基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)ppt課件

1、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)抗體抗體l定義：指機(jī)體的免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B淋巴細(xì)胞或記憶細(xì)胞增殖分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。醫(yī)學(xué)運(yùn)用：科研運(yùn)用：免疫共沉淀、免疫印跡、染色質(zhì)免疫共沉淀、免疫熒光技術(shù)、ELISA等1.診斷：各類血清學(xué)檢測，抗人球蛋白測試，早孕檢測 等2.治療：單克隆抗體療法類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎多發(fā)性硬化癥等，腫瘤治療。多抗來源多抗來源l動(dòng)物脾臟有上百萬種不同的B淋巴細(xì)胞系，具有不同基因不同的B淋巴細(xì)胞合成不同的抗體。當(dāng)機(jī)體受抗原刺激時(shí)，抗原分子上的許多決議簇分別激活各個(gè)具有不同基因的B細(xì)胞。被激活的B細(xì)胞分裂增殖形效果應(yīng)B細(xì)胞漿細(xì)胞和記憶B細(xì)胞，大量

2、的漿細(xì)胞克隆合成和分泌大量的抗體分子分布到血液、體液中，即為多克隆抗體。 多克隆抗體制備多克隆抗體制備動(dòng)物選擇：兔子rabbit：最常用于自制抗體，抗體量較多。新西蘭,大耳白小鼠mouse：可用于自制抗體，但抗體量很少。BALB/C,昆明鼠大鼠rat：可用于自制抗體，免疫過程要麻醉動(dòng)物。Wistar大鼠羊sheep、goat：常用于較大批量地消費(fèi)抗體商品。馬horse：常用于大批量消費(fèi)治療用抗體商品。豚鼠guinea pig：國外實(shí)驗(yàn)室常用。根本步驟根本步驟延伸抗原的作用時(shí)間加強(qiáng)吞噬作用刺激抗原提呈促進(jìn)細(xì)胞因子分泌誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分裂、增殖影響T細(xì)胞“極化佐劑的作用機(jī)理：佐劑的作用機(jī)理：抗原制備：

3、抗原制備：商品化或自行表達(dá)商品化或自行表達(dá)根底免疫：初次，抗根底免疫：初次，抗原用量大，用佛式完原用量大，用佛式完全佐劑全佐劑Complate Complate Freund adjuvand ,Freund adjuvand ,含礦物油含礦物油, ,卡介苗等卡介苗等) )。加強(qiáng)免疫：第加強(qiáng)免疫：第2次以后，抗次以后，抗原量減半，多次，間隔原量減半，多次，間隔2-4周，用佛式不完全佐劑周，用佛式不完全佐劑(Incomplate Freund adjuvand ,不含卡介苗不含卡介苗).取血測效價(jià)：取血測效價(jià)： 加強(qiáng)免疫兩次或加強(qiáng)免疫兩次或三次以后的第三次以后的第7 7天取天取血。血。放血制備血

4、清：放血制備血清：可一次放血可一次放血( (頸動(dòng)脈頸動(dòng)脈) )也可多次取血也可多次取血( (耳靜脈耳靜脈) )實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法l新西蘭大耳白，2000g(雌雄均可),安康,無病原l根底免疫l0.5ml抗原(含0.250.5mg蛋白或108顆?？乖?l0.5ml佛式完全佐劑(CFA)l制備抗原-佐劑乳化液l背部、頸部皮下多點(diǎn)注射或腿部肌肉注射l加強(qiáng)免疫l間隔2-4周,可進(jìn)展多次l0.5ml抗原(蛋白量減半)l0.5ml佛式不完全佐劑(IFA)l制備抗原-佐劑乳化液l背部、頸部皮下多點(diǎn)注射或腿部肌肉注射實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法l免疫34次以后從耳靜脈取血檢測效價(jià)l酶聯(lián)法：1:104以上，能到達(dá)1:106。

5、l免疫雙分散： 1:16以上，能到達(dá)1:64l效價(jià)到達(dá)要求的可放血制備血清l可一次放血(頸動(dòng)脈)l也可多次取血(耳靜脈)多抗的特點(diǎn)多抗的特點(diǎn)l多抗是單抗的混合物，因此多抗的性質(zhì)是一個(gè)群體綜合的性質(zhì)。l比單抗更容易捕捉抗原。由于含有抗不同表位的抗體，多種抗體都可與抗原結(jié)合。l特異性相對(duì)較差：由于由不同性質(zhì)的抗體組成，只需其中含交叉反響的抗體，多抗就有交叉反響，所以多抗更容易有交叉反響。l 抗體的純化、標(biāo)志比單抗難：由于含有各種不同類型、亞類的抗體，提純、標(biāo)志的方法有所差別。同時(shí),血清中含有的雜蛋白比較多。什么情況下需求制備單克隆抗體什么情況下需求制備單克隆抗體l目的蛋白有構(gòu)造類似物l抗原不純，無

6、法分開l多抗效果不好已排除非特異性反響l希望將抗體用于治療，研制成藥品l希望將抗體用于診斷，研制成診斷試劑單抗制備原理單抗制備原理l假設(shè)能選出一個(gè)制造一種專注抗體的漿細(xì)胞進(jìn)展培育，就可得到由單細(xì)胞經(jīng)分裂增殖而構(gòu)成細(xì)胞群，即單克隆。單克隆細(xì)胞將合成針對(duì)一種抗原決議簇的抗體，稱為單克隆抗體。l1975年分子生物學(xué)家G.J.F.克勒和C.米爾斯坦在自然雜交技術(shù)的根底上，創(chuàng)建立雜交瘤技術(shù)，他們把可在體外培育和大量增殖的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)抗原免疫后的純系小鼠脾細(xì)胞交融，成為雜交細(xì)胞系，既具有瘤細(xì)胞易于在體外無限增殖的特性，又具有抗體構(gòu)成細(xì)胞的合成和分泌特異性抗體的特點(diǎn)。將這種雜交瘤作單個(gè)細(xì)胞培育，可構(gòu)成

