對天然多糖的抗氧化活性研究

1、學(xué)院代號 10716 學(xué)號110050801108 專業(yè)代碼 081302 密級 公開 陜 西 中 醫(yī) 學(xué) 院Shaanxi University of Chinese Medicine學(xué)士學(xué)位論文對天然多糖的抗氧化活性研究學(xué) 位 申 請 人曹 柯專 業(yè) 名 稱制藥工程申請學(xué)位類型工學(xué)學(xué)士學(xué)位指導(dǎo)教師姓名王露老師論文提交日期2013年6月對天然多糖的抗氧化活性研究姓名：曹柯 指導(dǎo)老師：王露老師【摘 要】： 多糖是一大類廣泛存在于動(dòng)植物和微生物體內(nèi)的生物高分子物質(zhì)，許多天然多糖具有增強(qiáng)免疫、抗氧化、降血糖、抗病毒等生物活性，天然多糖還具有毒 副作用小、療效好等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)在多糖已成為天然藥物及保健品

2、研發(fā)中的重要組成部分。本文從實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)方法等方面對天然多糖抗氧化活性的常見評價(jià)方法進(jìn)行綜述，詳細(xì)介紹了化學(xué)分析法中的自由基（ABTS自由基陽離子、DPPH自由基、超氧自由基、羥自由基）清除實(shí)驗(yàn)、脂質(zhì)過氧化抑制實(shí)驗(yàn)等評價(jià)方法；描述了以生物細(xì)胞為模型的CAA抗氧評價(jià)方法；概述了在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行的抗氧化活性評價(jià)方法及指標(biāo)，為相關(guān)領(lǐng)域中抗氧化天然多糖的研究和開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】：天然多糖； 抗氧化活性； 評價(jià)方法；The antioxidant activity of natural polysaccharide researchName: Cao Ke Teacher:Wang Lu【

3、 abstract 】 : Polysaccharide is a broad categories in a wide variety of plants and microorganisms in vivo biological macromolecule material, many natural polysaccharides have enhanced immune, antioxidant, fall blood sugar, anti-viral biological activity, such as natural polysaccharide has poison The

4、 advantages of small side effects, good curative effect, polysaccharide has now become an important part of natural medicines and health products research and development.This article from the experiment principle and experiment method of natural polysaccharide antioxidant activity of the common eva

5、luation methods were reviewed, detailed introduces the chemical analysis of free radicals (ABTS radical cation, DPPH free radical, superoxide free radical, hydroxyl free radicals) removal experiment, lipid peroxidation inhibition experiment evaluation methods, such as;Describes the biological cells

6、as the model of CAA antioxidant evaluation method;Outlined in animals on antioxidant activity evaluation methods and indicators, for oxidation of natural polysaccharides in related areas to provide theoretical basis for research and development.【 key words 】: Natural polysaccharides；antioxidant acti

7、vity；evaluation methodology 1.天然多糖的抗氧化活性許多天然多糖對各種活性氧( Reactive oxygen species，ROS )具有清除作用，能減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的生成量，提高抗氧化酶活性(超氧化物歧化酶 SOD、谷胱甘肽過氧化物酶GSHPx等)，表現(xiàn)出多種途經(jīng)的抗氧化作用多糖具有廣泛的生物活性，而抗氧化作用是一些多糖抗衰老、抑腫瘤、降血脂、降血糖的作用機(jī)制之一1，近年來國內(nèi)外已將抗氧化檢測用于抗衰老等保健食品的評價(jià)2，3研究表明，多糖具有清除ROS的抗氧化作用，其可能的作用機(jī)理包括：多糖可以通過捕捉脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中產(chǎn)生的ROS，從而減

8、少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)鏈長度、阻斷或減緩脂質(zhì)過氧化的進(jìn)行，達(dá)到對ROS的直接清除作用；通過與產(chǎn)生ROS所必需的金屬離子發(fā)生絡(luò)合作用，對ROS起間接清除作用多糖環(huán)上的OH可與產(chǎn)生OH等所必需的金屬離子(如Fe2+、Cu2+ 等)絡(luò)合，使其不能產(chǎn)生啟動(dòng)脂質(zhì)過氧化的OH或使其不能分解脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的脂過氧化物，從而抑制ROS的產(chǎn)生；多糖可通過提高SOD、GSHPx等抗氧化酶的活性，從而發(fā)揮抗氧化的作用2.國內(nèi)外研究開發(fā)現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢2.1國內(nèi)外研究狀況多糖作為藥物進(jìn)行研究始于上個(gè)世紀(jì)40年代，50年代對真菌多糖抗癌效果的發(fā)現(xiàn)使人們開始了多糖的系列化研究。許多研究表明多糖與免疫功能的調(diào)節(jié)、細(xì)胞與細(xì)胞的識別、

