專業(yè)英語論文翻譯

1、MET基因復(fù)制數(shù)量的增加賦予單克隆抵抗體抗MET的能力并且建立藥物依賴性關(guān)鍵詞：MET ，MV-NV30單克隆抗體，酪氨酸激酶抑制劑，抗性，藥物依賴性【摘要】：被MEI原癌基因編碼的酪氨酸激酶受體領(lǐng)導(dǎo)了具體抑制劑的發(fā)展并在癌癥中起很重要的作用，其中現(xiàn)在一些正處于前進(jìn)的臨床試驗(yàn)階段就以前的經(jīng)驗(yàn)表明對(duì)大多數(shù)靶向治療最主要的限制是抗性的出現(xiàn)。在對(duì)MET單克隆抗體抗性和抗體對(duì)化學(xué)抑制劑旁路抗性（反之亦然）一無所知時(shí)，酪氨酸激酶抑制劑對(duì)MET的抗性機(jī)制就已經(jīng)被提出。EBC1型肺癌細(xì)胞是MET基因擴(kuò)增的結(jié)果，并且這種細(xì)胞對(duì)MET抑制劑非常敏感，包括MET單克隆抗體的單機(jī)形式在內(nèi)。我們培養(yǎng)生成抵抗抗體的細(xì)胞

2、發(fā)現(xiàn)這種抗性是由于MET基因大量復(fù)制擴(kuò)增和它的受體顯著表達(dá)而來。這種過度表達(dá)可以使單克隆抗體的“脫落”活動(dòng)達(dá)到飽和，并且能夠防止表面的MET受體的有效的下調(diào)和抑制劑的活化作用。值得注意的是MV-DN30抗體的抗性細(xì)胞是MET耐受細(xì)胞對(duì)MET酪氨酸激酶抑制劑也很敏感。除此之外，抗體抗性細(xì)胞還具有藥物依賴性,MV-DN30的去處導(dǎo)致它們死亡是由于它們的過度信號(hào)表達(dá)。在實(shí)驗(yàn)中，對(duì)MET酪氨酸激酶抑制劑存在抗性的細(xì)胞仍然對(duì)MV-DN30抗體的作用敏感。結(jié)果表明一種不連續(xù)的通過抗體和化學(xué)激酶抑制劑聯(lián)合治療可能會(huì)使靶向治療的臨床反應(yīng)和對(duì)MET抗體治療旁路的抗性增加?？s略語：MV-DN30-單價(jià)DN30，T

3、KEs酪氨酸激酶抑制劑，HGF肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，MAPK有絲分裂原活化蛋白激酶1.簡(jiǎn)介可以抑制一個(gè)特定的目標(biāo)分子化合物的靶向治療法開辟了治療癌癥的新道路。與主要?dú)⑺罃U(kuò)散細(xì)胞為主的傳統(tǒng)化療不同的是靶向藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞采取一種更具體的治療方式。靶向治療依賴于“癌基因沉癮”的概念。這就意味著單個(gè)基因的抑制或死亡是由于它們的沉癮，或者至少抑制它們的生長(zhǎng)（溫斯坦,2002）。臨床試驗(yàn)中的特定抑制劑的發(fā)展給腫瘤細(xì)胞的“Achilles heel”的識(shí)別提供支持（溫斯坦和喬，2006）。盡管靶向治療在一部分癌癥患者中取得了較優(yōu)異的效果，還有重要的一點(diǎn)就是部分癌癥病人對(duì)藥物的選擇表達(dá)沒有起到治療作用（原發(fā)性），除

4、此之外，幾乎總是一開始患者反應(yīng)變成后來對(duì)治療的抵抗和復(fù)發(fā)（繼發(fā)性）。因此，最關(guān)鍵的就是要發(fā)現(xiàn)對(duì)治療抵抗的機(jī)制并且找到繞過它們的方法。癌基因和人類癌癥密切相關(guān)，酪氨酸激酶起著決定性作用。這個(gè)觀察發(fā)現(xiàn)許多腫瘤沉溺其中使得蛋白激酶成為了治療癌癥的理想目標(biāo)（巴塞爾加，2006; Gschwind等人，2004）。在臨床診斷中主要使用一種較小的激酶抑制劑和單克隆抗體來抑制酪氨酸激酶。酪氨酸激酶抑制劑是一種可以抑制靶蛋白酶活性的小分子物質(zhì)。它們能有效地瞄準(zhǔn)膜結(jié)合位點(diǎn)和細(xì)胞內(nèi)的激酶并且很容易在體內(nèi)擴(kuò)散。單克隆抗體已被廣泛用于臨床并取得了可觀的成果。這些分子的優(yōu)點(diǎn)在于它們具有很高的特異性。在癌癥治療中的可以抗