7、單細(xì)胞系，即單克隆。l利用培育或小鼠腹腔接種的方法，便能得到大量的、高濃度的、非常均一的抗體，其構(gòu)造、氨基酸順序、特異性等都是一致的，而且在培育過程中，只需沒有變異，不同時(shí)間所分泌的抗體都能堅(jiān)持同樣的構(gòu)造與機(jī)能。 單抗制備原理單抗制備原理HGRPT：次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 TK：胸腺嘧啶核苷激酶HAT：次黃嘌呤H)、胸腺嘧啶核苷T)、氨基蝶呤A)根本步驟根本步驟實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法l免疫小鼠l選擇體重1820g BALB/C 雌性小鼠，用制備抗原免疫。50100ug抗原/只與等體積福氏完全佐劑混合，充分乳化后，經(jīng)背腹部皮下多點(diǎn)注射0.5ml每只，間隔3周，取與一免等量抗原和等體積的福氏不完

8、全佐劑充分乳化后，第二次皮下多點(diǎn)注射0.5ml每只，過3周后用加倍劑量的抗原進(jìn)展腹腔注射，3天后取脾細(xì)胞進(jìn)展交融。l細(xì)胞交融l取上述免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0按5-10：1的比例，在無血清的RPMI-1640培育基中混勻，1500rpm離心5min，去除培育基，用50% PEGSigma作為交融劑，在37下水浴下參與0.5-0.7ml，使其交融2min，用無血清的RPMI-1640培育基終止交融后1500rpm離心5min，沉淀用HAT培育基懸浮，分裝到96孔含有豢養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞板中，37，5%CO2的細(xì)胞培育器皿中培育。陽性細(xì)胞挑選陽性細(xì)胞挑選l細(xì)胞培育器皿中培育5天后，用HAT

9、培育基換液一次，第10天用HT培育基換液，等到交融細(xì)胞覆蓋孔底10%-50%時(shí)，常規(guī)間接ELISA方法挑選陽性孔。l陽性孔的特異性鑒定采用間接ELISA方法，用包被液稀釋成110ug/mL的抗原100ul/孔包被ELISA板，4過夜，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗滌三次后用110的脫脂奶粉或13 BSA或36牛血清封鎖30-60min;參與陽性孔培育上清100ul/孔，37 12 小時(shí)；PBST洗滌三次后參與按闡明書稀釋10000倍的辣根過氧化物酶標(biāo)志兔抗鼠IgG二抗Sigma公司100ul/孔，37 12小時(shí)，PBST洗滌四次后，用OPD-H2O2底物顯色，2mol/L H2SO4終止反

10、響后，用酶標(biāo)儀讀取OD492的值，以與陰性O(shè)D值比值大于2.1為陽性。獲分別對(duì)上述抗原有特異性反響的陽性孔。l挑選出的特異性陽性孔用常規(guī)的有限稀釋法克隆，獲對(duì)上述抗原有特異性反響的雜交瘤細(xì)胞株。細(xì)胞株進(jìn)一步擴(kuò)展培育，用于制備單抗腹水和液氮凍存。雜交瘤細(xì)胞的凍存l雜交瘤細(xì)胞通常用含有8-10%的二甲亞砜和20小牛血清的培育基凍存于液氮中，在液氮中細(xì)胞可以保管多年，在-80中可以作3-6個(gè)月短期保管。凍存細(xì)胞需求緩慢降溫，復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)需快速升溫，這樣可以確保細(xì)胞有較高的存活率。單克隆抗體腹水制備及純化單克隆抗體腹水制備及純化l取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷Sigma，

11、7-10天后腹腔注入5-10105個(gè)雜交瘤細(xì)胞，注射后7-10天可見小鼠腹部明顯膨大，采取腹水，2000rpm離心3min，搜集上清液，即為單克隆抗體腹水。l辛酸-硫酸銨沉淀法純化抗體：取1倍體積腹水加2倍體積0.06M PH4.8醋酸緩沖液稀釋，加辛酸30ul/ml腹水，室溫下邊加邊攪拌，4廓清1小時(shí)，12000rpm離心20min，搜集上清，再用50%飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，4放置2小時(shí)，3000rpm離心20min，沉淀用2倍體積的PBS溶液溶解，在4流動(dòng)透析24小時(shí)后即獲純化的腹水抗體，-70保管。其他抗體純化方法其他抗體純化方法q鹽析法硫酸銨沉淀)q離子交換法q親和層析法q凝膠過濾

12、法鹽析法硫酸銨沉淀)l原理原理l在高濃度中性鹽存在下在高濃度中性鹽存在下,蛋白質(zhì)在水中的溶解度降低而蛋白質(zhì)在水中的溶解度降低而產(chǎn)生沉淀產(chǎn)生沉淀l硫酸銨是最常用的中性鹽硫酸銨是最常用的中性鹽l不同蛋白質(zhì)的鹽析常數(shù)不同不同蛋白質(zhì)的鹽析常數(shù)不同l硫酸銨的參與量通常以飽和度表示硫酸銨的參與量通常以飽和度表示l (100%飽和度飽和度:767g/L)l特點(diǎn)特點(diǎn)l本錢低，步驟簡單。本錢低，步驟簡單。l抗體的回收率比較高?？贵w的回收率比較高。l抗體純度比較低，電泳后可見到明顯的雜帶抗體純度比較低，電泳后可見到明顯的雜帶,不適宜于不適宜于做各種標(biāo)志。做各種標(biāo)志。l需求高速離心機(jī)。需求高速離心機(jī)。正辛酸-硫酸銨

