中藥防治雞汞中毒機理研究

1、中藥防治雞汞中毒機理研究（技術(shù)路線）1材料1.1試驗動物及樣品1.1.1汞礦周圍采集的樣品分別在汞礦區(qū)附近楊家灣，張家坪等村莊采集土壤、水；蘿卜、玉米、大米和白菜等蔬菜各500g；當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶籠養(yǎng)的雞、鴨各3只，豬、牛、羊分別取一頭，采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉各500g。 1.1.2 試驗性汞中毒動物試驗動物為200只脫溫雞苗，購于貴陽市花溪區(qū)三橋某禽苗批發(fā)公司。檢疫并觀察一周后投入實驗。1.2主要藥物與試劑 中藥：黃芪、甘草、茯苓、白茅根、白術(shù)、山藥、蒲公英等購自貴州省貴陽市花溪區(qū)中醫(yī)院汞標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100g/mL，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）硝酸（優(yōu)級純，含量 65.0-68.0%，國藥集團(tuán)

2、化學(xué)試劑有限公司）30%過氧化氫（優(yōu)級純，天津市東方化工廠）氦氣（青島合利氣體有限公司）二甲苯 (重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司)無水乙醇 (重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司)蘇木素 (武漢博士德生物工程公司)多聚甲醛 (天津市同鑫化工廠)中性樹膠 (中杉金橋生物公司)石蠟 (熔點：57-61，上海標(biāo)本模型廠)SOD 超氧化物歧化酶（鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司)GSH-PX 谷胱甘肽過氧化物酶（鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司)MDA 丙二醛（鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司)AST 谷草轉(zhuǎn)氨酶（鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司)1.3主要試驗器材SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺 (蘇州凈化設(shè)備有限公司)PE-6800V

3、ET全自動血細(xì)胞分析儀（深圳市普康電子有限公司）TGL-20M臺式冷凍離心機（長沙湘儀貝克儀器儀表有限公司）Scanspeed微型臺式離心機（丹麥Labogene公司）BS110S電子天平（德國SARTORIUS ）Leica RM2125切片機（德國徠卡公司）MDF-382E -80低溫冰箱（SANYO公司）BCD-215KC F海爾冰箱（青島海爾股份有限公司）OLYMPUS CH20BIMF200顯微鏡（日本OLYMPUS 光學(xué)有限公司）PHS-3S酸度計（上海虹益儀器儀表有限公司）微波消解萃取儀 (上海新儀微波化學(xué)科技有限公司)ECH-1型電子控溫加熱板 (上海新儀微波化學(xué)科技有限公司)

4、LD4-2A離心機（北京醫(yī)用離心機廠）AFS-9130 雙道原子熒光光度計（北京吉天儀器有限公司）Sartorius 電子天平（德國賽多利斯公司）ICP-MS電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(Inductively coupled plasma mass spectrometry)（北京吉天）2方法2.1汞礦周圍環(huán)境及畜禽體內(nèi)汞含量調(diào)查2.1.1樣品采集與處理2.1.1.1土壤采集與處理采集：土壤采用4分法則采集，每個樣品從5m x 5m的正方形4個頂點和中心點共5處各采集1kg的表層土壤（0-20cm），均勻混合后用4分法從中選取1kg土壤，代表該點的混合樣品。樣品用聚乙烯塑料袋編號封裝保存，防止交叉

5、污染。處理：樣品帶回實驗室后，除去所采樣品中石子，植物及其它雜質(zhì)，充分風(fēng)干后取部分樣品，研缽搗碎研磨，過100目尼龍篩，在40烘箱中干燥24 h后干燥器皿中保存?zhèn)溆?；將土壤樣?.0g置于250ml錐形瓶中，用少量蒸餾水潤濕，加入硫酸-硝酸混合液10.0mL，待劇烈反應(yīng)停止后，加入去離子水15mL，在瓶口插一玻璃漏斗，置于水浴鍋中加熱至80，保持60min，同時做空白對照。待加熱完成后，降至室溫，將試液（含殘渣）全部移入100mL容量瓶中，用去離子水洗滌錐形瓶3-5次，洗滌液并入容量瓶，加去離子水至標(biāo)線，搖勻，待測。2.1.1.2 水體采集與處理采集：采用孔徑為0.04um醋酸纖微濾膜現(xiàn)場對水

