酶抑制劑篩選模型探究進(jìn)展

1、酶抑制劑篩選模型探究進(jìn)展摘要通過(guò)查閱文獻(xiàn)，綜述目前酶抑制劑篩選的 主要模型，包括動(dòng)物模型、高通量篩選模型及固定化酶反應(yīng) 器。并對(duì)其應(yīng)用原理、應(yīng)用情況及優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了闡述。關(guān)鍵詞酶抑制劑；篩選模型；靶點(diǎn)；驗(yàn)證中圖分類號(hào)r965. 1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼a 文章編號(hào) 1674-4721 (2013) 08 (a) -0018-0320世紀(jì)60年代，日本科學(xué)家梅譯濱夫提出了酶抑制劑 的概念，從而將抗生素的研究擴(kuò)大到酶抑制劑的新領(lǐng)域。隨 著酶學(xué)研究的深入，對(duì)酶結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)，已能在分子水平上認(rèn) 識(shí)酶的作用機(jī)制，并根據(jù)酶的作用原理來(lái)設(shè)計(jì)各種酶的專一 抑制劑作為藥物，來(lái)調(diào)節(jié)體內(nèi)的異常代謝。酶抑制劑作為藥物的治療基礎(chǔ)是通

2、過(guò)限制酶催化底物 的反應(yīng)能力，使底物濃度增高或代謝產(chǎn)物濃度降低，以達(dá)到 改善癥狀的目的。在一系列酶促反應(yīng)中，以抑制限速酶或關(guān) 鍵酶的效果最好。在目前上市的藥物中，以受體為靶點(diǎn)的藥 物占52%,以酶為靶點(diǎn)的藥物占22%,以離子通道為靶點(diǎn)的 藥物占6%,以核酸為靶點(diǎn)的藥物占3%。酶抑制劑的開(kāi)發(fā)是 新藥的重要來(lái)源。隨著現(xiàn)代生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，酶抑制劑 作為藥物越來(lái)越受到醫(yī)藥界的重視。藥物篩選模型是用于證明某種物質(zhì)具有藥理活性(生物 活性、治療作用）的實(shí)驗(yàn)方法，是尋找和發(fā)現(xiàn)藥物的重要途 徑之一。在長(zhǎng)期尋找藥物的實(shí)踐過(guò)程中，建立了大量用于新 藥篩選的各類模型，在新藥發(fā)現(xiàn)和研究中發(fā)揮了積極的作 用。隨著生

3、命科學(xué)的發(fā)展，新的藥物篩選模型不斷出現(xiàn)，不 僅促進(jìn)了藥物的發(fā)現(xiàn)，而且對(duì)藥物篩選的方法、理論、技術(shù) 都產(chǎn)生了巨大影響1。酶抑制劑的篩選模型主要為動(dòng)物模型和細(xì)胞分子水平 篩選模型。動(dòng)物模型由于規(guī)模小、效率低、樣品量大、成本 高等缺點(diǎn)，不適合作為藥物初篩的模型。細(xì)胞和分子水平的 篩選模型，具有材料用量少、藥物作用機(jī)制比較明確、可實(shí) 現(xiàn)大規(guī)模篩選和一藥多篩等特點(diǎn)1,已成為目前酶抑制劑 篩選的主要方法。本文就近幾年來(lái)酶抑制篩選的主要模型進(jìn) 行綜述。1高通量篩選模型高通量篩選是以分子細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)，以微 型板為實(shí)驗(yàn)工具載體，以自動(dòng)化操作系統(tǒng)執(zhí)行實(shí)驗(yàn)過(guò)程，以 靈敏快速的檢測(cè)儀器采集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以計(jì)算