9、細(xì)胞間物質(zhì)的運(yùn)輸、癌癥的診斷與治療等有著密切的關(guān)系，具有能量儲存、結(jié)構(gòu)支持、防御功能和抗原決定性等多方面的生物功能。最近又提出了細(xì)胞表面糖分子參與細(xì)胞一細(xì)胞特異性識別的假說，發(fā)現(xiàn)多糖能控制細(xì)胞的分裂和分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和衰老，其糖鏈在分子生物學(xué)中具有決定性作用。由于組成多糖的單糖基種類繁多(目前已知的單糖有200多種)，而且糖基可在多個(gè)羥基上以兩種可能的鍵型相互連接(氨基酸和核苷酸只有一種連接方式)，因此它能以最小的結(jié)構(gòu)單元承載最大的生物信息量。此外，多糖在食品工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)、石油工業(yè)上也有著廣泛的應(yīng)用。所以近年來多糖成為天然藥物研究的一個(gè)熱點(diǎn)，在開展多糖資源的開發(fā)、多糖結(jié)構(gòu)的分析、多糖藥理

10、作用的研究等方面，人們做了大量的工作。發(fā)達(dá)國家對多糖生物學(xué)的研究也都給予高度的重視?，F(xiàn)在多糖已成為天然藥物及保健品研發(fā)中的重要組成部分，當(dāng)今世界排名前十大制藥公司中的九大公司都有糖類藥物研發(fā)。根據(jù)Thomson Pharma數(shù)據(jù)庫目前基于糖的上市藥物世界上至少有21種，現(xiàn)注冊正在進(jìn)行臨床前和臨床研發(fā)的聚糖（寡糖和多糖）類藥物有137種，分布在63個(gè)國家和地區(qū)。我國十分重視糖類藥物的開發(fā)，國家科技部亦把“糖生物學(xué)與重大疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究”列入了未來十年對生物經(jīng)濟(jì)引領(lǐng)作用的重大生命科學(xué)的應(yīng)用基礎(chǔ)研究課題題目。我國近年來對大量植物來源的多糖，如黃芪多糖、牛膝多糖、豬苓多糖等進(jìn)行了研究，相繼報(bào)道了

11、這些多糖及糖綴合物具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖等多方面的藥理作用，有的已在臨床應(yīng)用，為創(chuàng)制新藥邁出了堅(jiān)實(shí)的一步。但從總體上來說由于我國中醫(yī)藥現(xiàn)代化、國際化水平不高，目前仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于發(fā)達(dá)國家對多糖產(chǎn)品的研究開發(fā)水平。2.2項(xiàng)目背景和重要意義2.2.1 項(xiàng)目背景近年來，高等植物、藻類及真菌等來源的多糖已成為天然活性產(chǎn)物的一個(gè)重要類型，已發(fā)現(xiàn)多種多糖具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗凝血、降血糖和抗病毒等活性。在研究多糖的生物活性過程中發(fā)現(xiàn)，多糖的抗氧化性與多糖的抗腫瘤、抗衰老、抗感染、抗輻射等活性作用密切相關(guān)。由于多糖來源廣且細(xì)胞毒性較低，毒副作用小，因此對植物多糖的抗氧化活性研究已成為醫(yī)藥界的熱門領(lǐng)域。2

12、.2.2 重要意義天然多糖按照來源主要分為微生物多糖(真菌與細(xì)菌多糖)、動(dòng)物多糖和植物多糖，其中的植物多糖包括低等植物多糖(藻類為主)和高等植物多糖據(jù)報(bào)道，現(xiàn)已從天然產(chǎn)物中分離出300多種多糖類化合物，包括近100種植物多糖由于植物多糖來源廣泛，應(yīng)用于生物體的毒副作用小，對植物多糖的抗氧化活性研究已成為食品、醫(yī)藥、保健領(lǐng)域的熱門課題1，4，5，6。在天然多糖抗氧化劑的研究中，通過抗氧化活性評價(jià)，篩選出有益人體健康的化合物，是經(jīng)典的研究思路7。整個(gè)研究中，對天然多糖抗氧化活性的評價(jià)是核心和基礎(chǔ)，對后續(xù)研究有重要的指導(dǎo)意義。不同評價(jià)方法的實(shí)驗(yàn)原理、適用范圍各不相同，所得結(jié)果也有差異。要準(zhǔn)確全面地考