13、沉淀法l原理原理l兩步沉淀：兩步沉淀：l先加正辛酸去雜蛋白先加正辛酸去雜蛋白.l 正辛酸是一種有機(jī)酸正辛酸是一種有機(jī)酸,在酸性條件下在酸性條件下(pH4.5)可使大分可使大分子的雜蛋白沉淀子的雜蛋白沉淀.l后加硫酸銨使抗體沉淀后加硫酸銨使抗體沉淀.l特點(diǎn)特點(diǎn)l本錢較低，步驟較復(fù)雜。本錢較低，步驟較復(fù)雜。l抗體回收率很低?？贵w回收率很低。l抗體純度高，電泳后雜帶很少，適宜于各種標(biāo)志?？贵w純度高，電泳后雜帶很少，適宜于各種標(biāo)志。l需求高速離心機(jī)，耐高速離心的玻璃離心管。需求高速離心機(jī)，耐高速離心的玻璃離心管。離子交換法l原理原理l利用溶液中各種帶電粒子與離子交換劑之間結(jié)合力的差利用溶液中各種帶電粒

14、子與離子交換劑之間結(jié)合力的差別進(jìn)展物質(zhì)分別別進(jìn)展物質(zhì)分別.lDEAE是一種陰離子交換劑，本身帶正電荷是一種陰離子交換劑，本身帶正電荷l (Diethylaminoethyl,二乙氨基乙基二乙氨基乙基)l將樣品的將樣品的pH值調(diào)至等電點(diǎn)以上值調(diào)至等電點(diǎn)以上,使樣品帶負(fù)電荷使樣品帶負(fù)電荷.l采用鹽溶液洗脫采用鹽溶液洗脫,經(jīng)過高濃度的帶同種電荷的離子經(jīng)過高濃度的帶同種電荷的離子(Cl-)置換被分別的組分置換被分別的組分.l特點(diǎn)特點(diǎn)l本錢較低，步驟較簡單。本錢較低，步驟較簡單。l抗體回收率較高?？贵w回收率較高。l抗體純度較高，電泳后可見少量雜帶，適宜于各種標(biāo)志?？贵w純度較高，電泳后可見少量雜帶，適宜于

15、各種標(biāo)志。l純化后抗體體積大，需求濃縮。純化后抗體體積大，需求濃縮。l需求冷柜，自動(dòng)搜集器。需求冷柜，自動(dòng)搜集器。親和層析法l原理原理l利用蛋白質(zhì)之間的特異性結(jié)合利用蛋白質(zhì)之間的特異性結(jié)合l 抗體抗體-抗原，受體抗原，受體-配體配體l將一種配基與凝膠顆粒結(jié)合將一種配基與凝膠顆粒結(jié)合,捕捉與它相配的物質(zhì)。捕捉與它相配的物質(zhì)。l洗脫普通采用改動(dòng)洗脫普通采用改動(dòng)pH值的方法值的方法l特點(diǎn)特點(diǎn)l本錢較低，步驟較簡單。本錢較低，步驟較簡單。l抗體回收率較高?？贵w回收率較高。l抗體純度較高，電泳后可見少量雜帶，適宜于各種標(biāo)志?？贵w純度較高，電泳后可見少量雜帶，適宜于各種標(biāo)志。l純化后抗體體積大，需求濃縮。

16、純化后抗體體積大，需求濃縮。l需求冷柜，自動(dòng)搜集器。需求冷柜，自動(dòng)搜集器。凝膠過濾法(分子篩)l原理原理l將樣品混合物經(jīng)過一定孔徑的凝膠介質(zhì)將樣品混合物經(jīng)過一定孔徑的凝膠介質(zhì),由于流經(jīng)途徑由于流經(jīng)途徑的差別的差別,使不同分子質(zhì)量的組分分別使不同分子質(zhì)量的組分分別.l大分子物質(zhì)直接從凝膠顆粒外經(jīng)過，走得快；小大分子物質(zhì)直接從凝膠顆粒外經(jīng)過，走得快；小l 分子物質(zhì)進(jìn)入凝膠顆粒的內(nèi)部再出來，走得慢。分子物質(zhì)進(jìn)入凝膠顆粒的內(nèi)部再出來，走得慢。l適宜于適宜于IgM類抗體的純化類抗體的純化l (五聚體五聚體,分子量約分子量約800KD)l特點(diǎn)特點(diǎn)l本錢高，步驟較簡單。本錢高，步驟較簡單。l抗體回收率較高，

17、分別條件緩和，抗體活性不受影響?？贵w回收率較高，分別條件緩和，抗體活性不受影響。l抗體純度較高?？贵w純度較高。l需求自動(dòng)搜集器。需求自動(dòng)搜集器。純化方法選擇原那么純化方法選擇原那么l不需求純化那么不純化；詳細(xì)運(yùn)用l根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求及實(shí)驗(yàn)室條件。腹水效價(jià)測定腹水效價(jià)測定l用常規(guī)間接ELISA方法檢測單抗腹水效價(jià)，腹水效價(jià)在10-5-10-7之間的可用于實(shí)踐運(yùn)用。單抗與多抗比較單抗與多抗比較 單抗 多抗抗體組成 單一 復(fù)雜 抗體性質(zhì) 個(gè)體的屬性 群體綜合的性質(zhì)純化標(biāo)志 容易，效果好 難度高一些 種屬來源 絕大多數(shù)是小鼠 兔、羊、豚鼠等制備周期 長 (最短4個(gè)月 短2個(gè)月制備技術(shù) 復(fù)雜 簡單經(jīng)費(fèi) 多

18、 少 l酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)ELISAl蛋白免疫印跡Western blotl免疫熒光技術(shù)IFl免疫共沉淀Co-IP)l染色質(zhì)免疫共沉淀Ch-IP)ELISA根本原理根本原理l酶聯(lián)免疫吸附測定法Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA的根底是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)志。結(jié)合在固相載體外表的抗原或抗體仍堅(jiān)持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)志的抗原或抗體既保管其免疫學(xué)活性，又保管酶的活性。l在測定時(shí)，受檢標(biāo)本測定其中的抗體或抗原與固相載體外表的抗原或抗體起反響。用洗滌的方法使固相載體上構(gòu)成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再參與酶標(biāo)志的抗原或抗體，也經(jīng)過反響