4、機(jī)對(duì)實(shí)驗(yàn)獲得的 數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，同時(shí)對(duì)數(shù)以萬(wàn)計(jì)的樣品進(jìn)行檢測(cè)。高通 量篩選以其高效、快速的優(yōu)點(diǎn)，已成為酶抑制劑新藥發(fā)現(xiàn)的 主要手段。酶抑制劑的高通量篩選模型，主要為分子水平的 篩選模型，也有少量細(xì)胞水平的篩選模型。篩選以酶為作用 靶點(diǎn)的藥物，不僅要觀察酶與藥物的結(jié)合，更要觀察藥物對(duì) 酶活性的影響。根據(jù)酶的特點(diǎn)，酶的反應(yīng)底物和產(chǎn)物都可作 為檢測(cè)指標(biāo)2。以酶為作用靶點(diǎn)的高通量檢測(cè)方法，絕大 多數(shù)是直接檢測(cè)酶的活性，主要有基于放射性的方法和基于 比色、熒光的方法兩大類3。曹鴻鵬等4采用熒光分析法建立了流感病毒神經(jīng)氨酸 酶抑制劑的高通量篩選模型，從甲型及乙型流感病毒中制備 出神經(jīng)氨酸酶，以有熒光特性

5、的化合物為酶的底物，利用96 孔板建立了適合高通量篩選神經(jīng)氨酸酶抑制劑的熒光分析 法。方法：96孔板中,100 u1體系中含有20 umol/lmunana （底物），3 ul神經(jīng)氨酸酶溶液，10 ul待測(cè)樣品溶液， 37°c, ph 3. 5,孵育 15 min, 355/460 nm 測(cè)定熒光強(qiáng)度。張冉等5采用比色法建立了 a-葡萄糖昔酶抑制劑的 高通量篩選模型。從小腸上段提取a-葡萄糖昔酶，以蔗糖 為底物，通過(guò)測(cè)定體系中葡萄糖的生成量來(lái)檢測(cè)a-葡萄糖 昔酶的活性。方法：384孔微板中，20 u1體系中含有10 酶提取液，30 mmol/l的蔗糖5 ul,待測(cè)樣品5 ul, 37

6、°c, 孵育30 min, 505 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。李婷等6也建立 了 a -葡萄糖昔酶抑制劑的髙通量篩選模型。方法：96孔板 中，160卩1體系含2. 5 mmol/l和0. 2 u/ml a-葡萄糖昔 酶，37°c, ph 7. 0,反應(yīng)15 min, 400 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光 度。vollmer等7采用放射法建立了 一種以青霉素結(jié)合蛋 白(pbp)為靶的抗生素的高通量篩選方法。pbp既是糖基轉(zhuǎn) 移酶又是肽轉(zhuǎn)移酶，該法是篩選其糖基轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域的活性位 點(diǎn)上的可結(jié)合物。方法：96孔板中加入莫諾霉素混懸液，然 后加入3h標(biāo)記的pbp(細(xì)菌膜粗提物)和受試化合物，孵育,

7、 過(guò)濾去掉非結(jié)合的放射性，閃爍計(jì)數(shù)測(cè)得放射性指示pbp與 莫諾霉素結(jié)合的情況及受試化合物對(duì)其的影響。另外，根據(jù)酶的特點(diǎn)，還有一些特殊的方法。肖尚志8 建立了醛糖還原酶抑制劑的高通量篩選模型。組織貼塊法培 養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞至815代時(shí),用胰蛋白酶消化后, 接種至24孔板，加入胎牛血清濃度為10%、葡萄糖濃度為 37.5 mmol/l的培養(yǎng)液，含藥血清20 ul,孵育48 h后， 收集細(xì)胞，離心取上清液，與輔酶nadph加上足量的底物在 一定緩沖體系中反應(yīng)。由于nadph為自身含有熒光的物質(zhì)， 故反應(yīng)后，髙效液相色譜367/455 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)熒光強(qiáng)度 便可反映nadph的消耗情況，從而推

