，從圖中可以看出：自下而上有兩條主帶，分別為超螺旋的pUC19質(zhì)粒（與第4泳道最亮的條帶平齊，處于marker中2027bp線性條帶所對(duì)應(yīng)位置偏下），以及被HindIII切開的線性pUC19質(zhì)粒（與第5泳道最亮的條帶平齊，處于marker中2322bp與4361bp線性條帶所對(duì)應(yīng)位置之間）。兩條主條帶相比，被HindIII切開的線性pUC19質(zhì)粒對(duì)應(yīng)的條帶的亮度不及超螺旋的、未被HindIII切開的條帶亮度的2/3,可以看出酶切并不徹底，仍有大量未被切開的質(zhì)粒存在，可能是由于酚抽提過程中未除盡，降低了限制性核酸內(nèi)切酶HindIII的活性。為了保

22、證連接步驟的順利進(jìn)行，我們選用商品pUC19被HindIII酶切后的片段作為載體（第5泳道對(duì)應(yīng)片段，幾乎全部為線性DNA片段），進(jìn)行下一步的連接反應(yīng)。在兩條主條帶之上，隱約可以看到一條微弱的條帶，為開環(huán)質(zhì)?；驈?fù)制中間體。點(diǎn)樣口中為酶切時(shí)加入的酶以及質(zhì)粒提純過程中未除盡的蛋白質(zhì)，經(jīng)EB插入在紫外燈下也會(huì)有熒光。（二）重組子篩選結(jié)果表4：轉(zhuǎn)化后各平板的菌落狀況分析表編號(hào)平板現(xiàn)象結(jié)果分析受體菌對(duì)照組50L麥?zhǔn)螦p-培養(yǎng)基呈橘紅色，菌落均呈白色，鋪滿平板表面感受態(tài)細(xì)胞對(duì)氨芐青霉素敏感，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明感受態(tài)細(xì)胞有活性，且未摻雜對(duì)氨芐有抗性的雜菌，可正常使用。麥?zhǔn)螦p+培養(yǎng)基呈紅色，無菌落生長(zhǎng)pUC19質(zhì)粒

23、對(duì)照組50L麥?zhǔn)螦p+ 培養(yǎng)基呈紅色，單菌落為紅色轉(zhuǎn)入pUC19的受體細(xì)胞具有氨芐抗性，且由于互補(bǔ)作用的存在，具有-半乳糖苷酶活性，可分解乳糖產(chǎn)酸，使麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基中指示劑顯紅色，故單菌落呈紅色。用于與實(shí)驗(yàn)組中菌落顏色對(duì)比。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化組50L×3麥?zhǔn)螦p+培養(yǎng)基呈紅色，既有白色單菌落又有紅色單菌落。接種用量越多，單菌落數(shù)量越多。平板上生長(zhǎng)的菌落全部為轉(zhuǎn)化子，具有氨芐抗性。其中非重組子，能利用乳糖，菌落為紅色，與pUC19質(zhì)粒對(duì)照組一致；重組子不能利用乳糖，只能利用蛋白胨產(chǎn)生堿性物質(zhì)，菌落為白色。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化組100L×4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化組150L×3（三）單菌落平板結(jié)果 挑取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化組平板中的白色單菌落進(jìn)行復(fù)證時(shí)，在單菌落平板中發(fā)現(xiàn)15號(hào)菌落為白色，6號(hào)菌落為紅色。說明在挑取單菌落對(duì)6號(hào)點(diǎn)菌的時(shí)候，挑取到了平板上的紅色菌落，用6號(hào)菌培養(yǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)液應(yīng)為非重組子培養(yǎng)液，只能提取出空載體