單線態(tài)和三線態(tài)

1、1光譜分析光譜分析原子光譜原子光譜原子吸收原子吸收原子發(fā)射原子發(fā)射原子原子熒光熒光分子分子光譜光譜分子分子吸收吸收紫外紫外- -可見(jiàn)光譜可見(jiàn)光譜紅外光譜紅外光譜分子發(fā)光分子發(fā)光2第二章第二章 分子發(fā)光分析分子發(fā)光分析分子分子吸收吸收能量能量激發(fā)為激發(fā)態(tài)激發(fā)為激發(fā)態(tài)釋放出釋放出能量能量基態(tài)基態(tài)電能電能化學(xué)能化學(xué)能光能光能稱為稱為“發(fā)光發(fā)光”光的形式釋放光的形式釋放熒光熒光磷光磷光分子發(fā)光分子發(fā)光光致發(fā)光光致發(fā)光化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光輻射躍遷輻射躍遷非輻射躍遷非輻射躍遷以熱的形式釋放以熱的形式釋放 分子熒光分析法分子熒光分析法一、基本原理一、基本原理（一）熒光和磷光的產(chǎn)生（一）熒光和磷光的產(chǎn)生 從分子結(jié)

2、構(gòu)理論來(lái)討論從分子結(jié)構(gòu)理論來(lái)討論3分子中電子分子中電子的能量狀態(tài)的能量狀態(tài)電子所處的能級(jí)電子所處的能級(jí)振動(dòng)能級(jí)振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)電子的多重態(tài)電子的多重態(tài)J=2S+1S：為各電子自旋量子為各電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和數(shù)的代數(shù)和S=0, J=1 單重態(tài)單重態(tài)S表示表示（所有電子都是自旋配對(duì)的）（所有電子都是自旋配對(duì)的）S=1, J=3三重態(tài)三重態(tài) T表示表示大多數(shù)基態(tài)分子都處于單重態(tài)大多數(shù)基態(tài)分子都處于單重態(tài)電子在躍遷過(guò)程中伴隨著電子在躍遷過(guò)程中伴隨著自旋方向的變化（自旋平行）自旋方向的變化（自旋平行）4基態(tài)單重態(tài)S 激發(fā)態(tài)單重態(tài)S 激發(fā)態(tài)三重態(tài)T 激發(fā)單重態(tài)激發(fā)單重態(tài)S與激發(fā)三重態(tài)與激發(fā)三重態(tài)

3、T的不同點(diǎn)：的不同點(diǎn)： S是抗磁分子，是抗磁分子，T是順磁分子是順磁分子 tS = 10-8s, tT = 10-41s；(發(fā)光速度很慢) 基態(tài)單重態(tài)到激發(fā)單重態(tài)的激發(fā)為允許躍遷，基態(tài)單重態(tài)到激發(fā)單重態(tài)的激發(fā)為允許躍遷， 基態(tài)單重態(tài)到激發(fā)三重態(tài)的激發(fā)為禁阻躍遷；基態(tài)單重態(tài)到激發(fā)三重態(tài)的激發(fā)為禁阻躍遷； 激發(fā)三重態(tài)的能量較激發(fā)單重態(tài)的能量低激發(fā)三重態(tài)的能量較激發(fā)單重態(tài)的能量低5其中其中S0、S1和和S2分別表示分子的基態(tài)、第一和第二電子激發(fā)的單重態(tài)分別表示分子的基態(tài)、第一和第二電子激發(fā)的單重態(tài)T1和和T2則分別表示分子的第一和第二電子激發(fā)的三重態(tài)。則分別表示分子的第一和第二電子激發(fā)的三重態(tài)。V=

4、0、1、2、3、表示基態(tài)和激發(fā)態(tài)的振動(dòng)能級(jí)。表示基態(tài)和激發(fā)態(tài)的振動(dòng)能級(jí)。 2分子內(nèi)的光物理過(guò)程 6S0S1S2T1吸光1吸光2振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫:在同一電子能級(jí)在同一電子能級(jí)中，電子由高振中，電子由高振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)至低振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)至低振動(dòng)能級(jí)，而將多動(dòng)能級(jí)，而將多余的能量以余的能量以熱熱 的的形式發(fā)出。形式發(fā)出。發(fā)生發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)振動(dòng)弛豫的時(shí)間為間為10-12s數(shù)量數(shù)量級(jí)級(jí)。非輻射能量傳遞過(guò)程；非輻射能量傳遞過(guò)程；7S0S1S2T1吸光1吸光2內(nèi)轉(zhuǎn)移內(nèi)轉(zhuǎn)移: 當(dāng)當(dāng)兩個(gè)電子能級(jí)兩個(gè)電子能級(jí)非常靠近以至其振動(dòng)能級(jí)有非?？拷灾疗湔駝?dòng)能級(jí)有重重 疊疊時(shí)，時(shí)， 常發(fā)生電子由高能級(jí)以常發(fā)生電子由高能級(jí)以無(wú)輻射