13、察天然多糖的抗氧化活性，需同時(shí)采用多種評價(jià)方法。本文對天然多糖抗氧化活性常見評價(jià)方法的原理、體系及優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行歸納總結(jié)，以期為相關(guān)領(lǐng)域的研究人員進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)測試提供參考。3. 體外抗氧化活性化學(xué)評價(jià)方法3.1自由基清除方法自由基具有極強(qiáng)的氧化反應(yīng)能力，能通過氧化作用來攻擊其所遇到的任何分子，使機(jī)體內(nèi)的大分子物質(zhì)產(chǎn)生過氧化反應(yīng)，從而引起機(jī)體不可逆損傷8，因此評價(jià)天然多糖成分的清除自由基能力是評價(jià)其抗氧化活性的一個(gè)重要方面。31.1DPPH清除自由基法實(shí)驗(yàn)原理：DPPH（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）4是一種在氮氮連接鍵上含有不

14、對稱價(jià)電子的氮族自由基，它能穩(wěn)定存在，于517 nm處有最大吸收值，易與具有氫鍵供體的化合物發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)9。DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)中，受試物給出的氫原子與DPPH自由基結(jié)合，使反應(yīng)溶液的吸光度發(fā)生變化，通過比較實(shí)驗(yàn)組與空白組溶液吸光度的變化評價(jià)受試物的抗氧化活性10。此方法最早由Blois提出11，后經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)改進(jìn)，已成為評價(jià)天然多糖抗氧化成分抗氧化活性的一種常用評價(jià)方法12。但是DPPH方法能與任何提供電子的化合物進(jìn)行反應(yīng)，所以，該方法并不能全面評價(jià)抗氧化能力。實(shí)驗(yàn)方法：以95%的乙醇為溶劑配制濃度為0.1mmol/L的DPPH自由基溶液，此溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用。取2.0 mL不同濃度的受試物

15、溶液同2.0mLDPPH溶液混合，25避光孵育30 min，于517 nm處測定反應(yīng)溶液的吸光度，95%乙醇做空白對照13。計(jì)算方法如式：2.1.2. ABTS自由基陽離子清除法實(shí)驗(yàn)原理：ABTS2,2'-azinobis-3-ethylbenzthiazoline-6- sulphonate，2,2'-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽自由基陽離子清除實(shí)驗(yàn)是根據(jù)不同濃度受試物對ABTS自由基陽離子溶液吸光度的影響測定中草藥成分對ABTS自由基陽離子的清除能力，該方法最早由Miller提出14，經(jīng)Re等15改進(jìn)后被廣泛用于中草藥抗氧化成分抗氧化活性的測試。在Trol

16、ox（維生素E的水溶性類似物）被當(dāng)作標(biāo)準(zhǔn)物用于實(shí)驗(yàn)測試時(shí)，此方法又稱為TEAC（trolox equivalent antioxidant capacity）法14，實(shí)驗(yàn)中，ABTS在氧化劑的過氧化作用下形成一種亞穩(wěn)態(tài)的自由基陽離子，該物質(zhì)易溶于水和酸性乙醇溶液，于415 nm、660 nm、734 nm、820 nm波長處均吸收。在抗氧化物質(zhì)的作用下，ABTS自由基陽離子被部分清除溶液吸光度降低通過與空白組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較，得到受試物對ABTS自由基陽離子的清除效果。自由基抗氧化活性評價(jià)方法簡便實(shí)用應(yīng)用廣泛，但其還存在一些問題，因?yàn)榭寡趸芰Φ牟煌磻?yīng)時(shí)所用到的抗氧化物質(zhì)合適濃度難以確定，因