5、癌的RTKs單克隆抗體已經(jīng)被批準(zhǔn)在乳腺癌和結(jié)腸癌中使用(分別針對(duì)HER2和表皮生長(zhǎng)因子受體) 并可作為抗血管增生的藥物（針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體）。除此之外，很多針對(duì)于其他目標(biāo)的單克隆抗體正處與發(fā)展和試驗(yàn)階段。最近，一種作為癌癥治療目標(biāo)的RTK受到關(guān)注，這種RTK是由致癌基因編碼的在肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子上的酪氨酸激酶受體。在和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子結(jié)合后，MET活化并啟動(dòng)一個(gè)復(fù)雜的生化程序，這個(gè)過程被稱作“浸潤(rùn)性上長(zhǎng)”。在腫瘤組織中，浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的增進(jìn)可以迫使腫瘤細(xì)胞從腫瘤組織中分解下來侵蝕基底膜，滲入基質(zhì)中，甚至定居于新的組織中來實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移。很多研究結(jié)果表明MET在人類的許多腫瘤中具有活性，并且它與對(duì)直接激酶

6、療法的持續(xù)抗性密切相關(guān)。除此之外，還表明細(xì)胞顯示大量復(fù)制（超過8張）和隨之而來的過度表達(dá)和獨(dú)立配體的激活都是沉溺于這種致癌基因和抗MET藥物的應(yīng)答中。在前期設(shè)置得到的基本結(jié)果，幾種特定的多目標(biāo)的酪氨酸激酶抑制劑和直接針對(duì)于MET或者HGF的抗體已經(jīng)進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段。在活體和動(dòng)物模型進(jìn)行的研究已經(jīng)表明用TKIs長(zhǎng)期治療會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的治療耐受性。對(duì)MET TKIs的抗性可能是由于一些機(jī)制，比如MET基因擴(kuò)增，過度表達(dá)，MET點(diǎn)突變，MET平行路徑的激活和KRAS基因的擴(kuò)增機(jī)制。然而，關(guān)于對(duì)MET的單克隆抗體的再次具有抗性一無所知。我們以前報(bào)道過主要針對(duì)細(xì)胞外的部分MET的抑制性單克隆抗體的研究進(jìn)展

7、。它的誘導(dǎo)、再結(jié)合、達(dá)到MET脫落閾值的能力使其有抑制活性，剩余的跨膜片段通過蛋白酶體降解途徑處理掉。因此，DN-30結(jié)合到MET后的結(jié)果是使其變成可溶性的誘餌MET并且蛋白水解酶會(huì)講解MET激酶。 這促進(jìn)了MET介導(dǎo)的生物活性的抑制作用。設(shè)計(jì)了這樣一個(gè)過程就是因?yàn)镈N-30的結(jié)合使得MET激酶部分活化并且導(dǎo)致抗體介導(dǎo)的受體同源二聚體化和單價(jià)Fab片段失去競(jìng)爭(zhēng)活性的一個(gè)過程。在這個(gè)研究中我們表明了不斷用MV-DN30來治療沉癮癌細(xì)胞會(huì)使其具有抗性的原因是MET基因的大量復(fù)制和MET的過度表達(dá)超過了MV-DN30對(duì)其有效下調(diào)并使其失去活性的的能力。值得注意的是，MV-DN30抗性細(xì)胞還會(huì)一直對(duì)M