6、樣進(jìn)行過濾，過濾水樣裝入500mL經(jīng)預(yù)先處理的超凈聚乙烯瓶保存。在采集樣品之前所使用的所有器皿必須先用樣品水洗滌，潤洗，至少3次后再將樣品水裝入瓶中。采樣操作過程中均使用一次性聚乙烯手套，盡可能減少操作過程中帶入的人為汞污染。處理：帶回實驗室后加5.0mL12mol/L HCl，置于0-4保存，待測。2.1.1.3 動物樣品及農(nóng)作物的采集與處理采集：選擇礦區(qū)附近農(nóng)田中水稻（去殼，取其中大米）、玉米（去外包葉和玉米棒，取其中玉米粒）和蔬菜（帶回實驗室后先用高純水沖洗表面，在100級潔凈工作臺里室溫下進(jìn)行干燥），然后密封于3層聚乙烯樣品袋中，編號，冷凍保存直到分析；雞、鴨、豬、牛、羊分別采集肝臟、

7、心臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉等分裝入預(yù)先處理的聚乙烯袋中，分別標(biāo)記，-20保存。處理：將已標(biāo)記的動物樣品及農(nóng)作物分別磨碎，稱取約0.2g（準(zhǔn)確至0.0001g）經(jīng)磨碎的樣品，置于耐高溫壓力消解罐底部，加入5mL濃硝酸（分析純），3mL過氧化氫（分析純），搖勻，將消解罐密封后置于高溫高壓微波消解儀中消解。消解結(jié)束后，移出消解儀，待消解罐完全冷卻后再開啟。將消解罐中的消解液全部移至50mL的容量瓶中，用蒸餾水仔細(xì)沖洗罐蓋及罐壁，將洗液混入容量瓶里的消解液中，最后用蒸餾水定容至刻度，混勻，待測。試驗中所有玻璃器皿均以20%硝酸溶液浸泡24h，用純水反復(fù)沖洗，最后用超純水沖洗晾干后，方可使用。2.1.

8、2汞含量測定方法所有樣本中汞（Hg）的檢測均參照 GB/T 5009.17-2003原子熒光光譜法計進(jìn)行測定?？瞻讓φ粘患尤氪郎y試樣外，其他均按上述步驟操作。2.1.2.1原子熒光光度法測定原理和步驟測定原理：原子熒光是原子蒸汽受到具有特征波長光源照射后，其中一些自由原子被激發(fā)躍遷到較高能態(tài)，然后躍遷回到某一較低能態(tài)（常是基態(tài)）而發(fā)射出特征光譜的物理現(xiàn)象。當(dāng)激發(fā)輻射的波長與產(chǎn)生熒光的波長相同時，稱為共振熒光，它是原子熒光分析中最主要的分析線。另外還有直躍線熒光、階躍線熒光、敏化熒光、階躍激發(fā)熒光等。各種元素都有其特定的原子熒光光譜，根據(jù)原子熒光強度的高低可測定試樣中待測元素的含量。測定步驟：

9、(1) 開機準(zhǔn)備實驗室應(yīng)保持在溫度 1530，濕度 45%70%之間：開啟排風(fēng)機，使室內(nèi)保持通風(fēng)狀態(tài)。打開原子化器室前門，檢查氣液分離器中水封，需要及時加水；檢查蠕動泵及壓塊，確保各泵管無泄漏，泵管與壓塊間足夠潤滑，否則滴加適量潤滑油。檢察元素?zé)簦_定為待測元素?zé)?，否則更換。更換元素?zé)魰r，一定要在主機電源關(guān)閉的情況下進(jìn)行，不得帶電拔插。開啟載氣鋼瓶減壓閥，使次級閥壓力小于0.3MPa，控制在0.25MPa- 0.28 MPa范圍內(nèi)。(2) 操作運行接通電源，順序開啟電腦、原子熒光光度計主機電源。檢察元素?zé)艄獍呤欠窬劢褂谥行奈恢?，否則將調(diào)光器放在石英原子化爐上，按照正確方法調(diào)節(jié)元素?zé)糁辆劢埂｜c擊

10、電腦桌面上的“AFS-9130 原子熒光光度計”圖標(biāo)，運行操作軟件，儀器自檢。在“元素表”菜單進(jìn)行元素?zé)舻淖R別與選擇后，單擊“確定”退出對話框。點擊“點火”點燃原子化爐，預(yù)熱30min。將載流、標(biāo)準(zhǔn)空白、標(biāo)準(zhǔn)樣品系列、樣品空白、管理樣品、未知樣品溶液等配置完畢后，按照一定順序放置在自動進(jìn)樣器的樣品盤內(nèi)。根據(jù)分析方法的需要，對“儀器條件”，“標(biāo)準(zhǔn)系列”和“樣品參數(shù)”等內(nèi)容進(jìn)行相關(guān)參數(shù)的設(shè)置。然后點測量。測量完畢后，將載流液和還原液換成蒸餾水，點擊“清洗程序”，對管道行兩次清洗。所有操作完成后，點擊“熄火”，將原子化爐熄滅后，退出軟件，關(guān)閉原子熒光光度計主機電源及電腦，打開蠕動泵壓塊，放松泵管。2

