HPLC實驗步驟和方法開發(fā)

1、碳水化合物類脂化合物、甘油三酸酯、膽固醇脂肪酸和有機酸蛋白、肽、氨基酸酸味劑、甜味劑、香精、乳化劑抗氧化劑、防腐劑顏料和染料（色素維生素霉菌（黃曲霉毒素農(nóng)藥殘留和獸藥殘留多環(huán)芳烴（PAHS和亞硝酸 在無機離子分析中應用在無機離子分析中應用飲用水、酸雨、土壤中陰離子和陽離子分析飲用水、酸雨、土壤中陰離子和陽離子分析 Adapted from: Snyder, L.R.; Kirkland, J.J.; Glajch, J.L; Practical HPLC Method Development 2nd Ed., Wiley-Interscience, New York, 1997, p. 26:

2、1NS通用檢測器通用檢測器 RI ELSDMS靈敏度ugngpg線性范圍104否103流速敏感是否是溫度敏感是否否破壞性否是是選擇性檢測器選擇性檢測器 ABSFLEC Cond MS靈敏度ngpgfgpgpg線性范圍105103106105103流速敏感否否是是是溫度敏感否否是是是破壞性否否是否是大多數(shù)有機化合物有一定程度的吸光度，可以測大多數(shù)有機化合物有一定程度的吸光度，可以測定大多數(shù)的化合物，是目前實驗室中使用最多的定大多數(shù)的化合物，是目前實驗室中使用最多的檢測器檢測器 -多數(shù)公司售出的檢測器中多數(shù)公司售出的檢測器中75%以上是吸以上是吸光度檢測器（其中光度檢測器（其中50%以上是紫外以上

3、是紫外/可見檢可見檢測器，測器，25%是是PDA）實際濃度濃度理想10吸光度吸光度210光電二極管矩陣檢測器光電二極管矩陣檢測器（ PDA ）的特點和用途）的特點和用途 一種一種三維水平的吸光度檢測器三維水平的吸光度檢測器-采集三維譜圖采集三維譜圖 兼顧紫外檢測器及可見分光光度計的信息兼顧紫外檢測器及可見分光光度計的信息在收集色譜圖的同時，得到光譜圖在收集色譜圖的同時，得到光譜圖 提供許多有用的功能提供許多有用的功能 - -色譜峰的純度鑒定，色譜峰的確認色譜峰的純度鑒定，色譜峰的確認 - -可以發(fā)現(xiàn)單波長檢測時未測到的峰可以發(fā)現(xiàn)單波長檢測時未測到的峰 - -任意波長的色譜再處理任意波長的色譜再

4、處理 - -光譜信息光譜信息- -光譜庫的建立檢索和擬合光譜庫的建立檢索和擬合 氨基甲酸酯類殺蟲劑OOOOOOCH3黃曲霉毒素多環(huán)芳烴（PAH）OHCH3CH3CH3CH3CH3維生素OOONHCH3CH3CH3返回 通過改變流動相的pH值，使樣品成中性 加入“對離子”，使樣品呈中性請記住請記住 每次改變一個參數(shù) 每次改變一個參數(shù) 色譜柱：C18，4.6mm15mm 流動相：乙腈/水，乙腈從100%逐漸降低（或走梯度） 舉例中用不同的溶劑強度，60/40、50/50、40/60，由強漸弱 流速：1ml/min 對羥基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) 對羥基苯甲酸丙酯(Propyl P

5、araben) 對羥基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)60/4050/5040/60譜圖62:38 / 42:58 / 72:28 / 2322OHCNCHOHMeOHOHTHFCHOOHOCH3COONaCHOCOOHOCH31234烷基長度不同，形成對離子的能力不同 抗組胺及減充血劑藥物的分析抗組胺及減充血劑藥物的分析NCONH2NH3CHOCH2OHCH2OHNNNNH3CH3COOCH2CHCHCHHOHOHOCH2OHNNH3CNH2CH2NSCH2CH2OHCH3 Cl-+1. Niacinamide 煙酰胺2. Pyridoxine 吡哆素， VB63. Riboflav