8、ET TKIs產(chǎn)生耐受性和敏感性。有趣的是，它們獲得了藥物耐受性，當(dāng)受到MV-DN30的驅(qū)除致死它們的是過多的信號(hào)表達(dá)。我們還表明對(duì)MET TKIs 有抗性的細(xì)胞也對(duì)MV-DN30敏感，所以，MV-DN30和MET TKIs 對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用是相互促進(jìn)的。2.材料與方法 2.1.細(xì)胞和試劑EBC1 細(xì)胞從一個(gè)患有轉(zhuǎn)移皮膚腫瘤的病人取得，這個(gè)患者還患有肺鱗狀細(xì)胞癌，病例是從日本癌癥資料庫購買得到。 GTL16 是一種實(shí)驗(yàn)室里的克隆胃癌細(xì)胞系。HEK-293T細(xì)胞系分離于人類胚胎時(shí)期的腎，A549細(xì)胞系來源于肺癌，都是從ATCC購買來培養(yǎng)的。對(duì)MV-DN30有抗性的EBC1細(xì)胞可以通過一個(gè)逐步的方

9、法培養(yǎng)得到，由Sigma Tau R&D 提供的通過暴露親代細(xì)胞方法來增加抗MET單價(jià)單克隆抗體的濃度。親代細(xì)胞用10 mg/ml 的MV-DN30治療約一個(gè)月，直到生成的R10細(xì)胞開始產(chǎn)生抗性為止，R10抗性細(xì)胞又用逐步增加濃度的MV-DN30治療。所有的抗體耐受細(xì)胞培養(yǎng)在存在MV-DN30并且可以使它們產(chǎn)生耐受性的條件下。大約兩個(gè)月可以分離到R20抗體抗性細(xì)胞，四個(gè)月可以分離到R80抗體耐受細(xì)胞。EBC1 and GTL16 細(xì)胞對(duì)MET TKIs PHA-665752 (EBC1 RPHA 50 nM and GTL16 RPHA 150 nM) 都有耐受性，并且向描述的那樣培養(yǎng)

10、可以一直保持PHA-665752的存在。該細(xì)胞系的遺傳身份通過一個(gè)短的串珠狀重復(fù)序列（STR）識(shí)別，這段序列在2013年7月再次重復(fù)出現(xiàn)。We 我們利用下面的小分子：ATP競(jìng)爭(zhēng)行MET TKIs PHA-665752 (Tocris Bioscience) and JNJ-38877605 (John-son & Johnson) 和p38MAP激酶抑制劑SB203580 (Merck). 2.2. mRNA和基因組DNA的分析 用Trizol 試劑提取得到的RNA被檢測(cè)到利用多文士病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物合成，cDNA可以用實(shí)時(shí)的利用電源帶動(dòng)的綠色PCR混合的PCR 技術(shù)來實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，

11、根據(jù)制造商的說明下面的MET和ACTIN特異性引物要用到： hMET ex 19 Fw: 50-AGTTTACCACCAAGTCAGATGTGT-30; hMET ex 20 Rw: 50-GGGCTCCTCTTGTCATCAGC-3; hACTIN Fw: 50-GGAGGAGCTGGAAGCAGCC-30; hACTIN Rw: 50-GCTGTGCTACGTCGCCCTG-30.根據(jù)制造商的說明用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)來分析用純化的DNA基因組迷你試劑盒分析從細(xì)胞中提取到的基因組DNA，這種技術(shù)是用 TaqMan基因表達(dá)的主要結(jié)構(gòu)和TaqMan探針MET基因和RNaseP控制基因的實(shí)時(shí)定量PCR

12、分析。MET的mRNA的成倍增加和EBC1中MET基因的大量復(fù)制以及MV-DN30抗性細(xì)胞歸一化然后被認(rèn)可。2.3. 蛋白印跡分析和脈沖追蹤代謝標(biāo)記蛋白提取液 (40 mg), 細(xì)胞上清液(20 ml) 。在細(xì)胞裂解前2小時(shí)把MET TKI JNJ-38877605加入到指定的地方。 免疫印跡法使用了以下的初級(jí)抗體：the anti-MET Intracellular domain (ICD) (zymed, #370100) from Invitrogen, anti-MET ECD (DL21) obtained as described (Prat et al., 1991), anti

13、-phospho-Tyr1234-Tyr 1235MET (#3126), anti-AKT (#9272), anti-phospho-Ser473AKT(#4060),anti-p44/42MAPK(#9102),anti-phospho-Thr202-Tyr204p44/42MAPK#9101),anti-p38MAPK(#8690),anti-phospho-Thr180-Tyr182-p38 MAPK (#9215), from CellSignaling;anti-vinculin (#V9131) from Sigma and anti-b-actin (#I-19 sc-161