11、.1.2.2結(jié)果計算按式（1）計算試樣中待測元素的含量：Xi=(Ci- Cio)×v/m×100（1）式中：Xi：試樣中元素的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；Ci：從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得試樣溶液中各被測元素的濃度，單位為微克每升（g/L）；Cio：從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得空白溶液中被測元素的濃度，單位為微克每升（g/L）；V：測試溶液的體積，單位為毫升（mL）；m：試樣的質(zhì)量，單位為克（g）。2.2中藥防治雞汞中毒的試驗研究2.2.1汞致試驗雞半數(shù)致死量LD50的測定 （1）致死量的確定按汞的國家標(biāo)準(zhǔn)值（Hg0.05mg/kg）的6000倍劑量：(300mg/kg)給藥，觀察4h，

12、篩選出致死劑量。（2）半數(shù)致死量的確定以致死劑量開始，往下按0.7倍的遞減劑量分組，相鄰兩個劑量的對數(shù)之差相同。實驗先從大劑量開始，于第一只動物用藥后，如果發(fā)生死亡，在表中以“f”記錄，下一只動物就降低一級劑量給藥；相反，如果動物存活，下一只動物就用高一級劑量。依此類推。最后一只動物，雖未進(jìn)行實驗，但在表格內(nèi)仍占位置，以符號表示。一般以出現(xiàn)不死劑量的向前于第2個死亡劑量為起始劑量，于第一次出現(xiàn)不死劑量為中心劑量。根據(jù)LD50公式（ LD50 =lg-1 C/n( mg/kg)）計算出半數(shù)致死量2.2.2實驗性雞汞中毒最佳劑量篩選從購買的健康雞苗中，選取體重均勻的32只，隨機分為4組，每組8只，

13、分為4組： 1/16 LD50、1/8 LD50、1/4 LD50、1/2 LD50、空白對照組僅喂基礎(chǔ)日料，自由飲用自來水；實驗組喂（基礎(chǔ)日糧+1/16 LD50）、（基礎(chǔ)日糧+1/8 LD50）、（基礎(chǔ)日糧+1/4 LD50）、（基礎(chǔ)日糧+1/2 LD50），自由飲自來水。觀察臨床表現(xiàn)，實驗期共計15天。于第15d后，宰殺實驗雞，采集血液，檢測血清中生化指標(biāo)；取其肝臟、腎臟、脾臟觀察病理學(xué)變化。2.2.3中藥最適劑量篩選2.2.3.1 中藥制備把準(zhǔn)備好的中藥飲片裝入粉碎機進(jìn)行粉碎，然后過100目篩，以“階梯分配法”，均勻的混在飼料中，備用。2.2.3.2中藥劑量篩選從購買的健康雞苗中，選取

14、體重均勻的32只，隨機分為4組，每組8只，分別為每天2g中藥/只、每天4g中藥/只、每天6g中藥/只、每天8g中藥/只、空白對照組僅喂基礎(chǔ)日料，自由飲用自來水；實驗組分別喂（基礎(chǔ)日糧+2g中藥+36mg/kg HgCl2）、(基礎(chǔ)日糧+4g中藥+36mg/kg HgCl2)、(基礎(chǔ)日+6g中藥+36mg/kg HgCl2)、(基礎(chǔ)日糧+8g中藥+36mg/kg HgCl2），飲用自來水。觀察臨床表現(xiàn)，實驗期共計15天。15d后，宰殺實驗雞，采集血液，檢測血清中生化指標(biāo)；取其肝臟、腎臟、脾臟觀察臟器指數(shù)變化。2.2.4防治試驗動物分組與處理從購買的200只脫溫雞苗中選出健康、體重大小與個體差異均