19、而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。參與酶反響的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)展定性或定量分析。 lELISAELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個(gè)必要的試劑：三個(gè)必要的試劑：l1 1固相的抗原或抗體，即固相的抗原或抗體，即“免疫吸附劑免疫吸附劑 immunosorbentimmunosorbent；l2 2酶標(biāo)志的抗原或抗體，稱為酶標(biāo)志的抗原或抗體，稱為“結(jié)合物結(jié)合物conjugateconjugate；l3 3酶反響

20、的底物。酶反響的底物。l可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測方法?？稍O(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測方法。常用常用ELISA方法方法l1直接ELISA：待測抗原直接包被塑料微量滴定板，然后參與抗原特異性的酶-特異性抗體偶聯(lián)物。由于所用的酶曾經(jīng)標(biāo)志在特定的抗體上，可檢測的病毒種類只能局限于某一種。l2間接ELISA：先用抗原包被微量滴定板，然后參與待測抗體，再參與酶標(biāo)抗體。與直接ELISA相比，間接ELISA適用的范圍更為廣泛，并且特異性也較好。l3夾心ELISA：運(yùn)用俘獲抗體包括單抗和多抗包被微量滴定板，其他步驟同間接ELISA。根據(jù)包被抗體種類的不同，又可以分為同種單抗夾心ELISA，異種單抗夾心ELISA，

21、多種單抗混合夾心ELISA和多抗夾心ELISA等幾種方法。與間接ELISA相比，夾心ELISA多了一步以抗體俘獲富集抗原的過程，因此其靈敏度和特異性也相應(yīng)提高。但是對(duì)有些病毒的株系，夾心ELISA并不是很好的選擇。這能夠與單克隆抗體識(shí)別的是蛋白亞基的抗原表位還是病毒粒子外表的抗原表位有關(guān)根本步驟根本步驟l包被l封鎖l孵育l洗滌l顯色l結(jié)果測定根本步驟根本步驟l包被：包被：l將抗原或抗體固定在固相載體上的過程稱為包被將抗原或抗體固定在固相載體上的過程稱為包被(coating)。l 蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是經(jīng)過物理吸附結(jié)合的，蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是經(jīng)過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子構(gòu)造上的

22、疏水基團(tuán)與固相載體外表的靠的是蛋白質(zhì)分子構(gòu)造上的疏水基團(tuán)與固相載體外表的疏水基團(tuán)間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋疏水基團(tuán)間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體外表。到固相載體外表。不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕

23、獲包被法?？乖兌却蟠筇岣撸虼撕s質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法。親和素生物素親和素生物素 即用親和素先包被載體，參與生物素化的即用親和素先包被載體，參與生物素化的DNADNA，這種包被方法均勻、結(jié)實(shí)，這種包被方法均勻、結(jié)實(shí)，已擴(kuò)展運(yùn)用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。已擴(kuò)展運(yùn)用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。脂類物質(zhì)無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑例如乙醇中溶解后參與脂類物質(zhì)無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑例如乙醇中溶解后參與ELISAELISA板孔中，板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相外表。開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相外表。 優(yōu)

24、點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)的特異性、敏感性均由此得以改善，反復(fù)性亦佳?？乖昧可伲瑑H為直接包優(yōu)點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)的特異性、敏感性均由此得以改善，反復(fù)性亦佳?？乖昧可伲瑑H為直接包被的被的1/101/10乃至于乃至于/100/100。l包被條件：包被條件：l 包被液：包被液：pH9.6碳酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、pH7.2的磷酸鹽緩沖液、的磷酸鹽緩沖液、 pH7-8的的Tris-HCL緩沖液。緩沖液。l參與包被液后，在參與包被液后，在4-8冰箱中放置過夜，冰箱中放置過夜，37中保溫中保溫2小時(shí)。包小時(shí)。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批資料需經(jīng)過被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批資料需經(jīng)過實(shí)驗(yàn)與酶

25、結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。普通蛋白質(zhì)的包被濃度為實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。普通蛋白質(zhì)的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml。l包被緩沖液的選擇要依托他所包被的物質(zhì)而定，沒有絕對(duì)的選擇，包被緩沖液的選擇要依托他所包被的物質(zhì)而定，沒有絕對(duì)的選擇，但有一個(gè)原那么就是要盡能夠的堅(jiān)持包被物的活性不被損失。目但有一個(gè)原那么就是要盡能夠的堅(jiān)持包被物的活性不被損失。目前常用的包被緩沖液有前常用的包被緩沖液有PBS、CBS、tris鹽緩沖液、咪脞緩沖液等，鹽緩沖液、咪脞緩沖液等，普通來說，緩沖液的普通來說，緩沖液的pH要大于蛋白質(zhì)的要大于蛋白質(zhì)的pI，以堅(jiān)持其活性。，以堅(jiān)持其活性。l堿性包被液如碳酸緩沖液用

26、的較多，尤其是在小分子和載體蛋白堿性包被液如碳酸緩沖液用的較多，尤其是在小分子和載體蛋白的偶聯(lián)物的包被，其主要的優(yōu)勢在于堿性環(huán)境可以使蛋白更容易的偶聯(lián)物的包被，其主要的優(yōu)勢在于堿性環(huán)境可以使蛋白更容易與板子結(jié)合。也有用與板子結(jié)合。也有用PBS和檸檬酸緩的，但是比較少見。和檸檬酸緩的，但是比較少見。l洗滌：洗滌：lELSIA洗滌：到達(dá)分別游離的和結(jié)合的酶標(biāo)志物的目的。洗滌：到達(dá)分別游離的和結(jié)合的酶標(biāo)志物的目的。常用的洗滌液為含常用的洗滌液為含0.05% 吐溫吐溫20的磷酸鹽緩沖液，洗的磷酸鹽緩沖液，洗滌滌3次，次，5 min/次。次。l去除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的去除殘留在板