14、6) from Santa Cruz Biotechnology. Secondary IgG HRP-Peroxidase antibodies were from Amersham.脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)的1106WT，或MV-DN30抗性的EBC1細(xì)胞(R80)都被平鋪在60mm的盤里。R80 細(xì)胞保存在有或沒有抗體（80 mg/ml）存在的條件下，而WT細(xì)胞要一直保存在有抗體的條件小16小時(shí)。然后，這些細(xì)胞在不含L-蛋氨酸但有500mmMCIL-甲硫氨酸S35(脈沖)（易標(biāo)記）的DMEM培養(yǎng)基中處理20分鐘。在這之后，去處放射性標(biāo)記的培養(yǎng)基，細(xì)胞用1ml磷酸鹽緩沖液鹽水洗兩次然后保存在有2mlI

15、SCOVE的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入2%FBS，在MV-DN30(80 mg/ml)存在或不存在脈沖3.6和16小時(shí)。之后，用免疫沉淀法（IP）在1ml細(xì)胞裂解液中進(jìn)行測(cè)定（裂解緩沖液：1% TritonX-100存在下，20 mM Tris-鹽酸，5毫米EDTA，10% V / v甘油，150 mM NaCl補(bǔ)充蛋白磷酸酶抑制劑）通過使用抗Met ICD dq13單克隆抗體，而IP法利用抗Met ECD do24單克隆抗體對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)2毫升上清液進(jìn)行。細(xì)胞裂解液和上清液都在有已知抗體的培養(yǎng)基里培養(yǎng)16個(gè)小時(shí)，抗鼠IgG抗體預(yù)包被瓊脂糖凝膠蛋白珠形成免疫復(fù)合物沉淀下來。免疫沉淀物中的蛋白就會(huì)被8%

16、 SDS-PAGE 分開，然后轉(zhuǎn)移到3mm的紙上，80度，48小時(shí)后蛋白質(zhì)的放射性就會(huì)在投影膜上留下印記。2.4.生長(zhǎng)和可行性分析用于細(xì)胞生長(zhǎng)和可行性分析的這些細(xì)胞被接種在96孔的培養(yǎng)板上，根據(jù)制造商的說明用已知藥物在不同時(shí)期進(jìn)行處理然后用細(xì)胞滴度發(fā)光細(xì)胞進(jìn)行可行性分析。沒經(jīng)過處理的細(xì)胞控制在藥物載體存在的條件下生長(zhǎng)。所有的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化到0天的藥物治療。2.5.熒光細(xì)胞分析對(duì)結(jié)合在EBC1WT,R20,R80細(xì)胞質(zhì)膜上的MET進(jìn)行免疫熒光著色，這些細(xì)胞要提前在有或沒有MV-DN30存在的條件下培養(yǎng)24小時(shí)。熒光性的強(qiáng)度可以通過細(xì)胞熒光性分析檢測(cè)到。用于檢測(cè)的細(xì)胞要在PBS中用2%FBS洗滌并

17、且在室溫下用抗MET ECD DO24 mAb (100 ng/ml)著色20分鐘。然后在室溫下細(xì)胞又在PBS中用2%FBS洗滌就會(huì)逐步產(chǎn)生抗鼠IgG-RPE二抗然后用二脒基苯基吲哚作用20分鐘。作為陰性對(duì)照，將不含初級(jí)抗MET抗體的細(xì)胞進(jìn)行染色。質(zhì)膜結(jié)合的蛋氨酸的熒光強(qiáng)度（AU為單位），通過使用GraphPad Prism軟件繪制為箱形繪圖圖表。2.6.慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)EBC1 WT 細(xì)胞能穩(wěn)定地在兩種不同量的慢性病毒顆粒編碼的MET cDN轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括1mg(METþþ)和1.6mg(METþþþ)的p24病毒抗原，其濃度按說明確定。作為對(duì)照，