15、衡的雞苗72只，隨機均分為3組，每組24只，分別設(shè)空白對照組，陽性對照組和中藥治療組?？瞻讓φ战M飼僅喂基礎(chǔ)日糧；陽性對照組喂(基礎(chǔ)日糧+36mg/kgHgCl2 )；中藥治療組喂(基礎(chǔ)基日糧+6g中藥+36mg/kgHgCl2 )，各組自由飲用自來水，分籠常規(guī)飼養(yǎng)，試驗期共計60d，試驗期內(nèi)觀察試驗雞的臨床表現(xiàn)。 2.2.5防治試驗樣品采集與處理試驗于第20d、40d、60d時，分別禁食12h，每組隨機選取8只雞稱重，采用頸動脈采血法采集血液，將血液分別裝入無添加劑與有添加劑的采血管，并作記錄。無添加劑管在室溫下靜置30分鐘，2000-3000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，收集上清液并分裝后置-80保存

16、，用于SOD、GSH-PX、AST及MDA的測定；有添加管血液采集后，在6h內(nèi)進(jìn)行血細(xì)胞成分分析。采血后，雞只頸總動脈放血處死，分離肝、脾、腎等臟器，剔除臟器表面的脂肪和筋膜，用濾紙吸凈表面的血液后（心臟處理：在大血管出入處剪斷血管，用濾紙吸取心臟內(nèi)殘血），電子天平稱量各臟器重量（左右腎合并稱重）。臟器稱重后，取5mm×5mm×3mm的腎臟、肝臟等組織塊置于10%福爾馬林磷酸鹽緩沖液中固定。剩余組織器官分別裝入已編號的聚乙烯塑料袋中，置于-20保存測定汞含量。2.2.6汞對試驗雞部分臟器指數(shù)的影響取實驗動物肝臟、脾臟、腎臟，并稱重，記錄。用下式進(jìn)行計算：臟器系數(shù)=臟器重（g

17、）/體重（g）2.2.7病理組織學(xué)切片制作(1)取材及固定：將取出的組織固定于中性福爾馬林中，時間為3d。(2)切片制作：取出在中性福爾馬林中固定好的組織沖水過夜（12h以上）經(jīng)70%、80%、95%、95%、100%梯度酒精逐級脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，5微米連續(xù)切片，37水浴中展片，將展好的蠟帶粘附與載玻片上，制成切片。(3)HE染色步驟：將制好的切片，置于58恒溫箱中烤片4-6h后，于二甲苯中脫蠟，經(jīng) 100%、95%、85%、75%酒精逐級脫蠟后，置于純水中3-5 min后經(jīng)蘇木素染色5min,水洗，用1%鹽酸乙醇分化2-3s，1%氨水返藍(lán)2-3s，水洗，伊紅染色2min，水洗

18、，再經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明后，中性樹膠封片，最后置于光學(xué)顯微鏡下觀察，并拍照2.2.8血細(xì)胞成分分析采血后6h內(nèi)用血細(xì)胞成分分析儀檢測各組雞只血樣中白細(xì)胞(WBC)、淋巴細(xì)胞(LYM)、中間細(xì)胞(MID)、粒細(xì)胞(GRAN)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞平均體積(MCV)、紅細(xì)胞分布寬度SD(RDW-SD)、紅細(xì)胞分布寬度CV(RDW-CV)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、平均血紅蛋白含量(M CH)和平均血紅蛋白濃度(MCHC)等指標(biāo)2.2.9氧化還原相關(guān)指標(biāo)檢測細(xì)胞因子SOD、GSH-PX、AST及MDA的測定均用酶聯(lián)免疫分析（ELISA）法。按試劑盒操作方法進(jìn)行，具體操作步驟

19、如下：（1）標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包裝板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品空10孔，于第一、于第二孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品100ul，然后在于第一、于第二孔加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；然后從于第一、于第二孔各取100ul分別加到于第三孔和于第四孔，再在于第三、于第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；然后在于第三孔和于第四孔中先各取50ul棄掉，再各取50ul分別加到于第五、于第六孔中，再在于第五、于第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；混勻后從于第五、于第六孔中各取50ul分別加到于第七、于第八孔中，再在于第七、于第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；混勻后從于第七、于第八孔中各取50ul分別加到于第九、于第十

20、孔中，再在于第九、于第十孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；混勻后從于第九、于第十孔中各取50ul棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50l，GSH-PX濃度分別為600U/L，400 U/L ，200 U/L，100 U/L，50 U/L；AST濃度分別為24U/L，16U/L ，8U/L，4U/L， 2U/L；SOD濃度分別為150U/L，100U/L ，50U/L，25U/L， 12.5U/L；MDA濃度分別為6mmol/L，4mmol/L ，2mmol/L，1mmol/L， 0.5mmol/L）（2）加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測