5、躍遷方式無(wú)輻射躍遷方式轉(zhuǎn)移至低能級(jí)。轉(zhuǎn)移至低能級(jí)。（S1 轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移 S2）8S0S1S2T1吸光1吸光2熒光3系間竄躍系間竄躍: 指指不同多重態(tài)間不同多重態(tài)間的的無(wú)輻射躍遷無(wú)輻射躍遷， 例如例如S1T1就是一就是一種系間竄躍。種系間竄躍。 通常，發(fā)生系間通常，發(fā)生系間竄躍時(shí)，電子由竄躍時(shí)，電子由S1的較低振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)的較低振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)移至移至T1的較高振動(dòng)的較高振動(dòng)能級(jí)處。能級(jí)處。9輻射能量傳遞過(guò)程輻射能量傳遞過(guò)程熒光發(fā)射熒光發(fā)射:電子由電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)基態(tài) S0S1S2T1吸光1吸光2熒光3熒光熒光得到最大波長(zhǎng)為得到最大波長(zhǎng)為3 3的熒光的熒光由

6、圖可見(jiàn)，發(fā)射熒光的能量由圖可見(jiàn)，發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小比分子吸收的能量小 3 3 2 110磷光發(fā)射磷光發(fā)射: 電子由基態(tài)單重態(tài)激發(fā)至第一電子由基態(tài)單重態(tài)激發(fā)至第一激發(fā)三重態(tài)的幾率很小，因?yàn)檫@激發(fā)三重態(tài)的幾率很小，因?yàn)檫@是禁阻躍遷。是禁阻躍遷。 但是，由第一激發(fā)單重態(tài)的最但是，由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，有可能以系間竄躍低振動(dòng)能級(jí)，有可能以系間竄躍方式轉(zhuǎn)至第一激發(fā)三重態(tài)，再經(jīng)方式轉(zhuǎn)至第一激發(fā)三重態(tài)，再經(jīng)過(guò)振動(dòng)馳豫，轉(zhuǎn)至其最低振動(dòng)能過(guò)振動(dòng)馳豫，轉(zhuǎn)至其最低振動(dòng)能級(jí)，由此激發(fā)態(tài)躍回至基態(tài)時(shí)，級(jí)，由此激發(fā)態(tài)躍回至基態(tài)時(shí)，便發(fā)射磷光，便發(fā)射磷光， 這個(gè)躍遷過(guò)程（這個(gè)躍遷過(guò)程（T1S0）也是

7、也是自旋禁阻的，其發(fā)光速率較慢，自旋禁阻的，其發(fā)光速率較慢，約為約為10-4-10s。因此，這種躍遷所因此，這種躍遷所發(fā)射的光，發(fā)射的光，在光照停止后，仍可在光照停止后，仍可持續(xù)一段時(shí)間持續(xù)一段時(shí)間。S0S1S2T1吸光1吸光2熒光3磷光磷光磷光外轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移 指激發(fā)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子指激發(fā)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子的相互作用及能量轉(zhuǎn)移，使熒光或磷光強(qiáng)的相互作用及能量轉(zhuǎn)移，使熒光或磷光強(qiáng)度減弱甚至消失。這一現(xiàn)象稱為度減弱甚至消失。這一現(xiàn)象稱為“熄滅熄滅”或或“猝滅猝滅”。 熒光與磷光的根本區(qū)別：熒光與磷光的根本區(qū)別： 11磷光磷光是由是由激發(fā)三重態(tài)激發(fā)三重態(tài)最低振動(dòng)能層至基態(tài)最低振動(dòng)

8、能層至基態(tài)熒光熒光是由激發(fā)是由激發(fā)單重態(tài)單重態(tài)最低振動(dòng)能層至基態(tài)最低振動(dòng)能層至基態(tài)區(qū)別區(qū)別(二二 )熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜 激發(fā)光譜激發(fā)光譜:(ex)以不同波長(zhǎng)的入射光激發(fā)熒光物質(zhì)以不同波長(zhǎng)的入射光激發(fā)熒光物質(zhì),在熒在熒光最強(qiáng)的波長(zhǎng)處測(cè)量熒光強(qiáng)度光最強(qiáng)的波長(zhǎng)處測(cè)量熒光強(qiáng)度 即以激發(fā)光波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)即以激發(fā)光波長(zhǎng)為橫坐標(biāo),以熒光強(qiáng)度為以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制縱坐標(biāo)繪制曲線即可得到激發(fā)光譜曲線曲線即可得到激發(fā)光譜曲線。發(fā)射光譜：發(fā)射光譜：(em)固定激發(fā)光波長(zhǎng)（最大）固定激發(fā)光波長(zhǎng)（最大）然后測(cè)定不同的波長(zhǎng)時(shí)所發(fā)射的熒光強(qiáng)度然后測(cè)定不同的波長(zhǎng)時(shí)所發(fā)射的熒光強(qiáng)度即可繪制熒光發(fā)射