8、算出醛糖還原酶的活性。 hammonds等建立了真核生物拓?fù)洚悩?gòu)酶ii抑制劑的高通量 篩選方法。啤酒酵母菌株經(jīng)改造后使表達(dá)人拓?fù)洚悩?gòu)酶ii a 或ii b。將細(xì)胞與受試藥物在96孔板上孵育后，在630 nm 波長(zhǎng)處測(cè)其吸收度值，從而檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)情況及酶活 性的影響。高通量篩選模型已成功應(yīng)用于p561ck激酶、dna拓?fù)洚?構(gòu)酶、醛糖還原酶、神經(jīng)氨酸酶、環(huán)氧化物水解酶9、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶等抑制劑的篩選。2固定化酶反應(yīng)器(imer)固定化酶是通過(guò)物理和化學(xué)的方法，將酶固定于特定的 載體上制成仍具有催化活性的酶的衍生物。固定化酶不需要 高純度的酶，降低了對(duì)酶的需求，對(duì)熱、有機(jī)溶劑和ph的 穩(wěn)定性增

9、加；可以反復(fù)長(zhǎng)期使用，只需要簡(jiǎn)單的清洗過(guò)程， 就可以恢復(fù)活性。與溶液中的蛋白質(zhì)酶解反應(yīng)相比，固定化 的酶具有更高的酶/底物比、更高的酶解效率、更高的穩(wěn)定 性，并能減少酶的自身降解，因此在酶抑制劑的篩選中得到 越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。主要缺點(diǎn)是固定化酶對(duì)底物的親和力略 有降低，可能是由于：酶固定化后，活性中心的氨基酸殘 基、空間結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)發(fā)生了變化；在固定化酶的周圍, 形成了能對(duì)底物產(chǎn)生立體影響的擴(kuò)散層及靜電的相互作用。 imer以陽(yáng)性藥來(lái)評(píng)價(jià)模型的有效性。2. 1 a -葡萄糖昔酶抑制劑的固定化酶篩選模型盧大勝等10建立了 a-葡萄糖昔酶抑制劑的固定化酶篩選模型。以高脫乙酰度殼聚糖為載體，以三餐

10、甲基磷(thp) 為交聯(lián)劑，將葡萄糖昔酶的n端固定，裝柱，模擬其在 體內(nèi)小腸壁上的情況。方法：直徑0. 5 cm、長(zhǎng)5. 5 cm的層析柱中，加入50 u1pnpg (0. 116mol/l),待測(cè)樣品，37°c水浴中反應(yīng)10 min,用紫外分光光度計(jì)在400 nm波長(zhǎng)處測(cè) 定吸收度值。與游離酶相比較，固定化酶篩選模型上的酶由 于n端被固定，其空間結(jié)構(gòu)有所制約，從而使與底物的結(jié)合 受到一定程度的限制，導(dǎo)致其在實(shí)驗(yàn)中的活力偏低，但這正 是它模擬酶在小腸壁上的情況，所以實(shí)驗(yàn)中反映出來(lái)的數(shù)據(jù) 更接近于體內(nèi)。該固定化酶篩選模型可重復(fù)使用，適合高效、 便利、快速的篩選a-葡萄糖昔酶抑制劑，還可

11、直接在體外 評(píng)價(jià)a-葡萄糖昔酶抑制劑的作用效果，研究一些已知能夠 治療糖尿病的天然產(chǎn)物的作用機(jī)制。2. 2 imer-hplc將酶固定到色譜填料上，用裝柱的方式制成imer,與高 效液相系統(tǒng)及質(zhì)譜系統(tǒng)聯(lián)用，可以進(jìn)行酶抑制劑混合物的快 速篩選。該法將色譜系統(tǒng)的選擇性、快速、無(wú)破壞性及重現(xiàn) 性與imer的特異性和靈敏性相結(jié)合，可以極大的增強(qiáng)檢測(cè) 的靈敏度，且可用于痕量化合物的檢測(cè)，因此在藥物篩選中 具有廣闊的前景。bartolini等11采用imer-hplc方法建立了人重組體 乙酰膽堿酯酶(hrache)抑制劑的篩選模型。采用戊二醛為 交聯(lián)劑，將hrache固定于12 mmx3 mm i.d的c