27、孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。來。l可以說在可以說在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。l封鎖：封鎖：l封鎖封鎖(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封鎖就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而防止過程。封鎖就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而防止ELISA后續(xù)步驟中抗原

28、或抗體與固相載體的直接吸附。后續(xù)步驟中抗原或抗體與固相載體的直接吸附。l常用封鎖劑：常用封鎖劑：0.05%-0.5%的的BSA; 10%的小牛血清或的小牛血清或1%明膠明膠;脫脂脫脂奶粉奶粉,比較價(jià)廉，可以高濃度運(yùn)用比較價(jià)廉，可以高濃度運(yùn)用5%。l 一切的一切的ELISA固相均需封鎖。固相均需封鎖。l孵育：孵育：l抗原抗體完成反響的保溫過程稱為孵育，通?？乖贵w完成反響的保溫過程稱為孵育，通常37孵育孵育0.5-1 h。l應(yīng)留意孵育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點(diǎn)，一應(yīng)留意孵育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測定。個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多

29、于兩塊板同時(shí)測定。l顯色：顯色：l于各反響孔參與暫時(shí)配制的于各反響孔參與暫時(shí)配制的TMB底物溶液底物溶液0.1 ml，37反響反響10-30 min。l顯色是酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反響。反響的溫度顯色是酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反響。反響的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的要素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可堅(jiān)持無色，和時(shí)間仍是影響顯色的要素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可堅(jiān)持無色，而陽性孔那么隨時(shí)間的延伸而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加而陽性孔那么隨時(shí)間的延伸而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)展。速顯色進(jìn)展。l結(jié)果測定：結(jié)果測定：l于各反響孔參與于各反響孔參與2M硫酸硫酸0.05 ml，終止

30、反響；拭干板底附著的液體，終止反響；拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀中。于然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀中。于450 nm處，以空白孔調(diào)零后處，以空白孔調(diào)零后測定各孔測定各孔OD值。值。l結(jié)果斷定：結(jié)果斷定：l目測定性法：參與底物經(jīng)酶解和終止反響后，肉眼察看目測定性法：參與底物經(jīng)酶解和終止反響后，肉眼察看陽性孔顏色明顯深于陽性孔顏色明顯深于(競爭法那么淺于競爭法那么淺于)陰性對(duì)照；與陰陰性對(duì)照；與陰性對(duì)照的顏色接近者，斷定為陰性。性對(duì)照的顏色接近者，斷定為陰性。l以以P/N值值(陽性孔陽性孔OD值值/陰性孔陰性孔OD值值)大于或等于大于或等于2.1為陽為陽性；性；P/N值小于值小于2

31、.1，但大于，但大于1.5為可疑；為可疑；P/N小于小于1.5為陰為陰性。性。 對(duì)照設(shè)定對(duì)照設(shè)定l陽性對(duì)照和陰性對(duì)照是檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也是作為判別結(jié)果的對(duì)照。l陽性對(duì)照的根本組成應(yīng)盡量與檢測標(biāo)本的組成一致，多以含蛋白維護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)。l陰性對(duì)照品須先行檢測確定不含待測物質(zhì)。l參考規(guī)范品：定量測定應(yīng)含有制造規(guī)范曲線用的參考規(guī)范品，應(yīng)包括覆蓋可檢測范圍的4-5個(gè)濃度。ELISA的運(yùn)用的運(yùn)用lELISA運(yùn)用的范圍很廣，而且正在不斷地?cái)U(kuò)展，原那么上ELISA可用于檢測一切抗原、抗體及半抗原，可以直接定量測定體液中的可溶性抗原。 l檢查抗原和半抗原方面：在內(nèi)分泌方面曾經(jīng)用于檢測雌性激素、

32、絨毛膜促性腺激素、黃體素、胰島素、皮質(zhì)醇、促甲狀腺素和孕酮等，其敏感性與RIA相當(dāng)，在血液學(xué)方面可用于檢查凝固因子如第凝固因子、紅細(xì)胞抗原及結(jié)合球蛋白Hapto Globin等，在腫瘤方面已試用檢查甲胎蛋白AFP癌胚抗原CEA。l檢查抗體方面：用ELISA間接法檢查抗體，已獲得對(duì)多種傳染病和寄生蟲病的血清學(xué)診斷，亦開場廣泛用于現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查。在寄生蟲病方面，它用于對(duì)瘧原蟲、阿米巴、利日曼原蟲、錐蟲、血吸蟲、囊蟲、弓漿蟲、肺吸蟲、肝吸蟲、血絲蟲、旋毛蟲病等血清學(xué)診斷；在免疫性疾病方面有試用作本身疫病抗體測定以及對(duì)過敏的診斷，例如檢測各種過敏原的抗體、DNA抗體及甲狀腺球蛋白抗體，紅斑性痕瘡抗體

33、等等；在衛(wèi)生學(xué)方面，可用于檢測食品中葡萄球菌腸毒素及沙門氏菌毒素等等。 免疫印跡免疫印跡western blot印跡法blotting是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測反響來檢測樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜NC膜上，并利用DNADNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對(duì)RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)展印跡分析，對(duì)RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對(duì)單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。 埃德溫邁勒薩瑟恩 Edwin