17、為TEAC值并不能代表所測樣品真正的抗氧化能力。實(shí)驗(yàn)方法：用純水配制含ABTS（7 mmol/L）與過硫酸鉀（2.45 mmol/L）的混合溶液，置于23的暗處孵育1216h，制備ABTS自由基陽離子基液。用純水稀釋基液至其在波長734 nm處吸光度為0.700±0.005，得ABTS自由基陽離子工作液。取0.1mL不同濃度受試物溶液同3.9 mL工作液混合，23孵育6min，測量反應(yīng)混合物在734nm處的吸光度，純水做空白對照16。計(jì)算方法如式：2.1.3.超氧陰離子自由基清除法實(shí)驗(yàn)原理：超氧陰離子（O2-）是需氧細(xì)胞線粒體內(nèi)電子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的一種自由基17。由氧分子接收一個(gè)電子形成，

18、同生物體內(nèi)其它活性氧自由基的產(chǎn)生有密切聯(lián)系18。超氧陰離子在生物體內(nèi)可長時(shí)間攻擊靶向目標(biāo)，對細(xì)胞有較強(qiáng)的氧化毒性，與人體的衰老及癌癥等疾病的發(fā)生有關(guān)19。許多實(shí)驗(yàn)體系均可用于模擬細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子自由基的產(chǎn)生及清除，其中鄰苯三酚法使用最為普遍。鄰苯三酚在堿性環(huán)境中發(fā)生自氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)并釋放出大量的超氧陰離子，超氧陰離子又進(jìn)一步加速鄰苯三酚的氧化，生成一系列在可見光區(qū)有特征吸收的中間產(chǎn)物。在反應(yīng)體系中加入抗氧化物質(zhì)可降低鄰苯三酚的自氧化速率，清除產(chǎn)生的超氧陰離子，抑制中間產(chǎn)物的生成，使反應(yīng)溶液的吸光度減小。通過比較實(shí)驗(yàn)組與空白組鄰苯三酚的自氧化速率評價(jià)受試物的抗氧化能力20。該方法測定時(shí)間短、靈敏度

19、高（受試物的實(shí)驗(yàn)濃度一般是微克），能較好地模擬超氧陰離子在細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn)生及清除過程。然而，實(shí)驗(yàn)體系生成的超氧陰離子不穩(wěn)定，會進(jìn)一步氧化，易受雜質(zhì)影響，實(shí)驗(yàn)中需嚴(yán)格控制測定時(shí)間。實(shí)驗(yàn)方法：鄰苯三酚自氧化速率的測定。Tris-HCl緩沖液（50mmol/L，pH值8.2，4.5mL）與 純 水（4.2mL）混合，25 孵育20min，快 速 加 入0.3mL鄰苯三酚溶液（3mmol/L，用10mmol/L鹽酸配制，經(jīng)25預(yù)熱），混勻后記錄5 min內(nèi)反應(yīng)溶液在320 nm處的吸光度變化，繪制時(shí)間（t）-吸光度（A）曲線，在線性范圍內(nèi)計(jì)算反應(yīng)物單位時(shí)間內(nèi)吸光度的改變，得出鄰苯三酚的自氧化速率。受試物作

20、用下鄰苯三酚自氧化速率的測定：Tris-HCl緩沖液（50mmol/L，pH值8.2，4.5mL）與純水（3.3mL）混合，25 孵育20 min，快速加入0.9 mL 受試物及0.3mL 鄰苯三酚溶液（3mmol/L，用10mmol/L鹽酸配制，經(jīng)25預(yù)熱），混勻后記錄5min內(nèi)反應(yīng)溶液在320nm處的吸光度變化，繪制時(shí)間（t）-吸光度（A）曲線，在線性范圍內(nèi)計(jì)算反應(yīng)物單位時(shí)間內(nèi)吸光度的改變，得出受試物作用下鄰苯三酚的自氧化速率21。計(jì)算方法如式：式中，V0自氧化速率；V1為受試物作用下鄰苯三酚的自氧化速率。2.1.4.羥自由基清除法實(shí)驗(yàn)原理：羥自由基（OH-）是生物細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)活性最強(qiáng)的氧族

21、自由基，可由超氧陰離子和過氧化氫在金屬離子的作用下產(chǎn)生22。它具有很高的電子還（2310 mV），能與生物體內(nèi)所有的物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，如脂類、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等，對生物大分子產(chǎn)生最強(qiáng)的氧化破壞效應(yīng)，引起細(xì)胞與組織的氧化損傷，導(dǎo)致器官的病變與機(jī)體的衰老23-25。對羥自由基清除能力的測定是評價(jià)天然植物多糖抗氧化成分抗氧化活性的重要組成部分。通常采用水楊酸競爭捕捉羥自由基的方式進(jìn)行測定。實(shí)驗(yàn)體系中，過氧化氫在亞鐵離子作用下生成羥自由基，向體系中加入水楊酸捕捉羥自由基，同時(shí)產(chǎn)生在可見光區(qū)有特征吸收的紫色產(chǎn)物。在反應(yīng)體系中加入抗氧化物質(zhì)，與水楊酸競爭捕捉羥自由基，使生成的紫色產(chǎn)物減少，溶液的吸光度發(fā)生改