18、WT細(xì)胞用含有空載體病毒顆粒感染 。MV-DN30抗性細(xì)胞(R20 and R80)只用空載體感染。在感染48小時(shí)后接種細(xì)胞用于生物化學(xué)分析。轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的可行性分析如先前描述的一樣進(jìn)行，讓細(xì)胞在存在或不存在MV-DN30的條件下上長(zhǎng)72小時(shí)。如先前所述，MET的蛋白印跡分析和磷酸化的MET蛋白水平和對(duì)感染細(xì)胞的mRNA的表達(dá)水平實(shí)時(shí)定量PCR分析一樣子細(xì)胞感染72小時(shí)后進(jìn)行評(píng)估。2.7. 藥物協(xié)同作用分析在抗MET抗體MV-DN30和MET TKI JNJ-38877605之間進(jìn)行藥物協(xié)同作用分析是對(duì)WT EBC1和接種在96孔板上的GTL16細(xì)胞在用藥物治療72小時(shí)后的細(xì)胞活力的研究。如果使用

19、一個(gè)藥品從藥物劑量來說要比混合使用的IC50約高10倍左右，雙重增加濃度可以用于單藥使用和組合使用。評(píng)估細(xì)胞活力為前面描述的增效作用的藥物效應(yīng)多種分析研究，采用組合指數(shù)（CI）和Chou and Talalay 方法。使用相互排他性假設(shè)計(jì)算CI值（藥物作用機(jī)理的不同，采用compusyn.exe）軟件，可上線的網(wǎng)站：，和繪制功能的FA（由這兩種藥物的組合影響系統(tǒng)分?jǐn)?shù)）。CI值< 1表明兩種藥物之間的協(xié)同作用。2.8. 統(tǒng)計(jì)分析同一個(gè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用GraphPad Prism軟件進(jìn)行兩尾t檢驗(yàn)分析至少有三種生物學(xué)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義的結(jié)果。P值小于0.05被認(rèn)為是有意義的。3.結(jié)果3.1. MV

20、-DN30耐藥細(xì)胞株的建立EBC1 肺癌細(xì)胞是MET沉癮細(xì)胞，它能放大MET的擴(kuò)增、過度表達(dá)和活化過程。MET TKIs或者M(jìn)V-DN30對(duì)EBC1細(xì)胞里的MET具有強(qiáng)烈的破壞它們生存和上長(zhǎng)的能力的作用（圖AC）。我們先前培養(yǎng)的EBC1細(xì)胞 對(duì)不同的YKIs有抗性表明了這種抗性可能是由于MET基因的進(jìn)一步擴(kuò)增。為了產(chǎn)生抗MV-DN30的細(xì)胞，我們采用逐步暴露EBC1原代細(xì)胞不方法來增加抗體的濃度，并且獲得抗不同劑量抗體的細(xì)胞系（圖1b；約的分步方法詳見材料和方法部分）。, 進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，我們使用耐20細(xì)胞（ebc1 R20）和80（ebc1 R80）毫克/毫升mv-dn30，劑量是分別是前面

21、的約10倍和40倍，然后測(cè)這些細(xì)胞的抗體IC50（圖1a）。在有MV-DN30存在的抗性細(xì)胞的生長(zhǎng)速度一直和WT細(xì)胞差不多（圖1C）。正如前面提到的，MV-DN30發(fā)揮它的抑制活性是通過誘導(dǎo)MET的結(jié)構(gòu)域蛋白反正溶蛋白裂解，隨后又通過蛋白酶體受體介導(dǎo)受體降解。這種反應(yīng)減少了細(xì)胞表面的MET的大量表達(dá)，抑制了MET的活性和受體介導(dǎo)的生物學(xué)活性。如圖1D所示，事實(shí)上，MV-DN30的治療導(dǎo)致了再EBC1細(xì)胞中的MET通過酪氨酸酶的磷酸化消除大量減少。與抗性細(xì)胞的生化分析相反的是顯示了在相同劑量抗體存在的情況下，MET也會(huì)磷酸化并且在質(zhì)膜上的大量的MET蛋白明顯高于保存在相同條件下的WT細(xì)胞（圖1D