34、 Mellor Southern 根本原理根本原理運(yùn)用范圍運(yùn)用范圍l檢測組織、細(xì)胞中蛋白的表達(dá)情況定性、半定量6.最后加上相應(yīng)的底物溶液，當(dāng)二抗上的酶催化底物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光時(shí),用X光片曝光，洗片后就會(huì)產(chǎn)生可見的區(qū)帶，指示目的蛋白質(zhì)的位置和強(qiáng)弱。3.經(jīng)過電泳將蛋白樣品分開。5.印跡首先用封鎖液如5的脫脂奶粉處置以封鎖固相載體上剩余的疏水結(jié)合位點(diǎn)，而后用目的蛋白的抗血清一抗孵育，印跡中只需目的蛋白質(zhì)與一抗特異性結(jié)合。洗去游離的一抗后，用再與酶標(biāo)志的二抗孵育4.將電泳分別的蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體.轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜就稱為一個(gè)印跡blot，用于對(duì)蛋白質(zhì)的進(jìn)一步檢測。1.提取細(xì)胞或組織蛋白，測定

35、總蛋白濃度2.測定總蛋白濃度，并處置樣品根本步驟根本步驟細(xì)胞總蛋白的提取細(xì)胞總蛋白的提取l提取細(xì)胞蛋白多是利用將細(xì)胞裂解、破碎、使蛋白質(zhì)釋放的原理。提取蛋白質(zhì)的方法很多， 鑒于后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)蛋白性質(zhì)的要求不同，因此很難找到一種萬能的裂解方法。n 不論采用那種方法，都應(yīng)遵照以下原那么：n 1盡能夠采用簡一方法進(jìn)展樣品處置，以防止蛋白喪失。n 2細(xì)胞和組織樣品的制備應(yīng)盡能夠減少蛋白的降解，低溫暖蛋白酶抑制劑可以減少蛋白的降解，蛋白酶抑制劑的種類很多，要根據(jù)詳細(xì)情況詳細(xì)選擇。本實(shí)驗(yàn)中選用PMSF(苯甲基磺酰氟)作為蛋白酶抑制劑。 n 3樣品裂解液應(yīng)該新穎制備，并且分裝凍存于-80。切勿反復(fù)凍融已制備好的

36、樣品。BRIPA buffer： Tris-HCl 50 mM, pH 7.4 NP-40 1% 去氧膽酸鈉 0.25% NaCl 150 mM EDTA 1 mM 目的：要獲得高豐度、高質(zhì)量的蛋白質(zhì)，以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求目的：要獲得高豐度、高質(zhì)量的蛋白質(zhì)，以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求A細(xì)胞總蛋白裂解緩沖液(100 ml)： 1 PBS 80ml Tritonx-100 1ml 去氧膽酸鈉 0.5g SDS 0.1g 補(bǔ)1PBS緩沖液至100ml. 本卷須知：本卷須知：1.留意個(gè)人防護(hù)。PMSF嚴(yán)重?fù)p害呼吸道黏膜、眼睛及皮膚，吸入、吞進(jìn)有致命危險(xiǎn)。一旦眼睛或皮膚接觸了PMSF，立刻用大量水沖洗。2.所

37、用離心機(jī)需提早預(yù)冷。3.為防止蛋白降解，一切操作應(yīng)在冰上完成。4.汲取蛋白上清液時(shí)，留意不要把沉淀吸上來。n Western Blot作為一項(xiàng)半定量實(shí)驗(yàn)技術(shù)，電泳前，必需盡量使各組 之間總蛋白量根本一致;n 蛋白質(zhì)總量缺乏能夠妨礙對(duì)目的蛋白的鑒定; 蛋白質(zhì)含量太高那么會(huì)使帶形扭曲,甚至?xí)绊懘穗娪痉椒ǖ姆直媪谝陨蟽煞矫婢売?，在進(jìn)展蛋白電泳之前，先要對(duì)提取的總蛋白進(jìn)展含量測定基于以上兩方面緣由，在進(jìn)展蛋白電泳之前，先要對(duì)提取的總蛋白進(jìn)展含量測定蛋白定量蛋白定量l目前常用的有五種經(jīng)典的方法，即定氮法、雙縮尿法Biuret法、Folin酚試劑法Lowry法、紫外吸收法以及考馬斯亮藍(lán)法Bradfo

38、rd法。其中Bradford法和Lowry法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏1020倍，比Biuret法靈敏100倍以上。定氮法雖然比較復(fù)雜，但較準(zhǔn)確，往往以定氮法測定的蛋白質(zhì)作為其他方法的規(guī)范蛋白質(zhì)。值得留意的是，這后四種方法并不能在任何條件下適用于任何方式的蛋白質(zhì)，由于一種蛋白質(zhì)溶液用這四種方法測定，有能夠得出四種不同的結(jié)果。每種測定法都不是完美無缺的，都有其優(yōu)缺陷。蛋白定量方法蛋白定量方法SDS-PAGESDS-PAGE電泳電泳lSDS 是一種離子性的外表活性劑,它有強(qiáng)離子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長碳鏈。l當(dāng) SDS 與蛋白質(zhì)混合時(shí)，它會(huì)以其碳鏈與蛋白質(zhì)的疏水性氨基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來,

39、而以磺酸根離子外露與水分子作用。大多數(shù)蛋白質(zhì)和 SDS 的平均結(jié)合量是 1:1.4 (以分量為單位),而蛋白質(zhì)結(jié)合固定比例的SDS 后 ，由于 SDS 帶強(qiáng)負(fù)電荷，使蛋白質(zhì)原先所帶電荷顯得微缺乏道,且每單位分量的蛋白質(zhì)所帶電荷一致 ，所以不同蛋白質(zhì)的遷移率大小就主要由蛋白分子大小這一主要要素決議。SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分別范圍取決于灌膠的聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度 聚丙烯酰胺凝膠的有效分別范圍 丙烯酰胺濃度(%)線性分別范圍KDa 15 10-43 12 12-60 10 20-80 7.5 36-94 5.0 57-2121.丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在聚合前具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性并容易吸附于皮膚，

