重組人胸腺素β4基因的克隆、表達、純化、鑒定及活性檢測

1、重組人胸腺素b 4基因的克隆、表達、純化、鑒定及活性檢測【摘?！?的：利用基因工程的方法原核表達重組人胸腺素0 4(tp 4)并對其進 行純化和鑒定.方法：使用大腸桿菌偏愛密碼子合成人tb4全長基1大i,構(gòu)建了 t b 4的二串聯(lián)體基因(t13 4),將其克隆入表達載體pef 22b(+)>|«,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn) 化大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài),ip1g誘導表達后,經(jīng)鹽析、疏水層析和離子交換層 析純化重組蛋白,釆用免疫卬跡和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜對重組蛋 白進行鑒定.結(jié)果：獲得了純化的重組tb 4蛋白，并具有生物學活性.結(jié)論：成 功構(gòu)建、表達和純化了 tb 4，為其功能

2、研究奠定基礎.【關鍵詞】 胸腺索b4串聯(lián)重復序列克隆分子基因表達0引言胸腺索b 4(thymosin beta 4, tb 4)廣泛分布于各組織、器官和細胞中，與免 疫功能、神經(jīng)發(fā)育和肌動蛋白功能密切，還可抗炎,促進血管生成門、創(chuàng)傷愈合2、毛囊發(fā)育3，修復受損的心肌4 雖然ti3 4有著廣泛的應用前景, 但由于其分子太小，難于直接在大腸桿菌中表達.目前用于實驗室及臨床試驗的 tb 4主耍為化學合成品，價格昂貴,使其應用受到限制.我們利用基因合成與pcr 技術,構(gòu)建了 tb 4的二串聯(lián)休基因(tb 4)表達載體，在大腸桿菌中成功地表達 和純化了該串聯(lián)體，為進一步的研究奠定了基礎.1材料和方法1.

3、1材料質(zhì)粒pet 22b(+),大腸桿菌dh5a及bl21(de3)由本中心保存; 人tb 4全長基因、測序(北京奧科生物技術有限責任公司);引物(上海英峻生物公 司);限制性內(nèi)切酶nde i , bamh i , sal i ,14 dna連接酶以及dna marker dl2000(lakara);laq pcr mix(天根生化科技有限公司);b型質(zhì)粒小量提取試 劑盒，小分子量dna片段高效快速回收試劑盒(北京博大泰克生物基因技術有限 責任公司);蛋白分子質(zhì)量標準(fermentas);兔抗人tb 4多克隆抗體 (abeam,ab14334);hrp 山羊抗兔iggdab顯色液(北京中杉

4、金橋生物技術 有限公司);ipt3,瓊脂，瓊脂糖,mtk北京鼎國生物技術有限責任公司)；phenyl sepharose 6 fst row(high sub), q sepharose fast row, kia purifier(pharmacia);cona(華美生物工程公司)，小鼠淋巴細胞分離液(天津頗 洋生物制品科技有限責任公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司), rpmi1640(gibco),tp4化學合成品(proec bny),其他試劑均為國產(chǎn)分析 純;balbc小鼠，雄性,68周齡(第四軍醫(yī)大學實驗動物中心).1.2方法1.2.1重組t3 4基因的克隆按照大腸桿

5、菌慣用密碼了及人胸腺素b 4氨基 酸序列設計并合成了編碼t0 4的全基因片段,5和3末端分別帶有nde i和 bamh i酶切位點，將其克隆入pet 22b(+)中，nde i和bamh i雙酶切鑒定 后，將其命名為pet 22b(+) tp 4;合成兩條引物，上游引入bamh i酶切位 點，下游引入sal i酶切位點及終止密碼子tag,以pet 22b(+) t0 4為模 板進行pcr擴增,pcr產(chǎn)物經(jīng)bamh i和sal i雙卿切后克隆入pet 22b(+)tb4中，bamh i和sall雙酶切鑒定并測序,命名為pet 22b (+) tp 4 .1.2.2重組tp 4的表達重組質(zhì)粒p e

6、t 22b (+) tp 4轉(zhuǎn)化大腸桿菌 bl21qe3)感受態(tài)細胞,挑取陽性克隆接種于含氨節(jié)青霉素100 mg/l的lb培養(yǎng) 液中,37°c震蕩培養(yǎng)過夜,(a)以1 : 100分別轉(zhuǎn)接入六個試管中，繼續(xù)培養(yǎng)2 h(a600 nm=0.5)后,其屮一管作為誘導的陰性對照，另五管分別加入終濃度為 0.01,0.05,0.1,0.5,1 mmol/l ip1g,繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,離心收集菌體行 sds page;(b)以1 ： 100分別轉(zhuǎn)接入兩個試管中，繼續(xù)培養(yǎng)2 h(a600 nm=0.5)£/,m 中一管i乍為誘導的陰性對照，另一管加入終濃度為0.01 mmol/lipt