12、im整體柱: cim柱經(jīng)緩沖溶液平衡后，放入10%的戊二醛緩沖液中暗處 攪拌6 h后，加入hrache稀釋(1. 74 u/100 u 1)反應(yīng)過(guò) 夜。加入10 ml, 0. 1 mol/l的氧基硼氫酸溶液，25°c反應(yīng)2 h后用緩沖溶液沖洗。將cim柱裝于合適支持物中即可用于 高效液相色譜法，紫外檢測(cè)器450 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸收度。方 法：一定濃度的底物單獨(dú)進(jìn)樣，其峰面積為a0,含一定濃度 底物的抑制劑進(jìn)樣，其峰面積記為ai,則酶的百分抑制率為 100- (ai/a0x100)o該模型的建立減少了酶的用量，極大 地提高了分析速度，實(shí)現(xiàn)了酶抑制劑的快速篩選，以及混合 物的篩選。2. 3

13、 imer-hplc-ms/msimer色譜串聯(lián)質(zhì)譜，可以直接獲得酶的活性信息、碎片 信息、結(jié)構(gòu)信息及親和信息，實(shí)現(xiàn)了酶抑制劑的高通量篩選。hodgson等12建立了腺昔脫氨酶的imer色譜串聯(lián)質(zhì)譜 法。采用溶膠-凝膠技術(shù)將腺昔脫氨酶固定于毛細(xì)管整體柱: dgs加水制成凝膠，加入適當(dāng)ph的腺昔脫氨酶溶液中，迅速 加入40卩1多聚腺昔水溶液，充分混合后轉(zhuǎn)入長(zhǎng)80 cm,內(nèi) 徑250 um,外徑360卩m的聚酰亞胺涂漬的熔融硅管中。 封口，ph 6. 5,陳化5 do將整體柱切為10 cm長(zhǎng)度作為色 譜柱用于高效液相串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行抑制劑篩選。采用兩元泵液 相色譜，a泵以底物為流動(dòng)相，b泵以底物、待篩

14、樣品混合 物為流動(dòng)相，總流速保持不變，通過(guò)梯度改變兩泵的流速比 來(lái)調(diào)整待篩樣品的濃度。通過(guò)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式在線質(zhì)譜檢 測(cè)，可分別獲得產(chǎn)物、底物濃度，根據(jù)產(chǎn)物的減少和底物的 增加來(lái)評(píng)價(jià)被篩樣品對(duì)酶活性的影響，通過(guò)定量分析還可獲 得抑制劑的ic50值、k1值和km值。imer色譜串聯(lián)，降低 了篩選成本，減少了分析時(shí)間，無(wú)需色譜分離過(guò)程，實(shí)現(xiàn)了酶抑制劑的快速篩選以及酶抑制劑混合物的篩選13 oimer已成功應(yīng)用于多巴胺b-釋化酶、a-葡萄糖昔酶、 b-分泌酶、腺昔脫氨酶、苯乙醇胺n-甲基轉(zhuǎn)移酶等抑制劑 的篩選。3動(dòng)物模型動(dòng)物模型是以動(dòng)物為藥物篩選的對(duì)象，以動(dòng)物對(duì)藥物的 反應(yīng)，證明某些物質(zhì)的藥理作用，評(píng)

15、價(jià)其藥用價(jià)值。藥物篩 選中應(yīng)用的動(dòng)物模型通常是動(dòng)物的病理模型。理想的動(dòng)物模 型應(yīng)具備的基本條件：病理機(jī)制與人類疾病的相似性、病理 表現(xiàn)的穩(wěn)定性和藥物作用的可觀察性14 o由于很多因素會(huì)影響與酶靶點(diǎn)作用的化合物的藥理作 用，在體外對(duì)靶分子或細(xì)胞作用較強(qiáng)的物質(zhì)，在體內(nèi)可能會(huì) 被迅速降解或經(jīng)過(guò)旁路途徑功能的調(diào)整而降低或消除活性 成分的作用，許多在體外作用強(qiáng)度較高的酶抑制劑活性成分 在生物體內(nèi)可能顯示不出理想的作用效果，因此必須通過(guò)動(dòng) 物模型進(jìn)行復(fù)篩15。醛糖還原酶抑制劑篩選的動(dòng)物模型主要有四氧囉噪誘 導(dǎo)模型和鏈腺佐菌素誘導(dǎo)模型16。動(dòng)物給藥后，提取分離 血漿中的紅細(xì)胞，采用分光光度法、柱層析法、熒光