40、其作器具有累積性，故稱量或配膠時(shí)應(yīng)戴手套及口罩 2.過硫酸銨會(huì)緩慢分解，應(yīng)隔周新穎配制 3.溶液中一旦參與TEMED，應(yīng)立刻混勻并快速灌注入玻璃夾槽中 4.為堅(jiān)持電泳的平衡，在無樣品孔中也應(yīng)參與適量的4蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液 5.正確銜接電泳連線負(fù)極在上，正極在下以保證蛋白由上向下方向電泳 6.電泳盡量在4冰箱中進(jìn)展本卷須知：本卷須知：轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜l凝膠電泳終了后，將凝膠上分別的蛋白條帶經(jīng)過轉(zhuǎn)移電泳方式轉(zhuǎn)印至固相支持物上，常用的固相支持物有NC 硝酸纖維素膜、尼龍膜及PVDF聚偏氟乙烯膜。l選擇膜的主要根據(jù)有：l1.膜與目的蛋白分子的結(jié)合才干也就是單位面積的膜能結(jié)合蛋白的載量l2.膜的孔徑也就是攔截

41、蛋白的大小l3.不影響后續(xù)的顯色檢測也就是適宜用于所選顯色方法，信噪比好l4.假設(shè)后繼實(shí)驗(yàn)有其他要求，比如要做蛋白測序或者質(zhì)譜分析，還要根據(jù)不同目的來挑選不同的轉(zhuǎn)移膜-濾紙濾紙凝膠凝膠膜膜濾紙濾紙+l1.轉(zhuǎn)膜液最好現(xiàn)配現(xiàn)用l2.檢查樣品凝膠能否與轉(zhuǎn)移槽的 “-側(cè)堅(jiān)持一致 ，以確保樣品蛋白由凝膠轉(zhuǎn)移至膜上 。l3.NC膜應(yīng)小心操作，防止破裂本卷須知：本卷須知：l轉(zhuǎn)移終了后，借助抗原抗體反響，利用ECL加強(qiáng)化學(xué)發(fā)光發(fā)光或DAB3,3二氨基聯(lián)苯胺顯色技術(shù)檢測目的蛋白。n ECL ECL試劑采用氧化復(fù)原反響的原理：利用二抗上標(biāo)志試劑采用氧化復(fù)原反響的原理：利用二抗上標(biāo)志 的辣根過的辣根過氧化物酶氧化物

42、酶(HRP)(HRP)，使底物發(fā)生氧化復(fù)原反響，從而產(chǎn)生化學(xué)。，使底物發(fā)生氧化復(fù)原反響，從而產(chǎn)生化學(xué)。固相免疫檢測固相免疫檢測lDAB顯色原理：DAB在HRP作用下構(gòu)成紅褐色不溶產(chǎn)物 ，從而指示目的蛋白位置及強(qiáng)弱。lECL發(fā)光相對(duì)于DAB顯色而言，具有發(fā)光耐久，靈敏度高(普通可到達(dá)pg級(jí)以上 )等優(yōu)點(diǎn)，且DAB具有致癌性。l運(yùn)用化學(xué)發(fā)光，膜可以再生檢測其他蛋白。l1.處置膜的過程中，切勿使膜干掉 否那么導(dǎo)致背景增高l2.選擇適宜的一抗及二抗?jié)舛葷舛雀卟灰欢ㄐЧ?，過高會(huì)導(dǎo)致背景變黑 l3.選擇適宜的封鎖液 假設(shè)膜需求再生，最好選用脫脂奶粉，而非BSAl4.應(yīng)思索試劑的發(fā)光強(qiáng)度及其衰滅時(shí)間，來選

43、擇適宜的曝光時(shí)間本卷須知：本卷須知：一、膜上沒有信號(hào)答：緣由有很多：1 細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞；2 細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了，必需參與PMSF或其他蛋白酶抑制劑，抑制蛋白酶活性，并且提取過程冰上操作；3 轉(zhuǎn)膜過程出現(xiàn)失誤；4 抗體或酶失活，選擇在有效期內(nèi)的試劑；5 抗體不能識(shí)別目的蛋白，多看看闡明，看該抗體能否適用于western。結(jié)果分析結(jié)果分析二、目的帶很弱答：1 標(biāo)本中靶蛋白含量低，可以加大樣品的上樣量。2 轉(zhuǎn)膜不充分，可以經(jīng)過提高轉(zhuǎn)膜電流或延伸轉(zhuǎn)膜時(shí)間來處理。3 抗體效價(jià)低，可以減少抗體的稀釋倍數(shù)，添加抗體濃度。三、膠片背景很臟，有什么處理方法？ 答：1 膜沒有均勻浸濕，P

44、VDF膜轉(zhuǎn)膜前應(yīng)該用100%甲醇將膜完全浸濕10秒，快速激活；2 膜或者緩沖液污染，拿取膜與吸水紙時(shí)要戴手套，及時(shí)改換新穎轉(zhuǎn)膜緩沖液；3 封鎖不充分，延伸封鎖時(shí)間；4抗體與封鎖劑出現(xiàn)交叉反響，檢測一抗、二抗與封鎖劑能否有交叉反響，假設(shè)有，思索改換封鎖液；5抗體濃度過高，添加抗體稀釋倍數(shù)四、條帶中出現(xiàn)單個(gè)或多個(gè)白點(diǎn)？ 答：膜和膠塊存在氣泡，轉(zhuǎn)膜時(shí)趕盡膜和膠塊之間的氣泡五、制備的凝膠不平？ 答：膠板洗刷干凈，參與試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻，溫度適宜，受熱不均勻?qū)е履z聚合不均勻，室溫較高時(shí)，操作應(yīng)迅速。六、用于western的抗體和用于ELISA的抗體有什么不同的要求？ 答：普