9、光譜曲線即可繪制熒光發(fā)射光譜曲線12在熒光的產(chǎn)生過(guò)程中，由于存在各種形在熒光的產(chǎn)生過(guò)程中，由于存在各種形式的無(wú)輻射躍遷，損失能量，所以它們的式的無(wú)輻射躍遷，損失能量，所以它們的最大發(fā)射波長(zhǎng)都向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，以磷光最大發(fā)射波長(zhǎng)都向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，以磷光波長(zhǎng)的移動(dòng)最多，而且它的強(qiáng)度也相對(duì)較波長(zhǎng)的移動(dòng)最多，而且它的強(qiáng)度也相對(duì)較弱。弱。131415激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系a. Stokes位移位移 激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差值。發(fā)射光譜的波長(zhǎng)比激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差值。發(fā)射光譜的波長(zhǎng)比激發(fā)光譜的長(zhǎng)，振動(dòng)弛豫消耗了能量。激發(fā)光譜的長(zhǎng)，振動(dòng)弛豫消耗了能量。 b. 發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)發(fā)射

10、光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān) 電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量(如能級(jí)如能級(jí)圖圖 2 , 1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低最低振動(dòng)能級(jí)振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到再躍遷回到基態(tài)基態(tài)，產(chǎn)生波長(zhǎng)一定的熒光，產(chǎn)生波長(zhǎng)一定的熒光c. 鏡像規(guī)則鏡像規(guī)則 通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對(duì)稱關(guān)系。樣）成鏡像對(duì)稱關(guān)系。 （三）（三）熒光的影響因素 分子產(chǎn)生熒光必須具備兩個(gè)條件：分子產(chǎn)生熒光必須具備兩個(gè)條件： 分子必須具有與所照射的輻射

11、頻分子必須具有與所照射的輻射頻率率(紫外紫外-可見(jiàn)光）相適應(yīng)的結(jié)構(gòu)（共可見(jiàn)光）相適應(yīng)的結(jié)構(gòu)（共軛雙鍵）軛雙鍵），才能吸收激發(fā)光；，才能吸收激發(fā)光； 吸收了與其本身特征頻率相同的吸收了與其本身特征頻率相同的能量能量之后，必須具有一定的熒光量之后，必須具有一定的熒光量子產(chǎn)率。子產(chǎn)率。161.熒光效率熒光效率 它表示物質(zhì)它表示物質(zhì)發(fā)射熒光的能力發(fā)射熒光的能力，通常用下，通常用下式表示式表示 17 f發(fā)熒光的分子數(shù)激發(fā)分子的總數(shù)熒光效率越高；熒光效率越高；物質(zhì)物質(zhì)發(fā)射熒光發(fā)射熒光越強(qiáng)越強(qiáng)fffiKKKkf為熒光發(fā)射過(guò)程的速率常數(shù)（為熒光發(fā)射過(guò)程的速率常數(shù)（與化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)）與化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)） ki為其它有

12、關(guān)過(guò)程的速率常數(shù)的總和（為其它有關(guān)過(guò)程的速率常數(shù)的總和（化學(xué)環(huán)境）化學(xué)環(huán)境）凡使凡使kf 值升高而使值升高而使ki值降低的因素，都可增強(qiáng)熒光。值降低的因素，都可增強(qiáng)熒光。2. 熒光與有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)的關(guān)系熒光與有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)的關(guān)系（1）躍遷類型）躍遷類型 實(shí)驗(yàn)證明，對(duì)于大多數(shù)熒光物質(zhì)，首先經(jīng)歷實(shí)驗(yàn)證明，對(duì)于大多數(shù)熒光物質(zhì)，首先經(jīng)歷 激發(fā)，然后經(jīng)過(guò)振動(dòng)弛豫或其他無(wú)輻射躍激發(fā)，然后經(jīng)過(guò)振動(dòng)弛豫或其他無(wú)輻射躍遷，再發(fā)生遷，再發(fā)生 躍遷而得到熒光。躍遷而得到熒光。 （2）共軛效應(yīng)）共軛效應(yīng)實(shí)驗(yàn)證明，容易實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)證明，容易實(shí)現(xiàn) 激發(fā)激發(fā) 的芳香族化合物的芳香族化合物容易發(fā)生熒光，增加體系的共軛度熒光效率一

13、般容易發(fā)生熒光，增加體系的共軛度熒光效率一般也將增大，主要是由于增大熒光物質(zhì)的摩爾吸光也將增大，主要是由于增大熒光物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)，有利于產(chǎn)生更多的激發(fā)態(tài)分子系數(shù)，有利于產(chǎn)生更多的激發(fā)態(tài)分子18(3) (3) 剛性平面結(jié)構(gòu)剛性平面結(jié)構(gòu) 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，多數(shù)具有剛性平面結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，多數(shù)具有剛性平面結(jié)構(gòu)的 有機(jī)分子具有強(qiáng)烈的熒光。有機(jī)分子具有強(qiáng)烈的熒光。 因?yàn)檫@種結(jié)構(gòu)可以減少分子的振動(dòng)，因?yàn)檫@種結(jié)構(gòu)可以減少分子的振動(dòng)，使分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子的相互作用使分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子的相互作用減少，也就減少了碰減少，也就減少了碰 撞去活的可能性。撞去活的可能性。1920（4）取代基效應(yīng)）取代基效應(yīng)芳環(huán)