16、法和 elisa等方法測(cè)定紅細(xì)胞中醛糖還原酶的活性。神經(jīng)氨酸酶抑制劑篩選通常采用感染了致死性流感病 毒的小鼠或雪貂為對(duì)象17,通過(guò)觀察不同給藥時(shí)間藥物對(duì) 致死性、體重減輕及動(dòng)脈氧飽和度降低的保護(hù)作用，評(píng)價(jià)藥 物的作用。4篩選模型的驗(yàn)證建立藥物篩選模型的目的是為了篩選活性化合物，反應(yīng) 化合物所具有的生物活性，因此，對(duì)篩選模型能否準(zhǔn)確的反 應(yīng)化合物的生物活性，必須進(jìn)行驗(yàn)證18 o4. 1可行性驗(yàn)證以陽(yáng)性抑制劑為對(duì)照，考察篩選模型對(duì)陽(yáng)性抑制劑的識(shí) 別能力。一般將該篩選模型獲得的陽(yáng)性抑制劑的ic50與文 獻(xiàn)報(bào)道相比較，結(jié)果一致，該篩選模型才具有實(shí)用性13。4. 2靈敏性驗(yàn)證一般以信號(hào)本底比、信噪比和1

17、'因子來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)。信 號(hào)本底比3,信噪比10, z'因子0.4,模型才能靈敏的反 應(yīng)樣品的活性。對(duì)于高通量篩選，z'因子10才能滿足要求 19 o4. 3穩(wěn)定性驗(yàn)證考察廠因子的日內(nèi)、日間精密度或陽(yáng)性抑制劑抑制率 的日內(nèi)、日間精密度，以保證篩選結(jié)果穩(wěn)定，在重復(fù)試驗(yàn)中 能獲得一致的結(jié)果：19 o5展望藥物篩選是尋找新藥的重要途徑，建立相應(yīng)的藥物篩選 模型是藥物篩選的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。高通量篩選模型的出現(xiàn)實(shí)現(xiàn)了酶抑制的快速篩選及一藥多篩，極大地促進(jìn)了酶抑制劑篩選 的發(fā)展。imer與色譜系統(tǒng)聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)了混合物的快速篩選， 使酶抑制劑的篩選又上新的臺(tái)階。近年來(lái)，隨著計(jì)算機(jī)技術(shù) 和生物信息

18、學(xué)的快速發(fā)展，應(yīng)用計(jì)算機(jī)虛擬配體技術(shù)進(jìn)行體 外藥物篩選已經(jīng)成為一種與高通量篩選互補(bǔ)的實(shí)用化工具， 篩選過(guò)程無(wú)需消耗樣品和其他實(shí)驗(yàn)材料，既省時(shí)又經(jīng)濟(jì)。另 外生物芯片技術(shù)的應(yīng)用，能夠在微小的芯片上獲得大量的生 物活性數(shù)據(jù)，在藥物篩選中顯示出巨大的優(yōu)勢(shì)。相信隨著科 學(xué)技術(shù)的發(fā)展，將會(huì)有更多的篩選模型用于篩選，極大地縮 短新藥發(fā)現(xiàn)周期。參考文獻(xiàn)1 胡涓涓，杜冠華.藥物篩選模型研究進(jìn)展j.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2001,21 (4)： 302-305.2 徐志紅，蔣志勝.藥物篩選新方法高通量篩選j.生物學(xué)通報(bào)，2007, 38 (3)： 7-9.3 梁乾德，王升啟.藥物高通量篩選分析技術(shù)j.國(guó) 外醫(yī)學(xué)藥學(xué)分冊(cè)

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