22、變。通過比較實(shí)驗(yàn)組與空白組反應(yīng)溶液吸光度的變化評價(jià)受試物的抗氧化活性26。該實(shí)驗(yàn)方法步驟簡單、靈敏度高、重現(xiàn)性好，能清楚地模擬生物細(xì)胞內(nèi)羥自由基的清除過程，常用于醫(yī)學(xué)及分子生物學(xué)領(lǐng)域抗氧化物質(zhì)的篩選。但實(shí)驗(yàn)體系對受試物的濃度及pH值有較高要求，一般適用于酸性或中性物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)方法：1mL受試物溶液與1mL硫酸亞鐵溶液（FeSO47H2O，9 mmol/L）、1mL過氧化氫溶液（10 mmol/L）混勻，37孵育10min，加入1 mL水楊酸溶液（9mmol/L），混勻后37 孵育30 min，于510 nm處測定反應(yīng)溶液的吸光度，純水做空白對照27。計(jì)算方法如式： 2.1.5 脂質(zhì)過氧化抑制法實(shí)

23、驗(yàn)原理：脂質(zhì)過氧化主要是指多不飽和脂肪酸在富氧環(huán)境中發(fā)生的一種氧化變質(zhì)，是一類自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，既產(chǎn)生自由基，又需要自由基進(jìn)一步推動(dòng)反應(yīng)28。脂質(zhì)過氧化會在生物體內(nèi)產(chǎn)生大量的有毒物質(zhì)，如活性氧、氫過氧化物及丙二醛等，引起細(xì)胞膜功能障礙、生物酶活性降低、細(xì)胞成分降解，導(dǎo)致細(xì)胞的氧化損傷與人體的動(dòng)脈粥樣硬化、高血糖、高血脂、高血壓等心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)29-32。在體外，通常采用硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid，TBA法檢測抗氧化物質(zhì)對脂質(zhì)過氧化的抑制效果。該實(shí)驗(yàn)方法利用脂質(zhì)源在亞鐵離子的作用下氧化分解產(chǎn)生丙二醛及其類似物，在高溫和酸性條件下，與硫代巴比妥酸反應(yīng)生

24、成粉紅色產(chǎn)物，該物質(zhì)在可見光區(qū)有特征吸收。向反應(yīng)體系中加入抗氧化物質(zhì)，抑制脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，粉紅色產(chǎn)物生成量減小，反應(yīng)溶液吸光度發(fā)改變。通過比較空白組與實(shí)驗(yàn)組的吸光度變化評價(jià)受試物的抗氧化活性33。該方法步驟較多，操作繁瑣，實(shí)驗(yàn)體系中除包含磷脂外，還含有脂蛋白、脂肪酸等成分。此外，金屬離子的濃度對測定結(jié)果有一定影響，在比較不同實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)應(yīng)注意實(shí)驗(yàn)體系的差別。實(shí)驗(yàn)方法：使用雞蛋黃勻漿液（10%，體積分?jǐn)?shù)）作為反應(yīng)的脂質(zhì)媒介。取0.1 mL受試物溶液同0.5 mL 蛋黃勻漿液、0.4 mL 純水及50 L硫酸亞鐵溶液（FeSO47H2O，70 mmol/L）混合，37 孵育30 min，迅速加入1

25、.5 mL 乙酸溶液（20%，體積分?jǐn)?shù)，pH值3.5）及1.5 mL 硫代巴比妥酸溶液（0.8%，質(zhì)量濃度，用1.1% 十二烷基硫酸鈉溶液配制），高速混勻后95 水浴60 min。待反應(yīng)混合物冷卻至室溫，加入5 mL正丁醇，搖勻，混合物5000 r/min離心15 min，取上清液測定其在532 nm處的吸光度，純水做空白對照34。計(jì)算方法如式：2.2 細(xì)胞抗氧化活性評價(jià)方法以細(xì)胞為基礎(chǔ)的活性篩選模型是藥物化學(xué)中研究藥物分配、吸收及與載體或酶等生物大分子相互作用的有效方法，能夠經(jīng)濟(jì)、快速且準(zhǔn)確地闡明化學(xué)物質(zhì)在生物體內(nèi)的吸收、運(yùn)輸及代謝等現(xiàn)象的機(jī)理35。通過細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)評價(jià)天然多糖抗氧化成分的抗