6、in 核黃素， VB24. Thiamine 硫胺素，VB1長度=內徑，L=DL)(DL)(DLoad=進樣量(Load)初始2初始現(xiàn)在2現(xiàn)在初始內徑=D)(D)(DF=流速(F)2初始2現(xiàn)在初始溶劑 A溶劑 B泵 A泵 B混合器A 高壓梯度溶劑 A泵溶劑 B比例閥（溶劑混合點）混合器B 低壓梯度（溶劑混合點）死體積/譜帶展寬體積(無色譜柱時)滯后(系統(tǒng))體積滯后(系統(tǒng))體積溶劑輸送系統(tǒng)(泵)檢測器進樣器色譜柱色譜柱梯度混合器溶劑輸送系統(tǒng)(泵)高壓梯度注意注意 滯后體積包括進樣器、阻尼滯后體積包括進樣器、阻尼 器、混合器及其管路器、混合器及其管路比例閥檢測器進樣器ABCD色譜柱色譜柱溶劑輸送系

7、統(tǒng)(泵)低壓梯度 阻尼器 混合器實際梯度會比設置值晚 2 分鐘響應，沒有問題實際梯度會比設置值晚20 分鐘響應，不能接受梯度百分比保留時間梯度曲線好的梯度滯后曲線保留時間梯度百分比不好的梯度滯后曲線固定滯后體積，改善了梯度性能普通的低壓梯度系統(tǒng)P680A LPG without pulse damperBack-pressure:60 bar, 85 bar and 105 barVariation: 2%Acclaim 120, C18, 5 m, 4.6 x 100 mm; 0.5 mL/min; 25C; 5 L injection volume; UV detection at 256

8、 nm; Eluent (A) Water and (B) Acetonitril; Gradient: 30 % b to 100 % B in 10 min; Methyl-, Ethyl-, Propyl- and Butylparabene, 10 mg/L eachn早流出峰的分離度差.n遲流出峰的峰寬增加而峰高降低.n由于k范圍寬，所以分析時間長.n強保留組分造成柱污染.等梯度洗脫等梯度洗脫 - 在洗脫樣品的整個過程中，流動相的組成保持不變.優(yōu)點優(yōu)點 改善分離度 提高檢測性能 能夠分離復雜樣品 縮短分析時間 降低由于強保留組分而使色譜 柱性能變差的可能性其他應用其他應用 柱清洗 方

9、法開發(fā)中的嘗試運行 梯度洗脫梯度洗脫 - 在分離過程中改變流動相組成.% Org02550751000102030Time (min)k增加有機改性劑的含量增加有機改性劑的含量分配轉移到流動相分配轉移到流動相增加化合物的流速增加化合物的流速5%有機相100%有機相從嘗試運行開始 - 一個平緩的梯度您必須確定: 有機溶劑 初始組成 梯度時間 梯度陡度 梯度形狀 流速 柱長 柱重新平衡時間010203040min.100% B100% B0% B0% BtG = 40tG = 20100% B100% B0% B0% BtG = 10tG = 5010陡陡平緩平緩%Btime線性步進凹形凸形線性梯

10、度線性梯度線性梯度選凹形梯度曲線選凹形梯度曲線用步進梯度或流速梯度用步進梯度或流速梯度選凸形梯度曲線選凸形梯度曲線10分鐘的梯度，6分鐘的平衡時間色譜圖不重復平衡時間6分鐘平衡時間7分鐘平衡時間8分鐘平衡時間9分鐘 平衡時間從6到7分鐘，第一個峰的保留時間有明顯的變化，說明6到7分鐘的平衡時間不足，而8到9分鐘變化不大因而大于這個時間時，平衡充足。02468101214Time (min)5%/min1 ml/min- 5%/ml5%/min2.5 ml/min- 2%/ml011 01 0 001 02 03 04 05 0% O r gk0102030time (min)遷移距離10 cm開始25 cm保留時間 (min)柱長化合物 A化合物 B10 cm14.215.325 cm18.217.9 k 和有機改性劑百分含量之間的關系和有機改性劑百分含量之間的關系 - 等梯度條件等梯度條件(n.b. k 為對數(shù)坐標為對數(shù)坐標)梯度洗脫過程中的遷移梯度洗脫過程中的遷移Ghost Peaks0% MeOH100