14、上芳環(huán)上取代基取代基給電子基團(tuán)，熒光增強(qiáng)給電子基團(tuán)，熒光增強(qiáng)（-OH、-OR、-CN、-NH2）產(chǎn)生了產(chǎn)生了p- 共軛作用，增強(qiáng)了共軛作用，增強(qiáng)了 電子共軛程度，使最低電子共軛程度，使最低激發(fā)單重態(tài)與基態(tài)之間的躍遷幾率增大。激發(fā)單重態(tài)與基態(tài)之間的躍遷幾率增大。吸電子基團(tuán)吸電子基團(tuán)減弱甚至?xí)p弱甚至?xí)р鐭晒鉁鐭晒馊缛?COOH、-NO、-C O、鹵素鹵素鹵素取代基隨原子序數(shù)的增加而熒光降低鹵素取代基隨原子序數(shù)的增加而熒光降低在重原子中，能級(jí)之間的交叉現(xiàn)象比在重原子中，能級(jí)之間的交叉現(xiàn)象比 較嚴(yán)重，因此容易發(fā)較嚴(yán)重，因此容易發(fā)生自旋軌道的相互作用，增加了由單重態(tài)轉(zhuǎn)化為三重態(tài)的速生自旋軌道的相互

15、作用，增加了由單重態(tài)轉(zhuǎn)化為三重態(tài)的速率率3. 金屬螯合物的熒光金屬螯合物的熒光大多數(shù)無(wú)機(jī)鹽類金屬離子，在溶液中只能大多數(shù)無(wú)機(jī)鹽類金屬離子，在溶液中只能發(fā)生無(wú)輻射躍遷，因而不產(chǎn)生熒光。發(fā)生無(wú)輻射躍遷，因而不產(chǎn)生熒光。不少有機(jī)化合物雖然具有共軛雙鍵，但由不少有機(jī)化合物雖然具有共軛雙鍵，但由于不是剛性結(jié)構(gòu)，分子處于非同一平面，于不是剛性結(jié)構(gòu)，分子處于非同一平面，因而不發(fā)生熒光。因而不發(fā)生熒光。 但是，但是，若這些化合物和金屬離子形成螯若這些化合物和金屬離子形成螯合物，隨著分子的合物，隨著分子的剛性增強(qiáng)剛性增強(qiáng)，平面結(jié)構(gòu)的，平面結(jié)構(gòu)的增大，常會(huì)發(fā)生熒光增大，常會(huì)發(fā)生熒光212223 同一種熒光物質(zhì)溶于

16、不同溶劑，其熒光光譜的位置和強(qiáng)度同一種熒光物質(zhì)溶于不同溶劑，其熒光光譜的位置和強(qiáng)度可能有明顯不同?？赡苡忻黠@不同。 4 4溶劑效應(yīng)溶劑效應(yīng) 一般情況下，隨著溶劑的極性的增加，熒光物質(zhì)的一般情況下，隨著溶劑的極性的增加，熒光物質(zhì)的* 躍遷幾率增加，熒光強(qiáng)度將增強(qiáng)，熒光波長(zhǎng)也發(fā)生紅移。躍遷幾率增加，熒光強(qiáng)度將增強(qiáng)，熒光波長(zhǎng)也發(fā)生紅移。 5 5 溫度的影響溫度的影響 一般說(shuō)來(lái)，大多數(shù)熒光物質(zhì)的溶液隨著溫度的降低，一般說(shuō)來(lái)，大多數(shù)熒光物質(zhì)的溶液隨著溫度的降低，熒光效率和熒光強(qiáng)度將增加熒光效率和熒光強(qiáng)度將增加如熒光素的乙醇溶液在如熒光素的乙醇溶液在0以下每降低以下每降低10 ，熒光效率增加熒光效率增加3

17、%，冷至，冷至-80時(shí)，熒光效率為時(shí)，熒光效率為100%。（四）溶液的熒光（或磷光）強(qiáng)度（四）溶液的熒光（或磷光）強(qiáng)度 1. 熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系 熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度If正比于吸收的光量正比于吸收的光量Ia與熒光量與熒光量 子產(chǎn)率子產(chǎn)率 。 If = Ia 式中式中 為熒光量子效率，又根據(jù)為熒光量子效率，又根據(jù)Beer定律定律 A=-lg I/ I0 I= I0 .10- A Ia = I0 - I = I0(1- 10 -A) I0和和I分別是入射光強(qiáng)度和透射光強(qiáng)度。代入上式得分別是入射光強(qiáng)度和透射光強(qiáng)度。代入上式得 If = I0(1- 10 -kb c)24整理

