免疫組化染色操作順序

1、精心整理免疫組織化學(xué)染色原理和操作步驟一、免疫組織化學(xué)原理免疫組織化學(xué)（ IHC）又稱免疫細(xì)胞化學(xué)，是根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的原理，應(yīng)用帶有可見(jiàn)標(biāo)記的特異性抗體作為探針，檢測(cè)組織和細(xì)胞中抗原性物質(zhì)的一種技術(shù)。免疫組化技術(shù)主要有直接法和間接法： 直接法是以標(biāo)記的一抗孵育標(biāo)本以檢測(cè)其中的抗原成分；間接法則先后加入一抗和二抗，形成抗原一抗二抗復(fù)合體以達(dá)到檢測(cè)該抗原的目的，該法因二抗的放大作用而具有較高的敏感性。間接法常用的有過(guò)氧化物酶抗過(guò)氧化物酶（PAP）法、親和素生物素過(guò)氧化物酶（ABC）法和鏈霉親和素過(guò)氧化物酶（SP）法。PAP法一抗和二抗均不標(biāo)記，避免了標(biāo)記過(guò)程對(duì)抗體活性的影響，但需要制備過(guò)氧

2、化物酶的抗體，與適量過(guò)氧化物酶混合形成PAP復(fù)合物（含 3 個(gè)酶分子和 2 個(gè)抗體分子），染色時(shí)依次加入一抗、二抗、 PAP復(fù)合物孵育標(biāo)本，最后用H2O2 和二氨基聯(lián)苯（ DAB）為底物顯示過(guò)氧化物酶，即可檢測(cè)標(biāo)本中的抗原成分。生物素為含硫的雜環(huán)單羧酸，可通過(guò)其羧基與蛋白質(zhì)中的氨基結(jié)合，從而標(biāo)記抗體和酶。親合素又稱抗生物素蛋白，與生物素有很高的親合力，1 分子親合素可結(jié)合4 分子生物素， ABC法即在此基礎(chǔ)上建立。 ABC法與 PAP法相似，一抗不標(biāo)記，二抗用生物素標(biāo)記，染色前按一定比例將親和素與生物素標(biāo)記的過(guò)氧化物酶混合，制成 ABC 復(fù)合物，并使親合素分子上至少空出一個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)。在標(biāo)

3、本孵育過(guò)一抗和二抗后，再加入 ABC 復(fù)合物使其結(jié)合到二抗的生物素上，最后加入DAB 進(jìn)行顯色。 ABC法的敏感性較 PAP法更高。圖 1.免疫組織化學(xué)基本原理示意圖（引自八年制組織學(xué)與胚胎學(xué)）SP法與 ABC法相似，其不同于 ABC法之處在于用生物學(xué)特性與親和素相似的鏈親和素標(biāo)記過(guò)氧化物酶。在標(biāo)本孵育過(guò)一抗和二抗后，加入鏈親和素標(biāo)記的過(guò)氧化物酶使其結(jié)合到二抗的生物素上，最后加入 DAB進(jìn)行顯色。與親和素相比，鏈酶親和素的結(jié)合力與親和素相似而非特異性結(jié)合較親和素低。 SP法簡(jiǎn)化了操作步驟，同時(shí)也減少了非特異性背景，是目前應(yīng)用最為廣泛的免疫綏化染色技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：1.標(biāo)本準(zhǔn)備圖 2.SP法原

4、理示意石蠟包埋組織切片：由病理室常規(guī)處理冰凍組織切片：由病理室常規(guī)處理精心整理細(xì)胞爬片：將無(wú)菌蓋玻片置于六孔板中，接種細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到60以上后取出玻片， 4%多聚甲醛固定 2h。2. 試劑準(zhǔn)備抗體選擇單克隆抗體針對(duì)單一表位，具有較高的特異性，但在該表位破壞后將得不到陽(yáng)性結(jié)果；多克隆抗體表位針對(duì)多個(gè)表位，可避免單克隆抗體的缺點(diǎn)，但是可能出現(xiàn)非特異性雜交。因此， 不論選擇單克隆還是多克隆抗體， 最好同時(shí)購(gòu)買兩個(gè)貨號(hào)的抗體， 購(gòu)買抗體時(shí)一定要明確是能夠做 IHC的抗體，抗體說(shuō)明書(shū)上必須有 IHC 測(cè)試結(jié)果。如果該分子文獻(xiàn)報(bào)道較多， 可選擇文獻(xiàn)上常用的經(jīng)典抗體。二抗試劑盒目前本實(shí)驗(yàn)室所用二抗試劑

5、盒為L(zhǎng)ifeTechnologiesHistostain-PlusKit(HRP,BroadSpectrum)，貨號(hào)85-9043，一抗反應(yīng)性有小鼠、大鼠、兔和豚鼠。DAB 試劑盒目前本實(shí)驗(yàn)室所用為加強(qiáng)型DAB 顯色試劑盒，貨號(hào)DAB-2032。其他試劑二甲苯、無(wú)水乙醇、蘇木素、中性封片樹(shù)脂、檸檬酸鈉、APES膠3. 抗體特異性驗(yàn)證所有免疫組化抗體均須Westernblot 驗(yàn)證抗體特異性，并需免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證抗原定位。4.耗材準(zhǔn)備免疫組化筆或者蠟筆、蓋玻片、載玻片5.溶液配制磷酸鹽緩沖液（ PBS）10×PBS母液配制NaCl72gNa2HPO4·12H2O37.3gKH