7、g,每隔1 h收 集菌體進行sds page1.2.3重組tb 4的western blot鑒定ip1g誘導及未誘導的bl21/pet 22b (+) tp 4行sds pag e,隨后將其轉(zhuǎn)移到nc膜上，用兔抗人tb 4多克 隆抗體作為一抗,hrp 山羊抗兔igg作為二抗，進行western blot鑒定.1.2.4重組tb 4的純化終濃度為0.01 mmol/l的ipt3，誘導bl21/pef 22b(+) tb44 h后收集菌體,超聲裂菌后的上清經(jīng)硫酸鞍鹽析、phenyl sepharose 6 fst flow(high sub)疏水柱和 q sepharose fast how 陰離

8、了交 換柱純化后,lowrys法測定蛋白含量.1.2.5maldi 7of ms和hplc將純化后的重組tb 4透析在水小,0.22 u m濾膜過濾除菌后，委托軍事醫(yī)學科學院儀器測試分析中心對其進行分子量測 定.另取20 ul樣品進行hplc分析.1.2.6重組tb 4的生物學活性檢測從小鼠單個脾細胞懸液中分離淋巴細胞, 用含100 ml/l胎牛血清的rpmi1640調(diào)整細胞濃度，加入cona使其終濃度為 2.5 mg/u按每孔4x105細胞加入96孔細胞培養(yǎng)板屮,37°c孵箱培養(yǎng)6 h后，加 入重組tb4和tb4化學合成品，終濃度分別為2,4,8 umol/l,繼續(xù)培養(yǎng)72 h,m

9、tt法測定淋巴細胞的增殖和分化.2結(jié)果2.1 pc r及酶切和序列鑒定人tb 4基因的pc r產(chǎn)物經(jīng)0.2 g兒瓊脂糖凝膠 電泳檢測，在約135bp處可見特異性條帶(圖1),該片段大小與預測結(jié)果一致.分 別用限制性內(nèi)切酶nde i和sal i ,nde i和bamh i , bamh i和sal i雙酶切 pet 22b (+) tb4,在270 bp處可見重組t0 4基因及135bp處的tb4 基因片段(圖2).測序結(jié)果為序列正確的重組tb 4基因，含起始密碼子、終止密 碼了及酶切位點.1: pcr產(chǎn)物;m: dna marker.圖1人tp4pcr產(chǎn)物電泳圖1:pef 22b (+) tb

10、4 /ndel 和 sal i 雙酶切；2:pef 22b (+) tp 4 /nde i 和 bamh i 雙酶切；3: pet 22b(+) tp 4(g)/bamh i 和 sal i 雙酶 切；m: dna marker.圖2人tb 4重組克隆的酶切電泳圖22重組tb 4的表達sds page結(jié)果表明,各濃度ipt3誘導bl21/pet 22b(+) t0 44 h后，均有明顯的新生條帶岀現(xiàn)，其量無明顯差別(圖3)；終 濃度為0.01 mmol/l的ip1g誘導bl21/pet 22b(+) tb4不同時間后，同 樣有明顯的新生條帶岀現(xiàn)，誘導4 h后其量明顯增加(圖4).m: mark

11、er; 1:未誘導 bl21/pet 22b(+) tb4；26: 0.01, 0.05,0.1,0.5 和 1 mmol/liptg 誘導 bl21/pet 22b(+) tp 4 4 h.圖3ipt3濃度對重組tp 4表達的影響m: marker; 1:未誘導 bl21/pet 22b(+) tb4；27: 0.01 mmol/l ipt3 誘導 bi_21/pet 22b(+) tb 4 仆6h.圖4誘導口寸間對重組tb 4表達的影響2.3重組tb 4的western blot鑒定dab顯色后在相應位置有條帶顯現(xiàn), 表明重組tb 4蛋白可與兔抗人tb 4多克隆抗體特異性結(jié)合(圖5).1:

12、 0.01 mmol/l ipt3 誘導 bl21/pet 22b(+) tp 4 4 h; 2:未誘導 bi_21/pet 22b(+) tp 4; m: marker.圖5重組tb 4的免疫印跡鑒定2.4重組tb 4的純化超聲裂菌可知重組tp 4蛋白以可溶性形式存在，經(jīng) 硫酸較鹽析、疏水層析和陰離子交換層析可得較高純度重組tb4蛋門(圖6), 平均每克菌約可得到7.5 mg tb 4蛋口純品.m: m a rke r; 1:未誘導 bl21/pet 22b (+) tb 4; 2: 0.01 mmol/l i pig 誘導bl21/pet 22b(+) tp 44 h; 3:超聲裂菌沉淀；