18、得：整理得： If =2.3 I0 kbc當(dāng)入射光強(qiáng)度當(dāng)入射光強(qiáng)度I0 和和b一定時(shí)，上式為：一定時(shí)，上式為： If = K c即熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成之正比，即熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成之正比， 但這種線性關(guān)系只有在極稀的溶液中，但這種線性關(guān)系只有在極稀的溶液中， 當(dāng)當(dāng) kbkbc 0.050.05時(shí)才成立。時(shí)才成立。 對(duì)于較濃溶液，由于猝滅現(xiàn)象和自吸收等原因，使熒光強(qiáng)度對(duì)于較濃溶液，由于猝滅現(xiàn)象和自吸收等原因，使熒光強(qiáng)度和濃度不呈線性關(guān)系。和濃度不呈線性關(guān)系。 25262 、影響熒光強(qiáng)度的環(huán)境因素、影響熒光強(qiáng)度的環(huán)境因素因素因素溶劑溶劑一般溶劑效應(yīng)一般溶劑效應(yīng)折射率和介電常數(shù)的影響折射

19、率和介電常數(shù)的影響特殊溶劑效應(yīng)特殊溶劑效應(yīng)熒光體和溶劑分子間的熒光體和溶劑分子間的特殊化學(xué)作用特殊化學(xué)作用如氫鍵的生成如氫鍵的生成同一種熒光物質(zhì)在不同的溶劑中的熒光光譜不同同一種熒光物質(zhì)在不同的溶劑中的熒光光譜不同溫度溫度溫度上升使熒光強(qiáng)度下降溫度上升使熒光強(qiáng)度下降內(nèi)部能量轉(zhuǎn)化作用增大內(nèi)部能量轉(zhuǎn)化作用增大碰撞頻率增加碰撞頻率增加，使外轉(zhuǎn)換的幾率增加，使外轉(zhuǎn)換的幾率增加酸度酸度化合物所處狀態(tài)不同化合物所處狀態(tài)不同電子構(gòu)型上有所不同電子構(gòu)型上有所不同熒光強(qiáng)度和熒光光譜不同熒光強(qiáng)度和熒光光譜不同27283、熒光猝滅、熒光猝滅定義：定義：熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其它

20、溶質(zhì)分子 的相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象的相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象類型類型碰撞猝滅碰撞猝滅激發(fā)單重態(tài)的熒光分子與猝滅劑分子相碰撞激發(fā)單重態(tài)的熒光分子與猝滅劑分子相碰撞熒光分子以無(wú)輻射躍遷的方式回到基態(tài)熒光分子以無(wú)輻射躍遷的方式回到基態(tài)靜態(tài)猝滅靜態(tài)猝滅熒光物質(zhì)分子與猝滅劑分子生成非熒光熒光物質(zhì)分子與猝滅劑分子生成非熒光的絡(luò)合物的絡(luò)合物轉(zhuǎn)入三重態(tài)的猝滅轉(zhuǎn)入三重態(tài)的猝滅發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的猝滅發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的猝滅猝滅劑與熒光物質(zhì)猝滅劑與熒光物質(zhì)熒光物質(zhì)的自猝滅熒光物質(zhì)的自猝滅濃度較高單重激發(fā)態(tài)的分子在發(fā)生熒光之前和未濃度較高單重激發(fā)態(tài)的分子在發(fā)生熒光之前和未激發(fā)的熒光物質(zhì)分子碰撞而引起的自猝

21、滅激發(fā)的熒光物質(zhì)分子碰撞而引起的自猝滅溶解氧溶解氧與與熒光物質(zhì)熒光物質(zhì)29光源光源氙燈和高壓汞燈氙燈和高壓汞燈激發(fā)單色器激發(fā)單色器光柵光柵掃描激發(fā)光譜，選擇激發(fā)波長(zhǎng)掃描激發(fā)光譜，選擇激發(fā)波長(zhǎng)樣品池樣品池I0 IIf發(fā)射單色器發(fā)射單色器掃描發(fā)掃描發(fā)射射光譜光譜消除其它光線的干擾消除其它光線的干擾獲得所需的熒光獲得所需的熒光檢測(cè)器檢測(cè)器顯示器顯示器與分光光度計(jì)的差別與分光光度計(jì)的差別兩個(gè)單色器兩個(gè)單色器兩個(gè)單色器互成直角兩個(gè)單色器互成直角光電倍增管光電倍增管二、熒光分析儀二、熒光分析儀30三、分子熒光分析法及其應(yīng)用三、分子熒光分析法及其應(yīng)用1. 熒光分析方法的特點(diǎn)熒光分析方法的特點(diǎn)（1）靈敏度高）