6、2PO44.3g加蒸餾水至 1000ml，充分混勻貯存。使用時(shí)用蒸餾水10 倍稀釋，調(diào)整 pH 值至 7.37.4。檸檬酸抗原修復(fù)液抗原修復(fù)使用檸檬酸 -磷酸氫二鈉緩沖液，配方如下：稱取檸檬酸 10.5g，溶于 500ml 蒸餾水；稱取Na2HPO4 ·12H2O57.3g，溶于 800ml 蒸餾水。分別量取 358ml 檸檬酸溶液和 642mlNa2HPO4 溶液，充分混勻后調(diào)整pH 值至 6.0，即得 2×母液，貯精心整理存?zhèn)溆谩?%鹽酸酒精濃鹽酸與 75%酒精按照 1:99 比例混合，充分混勻。三、免疫組化操作步驟1.組織片脫蠟水化將組織片依次放入3 個(gè)裝有二甲苯溶液

7、的玻璃缸中浸泡，每缸15min。依次放入 2 個(gè)裝有無(wú)水乙醇的玻璃缸，每缸5min。依次放入 2 個(gè)裝有 95%乙醇的玻璃缸，每缸5min。依次放入 90乙醇、 85乙醇、 75%乙醇的玻璃缸，每缸2min，取出。放入自來(lái)水、蒸餾水的玻璃缸中清洗，重復(fù)3 次。2.抗原修復(fù)將切片浸入 1×檸檬酸 -磷酸氫二鈉緩沖液中，高壓煮沸后繼續(xù)加熱 2min，然后停止加熱讓切片自然冷卻。注意：抗原修復(fù)過(guò)度或不足，均會(huì)影響最終染色結(jié)果。切片驟冷可致脫片，必須自然冷卻！3. 封閉內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶放入 3%H2O2 溶液的玻璃缸中，浸泡15min 。放入蒸餾水的玻璃缸中清洗，重復(fù)3 次。放入 PBS緩沖

8、液的玻璃缸中，浸泡5min 。4.抗體雜交甩去 PBS余液，將組織片平輔在濕盒中，加正常山羊血清1 滴 20l（試劑盒中的A 液，根據(jù)組織大小調(diào)整用量），28 放置 20min，甩干。加稀釋好的一抗1 滴（ 2050l，根據(jù)組織塊大小進(jìn)行調(diào)整） ，置于濕盒 4 過(guò)夜。置 PBS緩沖液的玻璃缸中，緩慢振蕩清洗 5min ，更換 PBS緩沖液，同法操作 4 次，甩干。加入生物素偶聯(lián)的二抗 2050l（試劑盒中的 B 液，根據(jù)組織塊大小進(jìn)行調(diào)整） ，放置濕盒，37 放置 20min。置 PBS緩沖液的玻璃缸中，緩慢振蕩清洗 5min ，更換 PBS緩沖液，同法操作 3 次，甩干。5.顯色加鏈親和素

9、-辣根過(guò)氧化物酶2050l（試劑盒中的 C 液，根據(jù)組織塊大小進(jìn)行調(diào)整） ，濕盒內(nèi) 28放置 520min，甩干。置 PBS緩沖液的玻璃缸中，緩慢振蕩清洗5min ，更換 PBS緩沖液，同法操作3 次，甩干。滴加新鮮配制的DAB 工作液100l（以覆蓋組織為宜） ，放置觀察反應(yīng)部位呈現(xiàn)黃褐色時(shí)精心整理（35min），置裝有自來(lái)水玻璃缸中涮洗3 次；6.復(fù)染浸入蘇木精溶液中復(fù)染， 放置 5min 后，用自來(lái)水反復(fù)涮洗至水不變色，再用 1%鹽酸酒精分化12s 后，自來(lái)水沖洗后，反藍(lán)水洗2min。7.脫水、透明和封片依次放入 95、 95乙醇溶液的玻璃缸中，每缸浸泡 5min，取出；依次放入 2 個(gè)

10、無(wú)水乙醇的玻璃缸中，每缸浸泡 5min，取出。依次放入 2 個(gè)裝有二甲苯的玻璃缸中，每缸浸泡 5min，取出。滴加適量中性樹(shù)膠，封片，晾干。8. 注意事項(xiàng)整個(gè)染色過(guò)程中組織塊要保持濕潤(rùn)，不能干片，否則會(huì)導(dǎo)致非特異性染色。組織切片邊緣易干，因此抗體、封閉液、顯色液等試劑要充分覆蓋組織塊，避免干片。四、結(jié)果判定1.陽(yáng)性細(xì)胞判斷DAB 顯色呈黃色。每批染色都要有特異性陽(yáng)性和陰性對(duì)照為基礎(chǔ)，才能對(duì)染色結(jié)果作出判斷。抗原表達(dá)必須在特定部位， 對(duì)于臨床診斷來(lái)說(shuō)， 不在抗原所在部位的陽(yáng)性著色， 一概不能視為陽(yáng)性。盡量避開(kāi)出血、 壞死及切片刀痕和界面邊緣細(xì)胞的著色多系內(nèi)源干擾或人為因素所致， 不能視為陽(yáng)性。2. 抗原表達(dá)評(píng)價(jià)免疫顯色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞密度是定性定量指標(biāo)， 實(shí)際工作