45、通來說用于western的抗體識(shí)別的是氨基酸序列特異性； 而用于ELISA的抗體那么要看抗原種類，有些是識(shí)別氨基酸序列特異性，有些是識(shí)別構(gòu)像特異性。所以普通根據(jù)抗體闡明書來確定。七、檢測到的抗原分子量是資料上的兩倍，是怎樣回事？ 答：抗原構(gòu)成了二聚體。增多-巰基乙醇的量，煮沸變性時(shí)間延伸，可以翻開二聚體。八、做western必需求內(nèi)參嗎？ 答：內(nèi)參起著校正總蛋白上樣量的重要作用，只需在內(nèi)參條帶根本均勻一致的情況下，目的蛋白條帶出現(xiàn)的差別才有意義,闡明確實(shí)是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的干涉要素呵斥目的蛋白量的變化，而不是加樣誤差呵斥目的條帶含量的變化.所以內(nèi)參是必需做的。 內(nèi)參即是內(nèi)部參照，對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)來

46、說普通是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白，它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，普通要選擇一個(gè)在處置要素作用的條件下蛋白含量不會(huì)發(fā)生改動(dòng)的蛋白作內(nèi)參。 內(nèi)參名稱分子量大小適用范圍Tubulin55kD胞漿和全細(xì)胞VCDA1/Porin31kD線粒體COXIV16kD線粒體Lamin B166kD細(xì)胞核TBP38kD細(xì)胞核八、非特異條帶多答：1 抗體特異性不夠，思索運(yùn)用單抗，保證抗體的特異性；2 蛋白降解，應(yīng)盡量運(yùn)用新穎制備的樣品，提取后一定要分裝，防止反復(fù)凍融。九、曝光后出現(xiàn)反像答：HRP含量過高導(dǎo)致，建議降低二抗的運(yùn)用濃度免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)immunofluorescence ，IFl定義：將

47、免疫學(xué)方法定義：將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)志技術(shù)結(jié)合起來與熒光標(biāo)志技術(shù)結(jié)合起來研討特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。研討特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。l l原理：根據(jù)抗原抗體反響的原理，先將知的抗原或抗體標(biāo)志上熒原理：根據(jù)抗原抗體反響的原理，先將知的抗原或抗體標(biāo)志上熒光素制成熒光標(biāo)志物，再用這種熒光抗體或抗原作為分子探光素制成熒光標(biāo)志物，再用這種熒光抗體或抗原作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原或抗體。在細(xì)胞或組織中構(gòu)針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原或抗體。在細(xì)胞或組織中構(gòu)成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡察看標(biāo)本，成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒

48、光顯微鏡察看標(biāo)本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出亮堂的熒光，可以看見熒光所在的熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出亮堂的熒光，可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。技術(shù)測定含量。 3T3 LinePtK1 LineNBL-6 LineRK13 LineLongitudinal FissureBlood VesselsCerebellum定位定位直接法：熒光素標(biāo)志的特異性抗直接法：熒光素標(biāo)志的特異性抗體直接與相應(yīng)抗原反響。體直接與相應(yīng)抗原反響。間接法：特異性抗體與相應(yīng)抗間接法：特異性抗體與相應(yīng)抗原反響，熒

49、光素標(biāo)志的抗抗體原反響，熒光素標(biāo)志的抗抗體再與第一抗體結(jié)合。再與第一抗體結(jié)合。 分類分類實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法l將培育好的貼壁細(xì)胞用PBS悄然漂洗2次(PBS提早置室溫)，防止細(xì)胞零落；l4%多聚甲醛室溫固定30min (靜置)；lPBS涮洗3次，然后搖床緩慢搖洗5min3次；l0.5% Triton-100室溫緩慢搖30min，涮洗3次；l用與二抗同源的血清10%，室溫緩慢搖擺封鎖1h ，置濕盒內(nèi)；l用燒杯裝PBS，涮洗玻片一次；l用紙將PBS吸干后，滴加一抗約100 ul，4度過夜，置濕盒中。鼠抗LRP161：100，兔抗p651：150；lPBS涮洗次，搖床搖洗10min次；l用紙將PBS洗干

50、后，滴加二抗羊抗鼠FITC1：200，羊抗兔5941：600,濕盒，避光！室溫h，加二抗以后一切操作均應(yīng)避光；lDAPI染核min用PBS按1：2500稀釋；lPBS涮洗次，搖床慢速搖洗10min次；l封片：甘油PBS1：1，每張片子約需13ul；l共聚焦顯微鏡察看結(jié)果或-20度保管。結(jié)果判別結(jié)果判別l設(shè)立實(shí)驗(yàn)對(duì)照設(shè)立實(shí)驗(yàn)對(duì)照: :陽性對(duì)照和陰陽性對(duì)照和陰性對(duì)照性對(duì)照l陽性細(xì)胞顯色分布陽性細(xì)胞顯色分布: :胞質(zhì)型、胞質(zhì)型、胞核型和膜外表型胞核型和膜外表型免疫學(xué)三大工具比較免疫學(xué)三大工具比較l免疫熒光免疫熒光是交融了免疫學(xué)原理抗原抗體特異性結(jié)合和熒光標(biāo)志技術(shù)，經(jīng)過熒光激發(fā)，來是交融了免疫學(xué)原理抗原抗體特異性結(jié)合和熒光標(biāo)志技術(shù)，經(jīng)過熒光激發(fā)，來對(duì)組織細(xì)胞內(nèi)抗原進(jìn)展定位、定性及定量的研討對(duì)組織細(xì)胞內(nèi)抗原進(jìn)展定位、定性及定量的研討(主要是定位主要是定位)。樣本是細(xì)胞或。樣本是細(xì)胞或組織，要在顯微鏡下察看結(jié)果，能夠出現(xiàn)膜陽性、質(zhì)陽性和核陽性。組織，要在顯微鏡下察看結(jié)果，能夠出現(xiàn)膜陽性、質(zhì)陽性和核陽性。lELISA酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)