22、靈敏度高 （2）選擇性強(qiáng)）選擇性強(qiáng)（3）試樣量少和方法簡(jiǎn)單）試樣量少和方法簡(jiǎn)單 （4）提供比較多的物理參數(shù)）提供比較多的物理參數(shù)2、熒光、熒光定量定量分析的分析的方法方法方法方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)曲線法熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度成正比的關(guān)系熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度成正比的關(guān)系比較法比較法同樣條件下，測(cè)定試樣溶液和一標(biāo)準(zhǔn)溶液同樣條件下，測(cè)定試樣溶液和一標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度，直接通過(guò)比例計(jì)算的熒光強(qiáng)度，直接通過(guò)比例計(jì)算313 3、熒光分析法的應(yīng)用、熒光分析法的應(yīng)用方法方法直接熒光法直接熒光法被測(cè)物本身有熒光被測(cè)物本身有熒光被測(cè)物與試劑反應(yīng)后被測(cè)物與試劑反應(yīng)后F F與物質(zhì)的與物質(zhì)的濃度成正比濃度成正比熒光猝滅法

23、熒光猝滅法被測(cè)物使熒光熄滅被測(cè)物使熒光熄滅由熒光強(qiáng)度降低的強(qiáng)度來(lái)測(cè)定被由熒光強(qiáng)度降低的強(qiáng)度來(lái)測(cè)定被測(cè)物的含量測(cè)物的含量 間接熒光法間接熒光法某些陰離子奪取金屬絡(luò)合物中金屬某些陰離子奪取金屬絡(luò)合物中金屬離子，而釋放出能發(fā)熒光的配位體離子，而釋放出能發(fā)熒光的配位體催化熒光法催化熒光法反應(yīng)速度慢，熒光微弱，難測(cè)定反應(yīng)速度慢，熒光微弱，難測(cè)定金屬離子將加速反應(yīng)進(jìn)行金屬離子將加速反應(yīng)進(jìn)行32磷光分析法磷光分析法 1如何獲得較強(qiáng)的磷光增加試樣的剛性增加試樣的剛性: 低溫冷凍低溫冷凍 固體磷光法：固體磷光法：吸附于固相載體（濾紙）吸附于固相載體（濾紙） 分子締合物的形成：分子締合物的形成：加入表面活性劑等加

24、入表面活性劑等 重原子效應(yīng)：重原子效應(yīng)：加入含重原子的物質(zhì)，如銀鹽等加入含重原子的物質(zhì)，如銀鹽等 敏化磷光：敏化磷光：通過(guò)能量轉(zhuǎn)移產(chǎn)生磷光通過(guò)能量轉(zhuǎn)移產(chǎn)生磷光磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí) 基態(tài)，基態(tài)， T1 S0躍遷；躍遷； 電子由電子由S0進(jìn)入進(jìn)入T1的可能過(guò)程：（的可能過(guò)程：（ S0 T1禁阻躍遷）禁阻躍遷）33 熒光計(jì)上配上磷光測(cè)量附件即可對(duì)磷光進(jìn)行測(cè)量。熒光計(jì)上配上磷光測(cè)量附件即可對(duì)磷光進(jìn)行測(cè)量。在有熒光發(fā)射的同時(shí)測(cè)量磷光在有熒光發(fā)射的同時(shí)測(cè)量磷光磷光分析儀器 應(yīng)用34化學(xué)發(fā)光分析法化學(xué)發(fā)光分析法一、基本原理一、基本原理A +

25、B C + D* D* D + h 某些化合物接受能量而被激發(fā)，從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)，某些化合物接受能量而被激發(fā)，從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)，發(fā)射出一定波長(zhǎng)的光發(fā)射出一定波長(zhǎng)的光（1）能夠發(fā)光的化合物大多為有機(jī)化合物，芳香族化合物）能夠發(fā)光的化合物大多為有機(jī)化合物，芳香族化合物（2）發(fā)光反應(yīng)多為氧化還原反應(yīng)，激發(fā)能與反應(yīng)能相當(dāng)）發(fā)光反應(yīng)多為氧化還原反應(yīng)，激發(fā)能與反應(yīng)能相當(dāng) E=170300 kJ/mol；位于可見(jiàn)光區(qū)位于可見(jiàn)光區(qū)（3）發(fā)光持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行）發(fā)光持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)如果存在于生物體發(fā)光反應(yīng)如果存在于生物體(螢火蟲螢火蟲)中，稱生物發(fā)光中，稱生物發(fā)光35化學(xué)發(fā)光效率化

26、學(xué)發(fā)光效率emcecl 參加反應(yīng)的分子數(shù)參加反應(yīng)的分子數(shù)發(fā)射光子的分子數(shù)發(fā)射光子的分子數(shù)化學(xué)效率：化學(xué)效率：參加反應(yīng)分子數(shù)參加反應(yīng)分子數(shù)激發(fā)態(tài)分子數(shù)激發(fā)態(tài)分子數(shù) ce 發(fā)光效率：發(fā)光效率：激發(fā)態(tài)分子數(shù)激發(fā)態(tài)分子數(shù)產(chǎn)生光子數(shù)產(chǎn)生光子數(shù) em 化學(xué)反應(yīng)所決定化學(xué)反應(yīng)所決定 化學(xué)反應(yīng)和環(huán)境因素化學(xué)反應(yīng)和環(huán)境因素化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度( (單位時(shí)間發(fā)射的光量子數(shù)單位時(shí)間發(fā)射的光量子數(shù)) )： tctIddclcl dc/dt是分析物參加反應(yīng)的速率是分析物參加反應(yīng)的速率 36若若化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光反應(yīng)是反應(yīng)是一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)則一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)則 cttcttIAttcl0cl0cldddd即發(fā)光總強(qiáng)度即發(fā)光