22、,E）。除此，盡管激活的下游目標(biāo)AKT和MAPK激酶都被保存在有抗體存在的條件下（圖1D）。所有的數(shù)據(jù)表明，抗EBC1細(xì)胞的MV-DN30并不是通過一種足以消除它的結(jié)構(gòu)的活性的方法來下調(diào)MET，而是一種允許它的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來調(diào)節(jié)它的結(jié)構(gòu)磷酸化的方法.3.2.抗性細(xì)胞中缺乏MV-DN30抑制活性并不是因?yàn)樗幕钚圆蛔?如圖1D,E所示，用MV-DN30處理抗性細(xì)胞致使MET大量減少這種減少比處于同等條件下觀察的WT細(xì)胞中的減少更明顯。我們想知道在抗性細(xì)胞里的抗體受損是否是由于MET的結(jié)構(gòu)域IPT4發(fā)生突變引起，這個(gè)結(jié)構(gòu)域是它的集合位點(diǎn)，但是我們沒有發(fā)現(xiàn)任何突變（數(shù)據(jù)顯示）。于是，我們?cè)u(píng)估了是否是抗性

23、細(xì)胞中脫落的MET胞外結(jié)構(gòu)域（ECD）對(duì)抗體的反應(yīng)被抑制了。在相同劑量MV-DN30存在的條件下培養(yǎng)了24小時(shí)的抗性細(xì)胞和WT細(xì)胞的上清液中，抗性細(xì)胞上清液中含有更豐富的脫落的ECD（圖2A）。當(dāng)對(duì)去處抗體24小時(shí)后的抗性細(xì)胞中MET的表達(dá)和活化進(jìn)行評(píng)估時(shí)，我們觀察到MET總量強(qiáng)烈增加特別是結(jié)合在細(xì)胞膜上的形式（圖2B和圖1）。 對(duì)抗性細(xì)胞再引入MV-DN30細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致上清液中MET ECD含量更高，與在同樣劑量處理的WT細(xì)胞相比，之后細(xì)胞內(nèi)的MET同時(shí)減少了并返回到平時(shí)觀察的抗性細(xì)胞的一半水平（圖2 D）。在脈沖代謝標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中也觀察到了相似的結(jié)果：比起WT細(xì)胞，抗性細(xì)胞合成更多的MET和MV

24、-DN30來促進(jìn)MET ECD 釋放并大量增加（圖2E）。最后， 用更高劑量抗體20 mg/ml (R20)處理EBC1細(xì)胞來更好的證明MV-DN30在抗性細(xì)胞中是具有活性的。圖2F所示在抗性細(xì)胞中隨著MV-DN30劑量是增加減少了大量MET在細(xì)胞膜上的表達(dá)（圖2A）和磷酸化(圖2B)?？傊?，所有的結(jié)果表明EBC1細(xì)胞的抗性不是因?yàn)镸V-DN30活性缺乏，而是由于用它的飽和能力來促進(jìn)了一種高效的MET解離。圖1- 抗MV-DN30的EBC1細(xì)胞分子表征。 (A) 在有MV-DN30的遞增濃度的條件下培養(yǎng)了72小時(shí)的EBC1 WT細(xì)胞的細(xì)胞活力。對(duì)未經(jīng)過處理的細(xì)胞(100%) ± s.

25、d.的歸一化結(jié)果。 (B) 在指定濃度抗體的條件下培養(yǎng)72小時(shí)的EBC1 WT細(xì)胞或產(chǎn)生MV-DN30抗性的細(xì)胞(R10, R20, R40, R80)。與未經(jīng)過處理的WT細(xì)胞(100%) ± s.d歸一化結(jié)果。 (C) 在MV-DN30(20 and 80 mg/ml)存在的條件下生長(zhǎng)的EBC1 WT細(xì)胞EBC1R20和R80細(xì)胞的生長(zhǎng)活性。與未經(jīng)過處理的WT細(xì)胞(100%) ± s.d歸一化結(jié)果(*P < 0.001)。(D) 在有指定劑量MV-DN30抗體存在的條件下處理24小時(shí)的EBC1WT ,EBC1R20和R80細(xì)胞的蛋白印跡。(E)結(jié)合MET的在24小時(shí)