26、氧化活性（即細(xì)胞抗氧化活性評價(jià)方法，cellular antioxidant activityCAA），比化學(xué)分析法更具生物相關(guān)性，又比動(dòng)物模型和臨床研究更快捷、經(jīng)濟(jì)，是天然多糖抗氧化成分抗氧化活性研究中的一種重要手段36。Eberhardt37-38等較早應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)來測定物質(zhì)的抗細(xì)胞增殖活性，CAA實(shí)驗(yàn)將抗氧化活性的評價(jià)提升到一個(gè)新的水平，是抗氧化研究領(lǐng)域的突破。繼CAA方法建立后，許多研究小組在CAA方法的基礎(chǔ)上建立了其他細(xì)胞模型(如Caco-2、RBC、AGS)的抗氧化活性評價(jià)方法，使細(xì)胞抗氧化方法得到豐富和發(fā)展。但是細(xì)胞抗氧化活性評價(jià)方法必須要與體內(nèi)方法相聯(lián)系，判斷是否與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

27、相一致。實(shí)驗(yàn)原理：細(xì)胞用抗氧化劑混合物(AOx)或天然多糖成分以及本身無熒光的指示劑混合物2,7-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)預(yù)處理，抗氧化劑結(jié)合在細(xì)胞膜上并通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，DCFH-DA穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞酯酶分解DCFH-DA形成極性更強(qiáng)的還原型二氯熒光素 (DCFH)。然后用2,2,-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(ABAP)處理細(xì)胞，ABAP分散在細(xì)胞中并自發(fā)分解形成過氧化自由基ROO*，這些過氧化自由基攻擊細(xì)胞膜產(chǎn)生更多自由基或活性氧(ROS*)。細(xì)胞內(nèi)的DCFH極易被氧自由基或活性氧氧化成熒光物氧化型二氯熒光素 (DCH)，熒光物DCH可通過分光光度法測定?？寡趸瘎┛稍诩?xì)

28、胞膜外部結(jié)合氧自由基而阻止其進(jìn)入細(xì)胞，或者在細(xì)胞膜內(nèi)部與ROS*和ROO*結(jié)合而阻斷DCFH氧化成DCF的過程，從而減少DCF的形成。CAA方法測定抗氧化劑阻止人體HepG-2癌細(xì)胞中ABAP產(chǎn)生的氧自由基導(dǎo)致DFC形成的能力，與對照組相比，細(xì)胞熒光物質(zhì)的減少量就能反映該化合物的抗氧化能力39。實(shí)驗(yàn)方法：實(shí)驗(yàn)細(xì)胞按6×104個(gè)/孔的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37 、5% CO2條件下孵育24 h，除去培養(yǎng)基，用含5%牛胎血清的VE培養(yǎng)基（PBS）洗滌。每孔用100 L含不同濃度受試物與25 mol/L DCFH-DA的混合溶液處理1 h（37 、5% CO2）。用PBS洗滌，除去D

29、CFH-DA。然后用100 L ABAP（600 mol/L）處理，用熒光酶標(biāo)儀于538 nm處測定細(xì)胞培養(yǎng)物的熒光值，間隔5 min測定一次，持續(xù)1 h。對照組用DCFH-DA和ABAP處理，空白組只用DCFH-DA處理。繪制熒光值隨時(shí)間的變化曲線，計(jì)算受試物的CAA值，CAA值越高，抗氧化活性越好40。計(jì)算方法如式：式中，SA為受試物熒光值相對于時(shí)間曲線下的完整面積；CA為空白組熒光值相對于時(shí)間曲線下的完整面積。3.體內(nèi)抗氧化評價(jià)方法抗氧化活性的體外測試是評價(jià)天然多糖抗氧化活性的一個(gè)重要手段，但其測定結(jié)果并不能完全代表抗氧化物質(zhì)在生物體內(nèi)的代謝和利用情況。天然多糖抗氧化成分往往是成分復(fù)雜的