13、4:超聲裂菌上清；5: 硫酸錢鹽析沉淀;6:硫酸鍍鹽析上清;7:疏水作用純化目的蛋口； 8:離子交換作 用純化目的蛋白.圖6重組tb 4的純化2.5maldi tof ms和hplc質(zhì)譜分析測得重組tb 4的mr為10 020.5,與理論分子量相近（圖7a）;hplc測定其純度大于95%（圖7b）.2.6重組tb 4的生物學活性檢測與對照相比，重組tp 4與商品化的tb 4 均可有效地刺激淋巴細胞的增殖和分化（表1）,這一發(fā)現(xiàn)證實我們獲得了與商品 化tb 4活性相當?shù)闹亟Mti3 4.圖 7 重組 tb 4的 maldi 1of ms （a）和 hplc （b）表1重組tb 4生物學活性檢測濃度

14、（umol/l） o a 570 nmtp4 t b 40（對照）n 0.096土0.012 o 0.096±0.0122 o 0.135±0.013a o 0.127 ±0.010a4i3 0.158±0.016a k3 0.147土0.015a8 ku 0173±0.020a 0 0.166 ±0.017aap<0.05 vs 對照.3討論雖然sds page是測定蛋白質(zhì)分子量的一種簡便易行的方法，但有些蛋白 質(zhì)用這種方法測出的分了量是不可靠的.這些蛋白質(zhì)有:電荷異?；驑?gòu)象異常的 蛋白質(zhì)（組蛋片f1木身帶有大量正電荷

15、，盡管結(jié)合了正常比例的sds仍不能完全 掩蓋其原有正電荷的影響）;帶有較人輔基的蛋口質(zhì)（如某些糖蛋口）以及一些結(jié)構(gòu) 蛋口（如膠原蛋口）和含二硫鍵較多的蛋口質(zhì)（有些受體）5tb4的理論分子 量為10 000,但電泳結(jié)果顯示其mr約為18 000,隨后采用質(zhì)譜分析對其分子量進 行測定，結(jié)果與理論分了量接近.tb 4電泳分了量與理論分了量的偏差可能是 由于其構(gòu)象異常引起的，因為tp 4不帶有輔基，并非結(jié)構(gòu)蛋白,不含有二硫鍵，并 且可排除電荷異常（單體tb 4電泳分子量與理論分子量相符）因此，在分析sds page所得的結(jié)果時，應該用至少兩種方法來測定未知樣品的分子量.tp 4在胸腺素b家族中豐度最高

16、,它是肌動蛋白分離劑，參與很多重要的生 理和病理活動.目前，關于tb 4的臨床試驗包括壓迫性潰瘍、人皰性表皮松解癥、 靜脈淤積性潰瘍、糖丿求病的玻璃體切割術和急性心肌梗死，其中前四項己進入ii 期臨床試驗此外,tb 4的異常表達與腫瘤轉(zhuǎn)移關系密切6，對tb4進一涉深 入研究有助于找到治療高轉(zhuǎn)移腫瘤的有效療法.雖然tb4有廣泛的臨床應用前 景，但目前所用的化學合成品價格昂貴，同時tb 4是小分了多肽，難于直接在大腸 桿菌中表達，所以其大規(guī)模生產(chǎn)受到限制.關于tb 4的融合表達已有報道：在tb 4的n端融合5個氨基酸（hkcdi）, 可以使tb 4在大腸桿菌得到高效表達,純化后的蛋白可提高e玫瑰花

17、環(huán)結(jié)花率, 并可促進t細胞的增殖和分化7 ; tb 4融合蛋白在大腸桿菌表達后經(jīng)親和層 析和dtt水解,可得到c端融合5個氨基酸（leg田的重組tb 4,不僅可以促進淋 巴細胞的增殖和分化，而ii可以促進傷口愈合8;此外,his6 tb 4可在大腸桿 菌中高效表達并具有促血管生成的生物活性9我們利用串聯(lián)重復技術在大 腸桿菌中成功農(nóng)達了重組tb4,經(jīng)過硫酸餒鹽析、疏水作用和離子交換作用層 析，得到高純度的重組蛋白,不僅具有生物學活性，也為下一步功能研究奠定了基 礎.【參考文獻】1 sfnart n, rossdeutsch a, rley p. thymosin beta 4 and angio

18、genesis: modes of action and therapeutic potential j angiogenesis, 2007,10:229-241.2 mali nd a km, 3dhu gs, mani h, et al. thymosin beta 4 accelerates wound healing j j invest dermatol, 1999,113(3):364-3683 philp d, nguyen m, scheremeta b, et al. thymosin beta 4 increases hair growth by activation of hair follicle stem cells j fasffi j, 2004,18(2):385-387.4 bock marquette i, saxena a, white md, et al. thymosin b4 activates integrin lin ked kinase and pro motes cardiac cell migration, survival and cardi