26、在不存在或存在的血漿膜的熒光強(qiáng)度的箱圖mv-dn30 R20和R80生長(zhǎng)EBC1 WT細(xì)胞（AU：任意單位）圖2細(xì)胞耐受性并不是由于失去了對(duì)MV-DN30的敏感性。(A) 在存在或不存在MV-DN30的環(huán)境下培養(yǎng)24小時(shí)的EBC1 WTR20和R80細(xì)胞的上清液中MET ECD的蛋白印跡。(B)在有或沒有（24小時(shí)去除）的EBC1WTR20和R80細(xì)胞中的蛋白（頂部）和蛋氨酸的酪氨酸磷酸化蛋白印跡。紐蛋白作為控制基礎(chǔ)(C)在 EBC1 WT, R20 and R80 細(xì)胞中有或沒有（24小時(shí)去除）MV-DN30的條件下在質(zhì)膜上結(jié)合的MET的熒光強(qiáng)度的箱圖。質(zhì)膜著色如圖E。 (D) 在用MV-D

27、N30處理（24h）的EBC1WT R20和R80 細(xì)胞中和抗性細(xì)胞（圖2 D）中觀察到的MET總蛋白水平和MET ECD 的蛋白印跡.(E) 在有或沒有MV-DN30存在下的EBC1WT和R80細(xì)胞里的MET(來源細(xì)胞裂解液，上面)和MET ECD（來源與細(xì)胞上清液，底部）的用脈沖追蹤代謝蛋白標(biāo)記法的免疫沉淀分析。 (F) 在遞增MV-DN30濃度的環(huán)境下的EBC1(左圖)和R20細(xì)胞（右圖）的活性檢測(cè)。未經(jīng)過處理的WT細(xì)胞（左圖）或者用20 mg/ml (100%)處理的R20（右圖）統(tǒng)計(jì)結(jié)果(*P < 0.001, *P < 0.05)。3.3. 對(duì)MV-DN30的抗性是由于

28、MET的擴(kuò)增和過度表達(dá)如上圖所示（圖2BeD），MV-DN30抗性細(xì)胞表達(dá)MET水平比原代細(xì)胞更高。我們懷疑這可能是由于增加的啟動(dòng)子活性或更高的mRNA的可用性，因?yàn)槟阄NA的負(fù)控制微分表達(dá)了。在EBC1WT和抗性細(xì)胞的熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示排除這些可能性（數(shù)據(jù)未顯示）。然后我們?cè)u(píng)估了基因擴(kuò)增的情況是因?yàn)镸ET大量復(fù)制是對(duì)激酶抑制劑存在抗性的機(jī)制。如圖3所示，EBC1抗性細(xì)胞顯示了MET的大量復(fù)制（原代細(xì)胞的第24代到30代），這大約是二倍體細(xì)胞的15倍。當(dāng)分析MET的mRNA水平時(shí)，我們觀察到MET的過度表達(dá)是WT細(xì)胞的23倍，達(dá)到了MET正常表達(dá)細(xì)胞(A549 and HEK-293T)的

29、6090倍。為了證明這種增加可能是為了維持對(duì)MV-DN30的抗性，我們將EBC1WT細(xì)胞放在不同量的MET cDNA條件下轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過比較EBC1R20和R80細(xì)胞mRNA的表達(dá)水平來獲得（圖3）。我們觀察到，MET的mRNA以23倍的速度劇增，這與在存在MV-DN30的條件下細(xì)胞的活性有關(guān)（圖3D）。除此，盡管有MV-DN30的存在MET保持磷酸化，這就解釋了為什么細(xì)胞能夠存活增加（圖3E）。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，嗜MET的EBC1細(xì)胞變得有抗性是因?yàn)镸ET的進(jìn)一步擴(kuò)增和過度表達(dá)從而來阻止有效的抗體介導(dǎo)的對(duì)MET活性的抑制。圖3 3.4. 抗MV-DN30的細(xì)胞也是嗜MET細(xì)胞并有藥物依賴性 為了

30、證明抗MV-DN30的細(xì)胞也是嗜MET細(xì)胞，我們用一種小分子的激酶抑制劑JNJ-38877605來處理細(xì)胞。如圖4a,b所示，抗MV-DN30的EBC1細(xì)胞在有抗體(20 mg/ml for R20 and 80 mg/ml for R80)存在的條件下生長(zhǎng)情況顯示了當(dāng)用MET激酶抑制劑JNJ-38877605 (10 nM or 250 nM)處理時(shí)，細(xì)胞活性的降低和MET磷酸化作用的減弱。和親代EBC1細(xì)胞相比，抗性細(xì)胞對(duì)JNJ-38877605的敏感劑量更低，可能是由于在抗性細(xì)胞中MET的蛋白合成和轉(zhuǎn)運(yùn)更高效。從抗性細(xì)胞的培養(yǎng)基中去除MV-DN30會(huì)導(dǎo)致MET的表達(dá)增加（圖2B），我們研