30、混合物，須經(jīng)消化道各種酶降解條件消化后才能被生物體吸收，達(dá)到靶向細(xì)胞發(fā)揮作用。而生物體的消化吸收是一個(gè)極其復(fù)雜的生理過程，體外簡單的化學(xué)分析或細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的測試結(jié)果與天然多糖活性成分進(jìn)入生物體產(chǎn)生作用的實(shí)際情況有很大差別41。因此，需在參考體外抗氧化實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)真實(shí)評價(jià)天然多糖抗氧化成分在生物體內(nèi)的抗氧化活性。實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)以動(dòng)物為模型，對其飼喂受試物，利用生化手段對其各項(xiàng)相關(guān)的生理指標(biāo)進(jìn)行測定，通過實(shí)驗(yàn)組與空白組各項(xiàng)指標(biāo)的比較評價(jià)受試物在生物體內(nèi)的抗氧化活性42。實(shí)驗(yàn)方法：選用清潔級大鼠或小鼠為對象，用受試物按實(shí)驗(yàn)研究計(jì)量及時(shí)間連續(xù)飼喂，完成后處死動(dòng)物，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康娜∑溲夯蚪M

31、織器官，測定其中的丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）及過氧化氫酶（CAT）等指標(biāo)，同空白對照組比較，從而得出受試物在生物體內(nèi)的抗氧化能力43。體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)建立在生理學(xué)、毒理學(xué)及病理學(xué)基礎(chǔ)上，采用生化技術(shù)對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行測試，測定結(jié)果真實(shí)反映了天然多糖抗氧化成分在生物體內(nèi)的抗氧化作用。此外，在檢測受試物抗氧化活性的同時(shí)，也對其生理毒性及藥理作用進(jìn)行了評價(jià)。除采用健康動(dòng)物測試外，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)還多采用人為制造的疾病動(dòng)物為模型，研究天然多糖抗氧化成分對某一靶向疾病或組織的作用。抗氧化活性的體內(nèi)評價(jià)適用于經(jīng)體外篩選后的活性化合物，其檢測指標(biāo)多且復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)周期長，費(fèi)

32、用昂貴，不適用于抗氧化成分的前期篩分及大批量檢測。4. 結(jié)論與展望天然多糖抗氧化成分種類較多，成分復(fù)雜，天然多糖抗氧化成分抗氧化能力的研究仍然是一個(gè)重點(diǎn)，評價(jià)天然多糖成分抗氧化能力應(yīng)該全面體現(xiàn)其抗氧化效果，上述體外、體內(nèi)各種方法都有其優(yōu)勢及其局限性，所以不能僅靠一種方法就確定其抗氧化能力，應(yīng)多種方法相結(jié)合，建立一組完善的評價(jià)體系。總之，理想的抗氧化活性評價(jià)方法應(yīng)具有以下特點(diǎn)：原理明確；操作簡單；可反映物質(zhì)對絕大多數(shù)自由基的抑制或清除能力；生物相關(guān)性良好42。希望因此為天然多糖在藥品、食品、化妝品等各個(gè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供依據(jù)。隨著多糖抗氧化活性研究的深入，特別是隨著多糖體內(nèi)、體外等抗氧化活性方面

33、的深入研究和多糖的臨床應(yīng)用，多糖保健品與多糖藥物的開發(fā)將具有廣闊的前景。參考文獻(xiàn)1 丁保金，金麗琴，呂建新多糖生物活性研究進(jìn)展J中國藥學(xué)雜志，20O4，39(8)：561564.2 張翼伸怎樣研究植物多糖J生命的化學(xué)，1999，19(6): 296297.3 鄭晶泉抗氧化劑抗氧化實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展J國外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊，2000。27(1)：3738.4 馮婷，何聰芬，趙華等植物多糖研究概況J北京工商大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，,2（5）：1-4.5 唐小江，祝壽芬國內(nèi)外對高等植物多糖的研究概況J山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，2 9(1)：9596.6 陳怡天然多糖的研究概況J世界科學(xué)技術(shù)，2000

34、，2(6)：5254.7 Wang B，Deng J，Gao Y，et al. The screening toolbox of bioactive substances from natural products：A reviewJ. Fitoterapia，2011，82（8）：1141-1151.8HarmanD.FreeradicaltheoryofagaingJ.nutritionnalimplications,1978,1(4):145-531.9 Brand Williams W，Cuvelier M E，Berset C. Use of a free radical metho