27、總強(qiáng)度與被測(cè)物濃度成線性：與被測(cè)物濃度成線性：二、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)類型二、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)類型1. 直接化學(xué)發(fā)光和間接化學(xué)發(fā)光直接化學(xué)發(fā)光和間接化學(xué)發(fā)光直接發(fā)光直接發(fā)光 是被測(cè)物作為反應(yīng)物直接參加化學(xué)發(fā)光反應(yīng)是被測(cè)物作為反應(yīng)物直接參加化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，生成電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子，此初始激發(fā)態(tài)能輻射光子，生成電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子，此初始激發(fā)態(tài)能輻射光子 A + B C* + D C* C + h37間接發(fā)光間接發(fā)光是被測(cè)物A或B，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)生成初始激發(fā)態(tài)產(chǎn)物C* ， C* 不直接發(fā)光，而是將其能量轉(zhuǎn)移給F，使F躍遷回基態(tài)，產(chǎn)生發(fā)光。A + B C* + D C*+F F* + E F* F + h2. 氣相化學(xué)

28、發(fā)光和液相化學(xué)發(fā)光氣相化學(xué)發(fā)光和液相化學(xué)發(fā)光（1）氣相化學(xué)發(fā)光）氣相化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在氣相中進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在氣相中進(jìn)行 主要有主要有O3、NO、S的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，可用于監(jiān)測(cè)空氣中的的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，可用于監(jiān)測(cè)空氣中的O3、NO、SO2、H2S、CO、NO2等等 NO + O3 NO2* NO2* NO2 + h 38（2）液相化學(xué)發(fā)光）液相化學(xué)發(fā)光 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在液相中進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在液相中進(jìn)行應(yīng)用最多的發(fā)光試劑：魯米諾（應(yīng)用最多的發(fā)光試劑：魯米諾（3-氨基苯二甲酰肼）；氨基苯二甲酰肼）； 魯米諾在堿性溶液中與雙氧水的反應(yīng)過(guò)程：魯米諾在堿性溶液中與雙氧水的反應(yīng)過(guò)程：魯米諾魯米諾- H2O

29、2發(fā)光反應(yīng)反應(yīng)速度慢，可檢測(cè)低至發(fā)光反應(yīng)反應(yīng)速度慢，可檢測(cè)低至 10-9 mol/L 的的H2O2；39生物發(fā)光生物發(fā)光是化學(xué)發(fā)光中的一類，特指在生物體內(nèi)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的發(fā)光現(xiàn)象，主要由酶來(lái)催化產(chǎn)生的。多種細(xì)菌、昆蟲、魚類等均能發(fā)光40熒光燈熒光燈：當(dāng)高壓加在燈管兩端后，燈管內(nèi)少數(shù)電子高速：當(dāng)高壓加在燈管兩端后，燈管內(nèi)少數(shù)電子高速撞擊電極后產(chǎn)生二次電子發(fā)射，開始放電，管內(nèi)的水銀撞擊電極后產(chǎn)生二次電子發(fā)射，開始放電，管內(nèi)的水銀受電子撞擊后，激發(fā)輻射出受電子撞擊后，激發(fā)輻射出253.7nm的紫外光，產(chǎn)生的紫的紫外光，產(chǎn)生的紫外光激發(fā)涂在管內(nèi)壁上的熒光粉而產(chǎn)生可見(jiàn)光。外光激發(fā)涂在管內(nèi)壁上的熒光粉而

30、產(chǎn)生可見(jiàn)光。 （可見(jiàn)（可見(jiàn)光的顏色將依據(jù)所選用的熒光粉的不同而不同）光的顏色將依據(jù)所選用的熒光粉的不同而不同） 41熒光棒熒光棒中的化學(xué)物質(zhì)主要由三種物質(zhì)組成：過(guò)氧化物、中的化學(xué)物質(zhì)主要由三種物質(zhì)組成：過(guò)氧化物、酯類化合物和熒光染料。簡(jiǎn)單地說(shuō)，熒光棒發(fā)光的原理酯類化合物和熒光染料。簡(jiǎn)單地說(shuō)，熒光棒發(fā)光的原理就是過(guò)氧化物和酯類化合物發(fā)生反應(yīng)，將反應(yīng)后的能量就是過(guò)氧化物和酯類化合物發(fā)生反應(yīng)，將反應(yīng)后的能量傳遞給熒光染料，再由染料發(fā)出熒光。目前市場(chǎng)上常見(jiàn)傳遞給熒光染料，再由染料發(fā)出熒光。目前市場(chǎng)上常見(jiàn)的熒光棒中通常放置了一個(gè)玻璃管夾層，夾層內(nèi)外隔離的熒光棒中通常放置了一個(gè)玻璃管夾層，夾層內(nèi)外隔離了過(guò)