35、d to evaluate antioxidant activityJ. LWT-Food Science and Technology，1995，28（1）：25-30.10 ButkoviV，Klasinc L，Bors W. Kinetic study of flavonoid reactions with stable radicalsJ. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52（10）：2816-2820.11 Blois M S. Antioxidant determinations by the use of a st

36、able free radicalJ. Nature，1958，181（4617）：1199-1200.12 Sharma O P，Bhat T K. DPPH antioxidant assay revisitedJ. Food Chemistry，2009，113（4）：1202-1205.13 Zeng W C，Zhang Z，Gao H，et al. Characterization of antioxidant polysaccharides from Auricularia auricularusing microwave-assisted extractionJ. Carbohy

37、drate Polymers，2012，89（2）：694-700.14 Miller N J，Rice-Evans C，Davies M J，et al. A novel method for measuring antioxidant status in premature neonatesJ. Clinical Science，1993，84（4）：407-412.15 Re R，Pellegrini N，Proteggente A，et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decoloriz

38、ation assayJ. Free Radical Biology & Medicine，1999，26（9-10）：1231-1237.16 Zeng W C，Zhang Z，Gao H，et al. Chemical composition，antioxidant，and antimicrobial activities of essential oil from pine needle (Cedrus deodara)J. Journal of Food Science，2012：77（7）：824-829.17 Fridovich I. The biology of oxyg

39、en radicalsJ. Science，1978，201（4359）：875-880.18 Harman D. Aging：OverviewJ. Annals of the New York Academy of Sciences，2001，928：1-21.19 Sun T，Xie W M，Xu P X. Superoxide anion scavenging activity of graft chitosan derivativesJ. Carbohydrate Polymers，2004，58（4）：379-382.20 Magnani L，Gaydou E M，Hubaud J

40、C. Spectrophotometric measurement of antioxidant properties of flavones and flavonols against superoxide anionJ. Analytica Chimica Acta，2000，411（1-2）：209-216.21 郭雪峰，岳永德，湯鋒，等. 用清除超氧陰離子自由基法評價(jià)竹葉提取物抗氧化能力J. 光譜學(xué)與光譜分析，2008，28（8）：1823-1826.22 Korycka-Dahl M B，Richardson T. Activated oxygen species and oxida

41、tion of food constituentsJ. CRC Critical Reviews in Food Science & Nutrition，1978，10（3）：209-241.23 Raha S，Robinson B H. Mitochondria，oxygen free radicals，disease and ageingJ. Trends in Biochemical Sciences，2000，25（10）：502-508.24 Gil Del Valle L. Oxidative stress in aging：Theoretical outcomes and

42、 clinical evidences in humansJ. Biomedicine & Aging Pathology，2011，1（1）：1-7.25 Anderson K M，Seed T，Ou D，et al. Free radicals and reactive oxygen species in programmed cell deathJ. Medical Hypotheses，1999，52（5）：451-463.26 Jurva U，Wikström H V，Bruins A P. Electrochemically assisted fenton rea

43、ction：Reaction of hydroxyl radicals with xenobiotics followed by on-line analysis with high performance liquid chomatography/tandem mass spectrometryJ. Rapid Communications in Mass Spectrometry，2002，16（20）：1934-1940.27 馮慧萍，李亦聰. 羥自由基與水楊酸反應(yīng)機(jī)理的初探J. 光譜實(shí)驗(yàn)室，2009，26（4）：931-938.28 Min D B，Boff J M. Chemistr

44、y and reaction of singlet oxygen in foodsJ. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety，2002，1（2）：58-72.29 Girotti A W. Lipid hydroperoxide generation，turnover，and effector action in biological systemsJ. Journal of Lipid Research，1998，39（8）：1529-1542.30 Yokoyama M. Oxidant stress and ather

45、osclerosisJ. Current Opinion in Pharmacology，2004，4（2）：110-115.31 Finkel T. Oxidant signals and oxidative stressJ. Current Opinion in Cell Biology，2003，15（2）：247-254.32 Virginia B C J，Silvia B M B，Sandra S C，et al. Aging and oxidative stressJ. Molecular Aspects of Medicine，2004，25（1-2）：5-16.33 Rajakumar D V，Rao M N. Dehydrozingerone and isoeugenol as inhibitors of lipid peroxidation and as free radical scavengersJ. Biochemical Pha