31、氧化物和酯類化合物，經(jīng)過(guò)揉搓，兩種化合物反應(yīng)了過(guò)氧化物和酯類化合物，經(jīng)過(guò)揉搓，兩種化合物反應(yīng)使得熒光染料發(fā)光。使得熒光染料發(fā)光。 42三、化學(xué)發(fā)光的測(cè)量?jī)x器三、化學(xué)發(fā)光的測(cè)量?jī)x器儀器主要包括：儀器主要包括： 樣品室、光檢測(cè)器、放大器和信號(hào)輸出裝置等部件樣品室、光檢測(cè)器、放大器和信號(hào)輸出裝置等部件43熒光法測(cè)定維生素?zé)晒夥y(cè)定維生素B2片劑中核黃素含量片劑中核黃素含量 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模阂?、?shí)驗(yàn)?zāi)康模? 1學(xué)習(xí)和掌握熒光光度分析方法學(xué)習(xí)和掌握熒光光度分析方法2 2了解熒光分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)及使用方法了解熒光分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)及使用方法二、實(shí)驗(yàn)原理：二、實(shí)驗(yàn)原理：維生素維生素B2結(jié)構(gòu)式結(jié)構(gòu)式 維生素維生素

32、B2，又叫核黃素，又叫核黃素，橘黃色橘黃色,無(wú)臭的針狀晶體無(wú)臭的針狀晶體 易溶于水而不溶于易溶于水而不溶于乙醚等有機(jī)溶劑乙醚等有機(jī)溶劑 在中性或酸性溶液中穩(wěn)定在中性或酸性溶液中穩(wěn)定光照易分解，對(duì)熱穩(wěn)定光照易分解，對(duì)熱穩(wěn)定44維生素維生素B2水溶液在水溶液在430-440nm藍(lán)光或紫外光照射下藍(lán)光或紫外光照射下 會(huì)發(fā)生綠色熒光，熒光峰在會(huì)發(fā)生綠色熒光，熒光峰在535nm,在在pH=6-7溶液溶液中熒光強(qiáng)度最大，在中熒光強(qiáng)度最大，在pH=11的堿溶液中熒光消失，的堿溶液中熒光消失，所以可以用熒光光譜法測(cè)定維生素所以可以用熒光光譜法測(cè)定維生素2的含量的含量 三、實(shí)驗(yàn)用品：三、實(shí)驗(yàn)用品： 1 1儀器：

33、儀器： 熒光分光光度計(jì)，移液管，容量瓶，棕色試劑瓶，熒光分光光度計(jì)，移液管，容量瓶，棕色試劑瓶， 比色管，燒杯，離心機(jī)，離心管比色管，燒杯，離心機(jī)，離心管 2 2藥品：藥品： 核黃素（生化試劑），冰醋酸（核黃素（生化試劑），冰醋酸（ARAR）, ,鹽酸（鹽酸（ARAR） 氫氧化鈉，市售維生素氫氧化鈉，市售維生素B2B2片劑片劑45四、實(shí)驗(yàn)步驟：四、實(shí)驗(yàn)步驟：1 1、試劑溶液的配制、試劑溶液的配制 1 1）5 5醋酸溶液醋酸溶液 取取5 5份冰醋酸與份冰醋酸與9595份體積蒸餾水混合份體積蒸餾水混合 2 2）10.010.0mgmgL L-1-1VBVB2 2標(biāo)準(zhǔn)溶液：標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取準(zhǔn)確稱取

34、10.010.0mgVBmgVB2 2 將其溶解于少量的將其溶解于少量的5%5%HAcHAc中，轉(zhuǎn)移至中，轉(zhuǎn)移至1 1L L容量瓶中用容量瓶中用5%5%HAcHAc 稀釋至刻度，該溶液應(yīng)裝于棕色試劑瓶中，置陰涼處保存稀釋至刻度，該溶液應(yīng)裝于棕色試劑瓶中，置陰涼處保存 3 3）待測(cè)液：）待測(cè)液：取市售取市售VBVB2 2一片，置于一片，置于5050mLmL燒杯中，加入約燒杯中，加入約 12 12mL 5%HAcmL 5%HAc溶液，用玻璃棒搗碎藥片，水浴加熱使樣品溶液，用玻璃棒搗碎藥片，水浴加熱使樣品 由混濁變?yōu)榛就该骱笕∠吕鋮s，轉(zhuǎn)移并加入由混濁變?yōu)榛就该骱笕∠吕鋮s，轉(zhuǎn)移并加入5%5%HAcHAc溶液溶液 定容至定容至100 100 mLmL。取數(shù)毫升于離心管中進(jìn)行離心，用移液取數(shù)毫升于離心管中進(jìn)行離心，用移液 管準(zhǔn)確移取管準(zhǔn)確移取5 5 mLmL的上層清液并定容成的上層清液并定容成5050mLmL，貯于棕色試貯于棕色試 劑瓶中，置陰涼處保存劑