31、究了過度表達(dá)的生化效應(yīng)?？剐约?xì)胞培養(yǎng)在不存在MV-DN30的條件下，顯示了活性下降（圖4C）。這些細(xì)胞的蛋白印跡分析表明，隨著時(shí)間的推移逐漸增加了磷酸化（圖4D）。然而，2448h后，after 24e48 h, p38 MAPK的活化清晰可見證明了通常在細(xì)胞凋亡反應(yīng)之前會(huì)有一個(gè)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。除此之外，在沒有MV-DN30存在的條件下培養(yǎng)的抗性細(xì)胞中的p38 MAPK會(huì)受到一種小分子SB203580 的抑制使得細(xì)胞活性得以恢復(fù)（圖3）。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，p38 MAPK信號(hào)對(duì)于參與藥物依賴是至關(guān)重要的.重要的是要記住對(duì)于嗜MET細(xì)胞抗MET酪氨酸激酶抑制劑的藥物依賴條件和黑色素瘤有獲得性的藥

32、物依賴性已經(jīng)被證明。為了證明當(dāng)去除MV-DN30后過多的MET信號(hào)使細(xì)胞凋亡是正確的，我們用低劑量的MET YKI處理抗性細(xì)胞讓其充分減少但不會(huì)完全抑制MET活性（圖4）。事實(shí)上，如圖4E所示，保存在不含MV-DN30并用 10 nM JNJ-38877605（低于IC50濃度）處理的抗性細(xì)胞可以恢復(fù)它們的活性，并且這種水平類似于保存在有抗體存在的培養(yǎng)條件下的抗性細(xì)胞的活性水平?？傊?，這些結(jié)果表明，MV-DN30抗性細(xì)胞都是嗜MET細(xì)胞并且它們的繁殖和生存都有藥物依賴性。圖43.5. 在嗜MET細(xì)胞中MV-DN30和MET TKIs的協(xié)同作用MET-TKIs 和 MV-DN30 都可以有效的抑

33、制EBC1細(xì)胞的活性，我們想知道這兩種抗MET化合物是否表現(xiàn)增強(qiáng)或協(xié)同作用。單獨(dú)或在有非常低劑量的MV-DN30存在的條件下（0.152.5毫克/毫升，從10倍以下的IC50開始），我們用逐步增加MET抑制劑JNJ-38877605的方法來處理EBC1 WT細(xì)胞。然后我們分析細(xì)胞活力和對(duì)藥物治療的兩種藥物的組合效應(yīng)的性質(zhì)，利用多藥效果分析。如圖5C所示，聯(lián)合治療導(dǎo)致的劑量盡可能低為1.2520 nm jnj-38877605在0.152.5毫克/毫升mv-dn30存在活性降低。當(dāng)在GTL16 WT 胃癌細(xì)胞上做這個(gè)實(shí)驗(yàn)室會(huì)得到相似的結(jié)果（圖5D）。如圖5A、B所示，多藥效應(yīng)分析表明了 EBC1

34、 and GTL16 WT細(xì)胞的CI值都小于1，從而表明了JNJ-38877605和 MV-DN30之間有藥物協(xié)同作用.所有的這些數(shù)據(jù)表明用MET TKI和MV-DN30聯(lián)合治療可以有效地減少嗜MET細(xì)胞的活性，劑量明顯低于單獨(dú)一種藥物治療的藥量。圖5 4.討論臨床效應(yīng)甚至是最有效的靶向治療都被發(fā)展的耐藥性所限制。顯而易見，這種耐藥性機(jī)制已經(jīng)被廣泛研究。從癌細(xì)胞和抗酪氨酸激酶抑制劑表明，獲得性耐藥的最常見的機(jī)制包括在藥物目標(biāo)本身的二次突變的患者獲得的數(shù)據(jù)，激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或平行的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活突變。 即使對(duì)關(guān)于癌癥是怎樣產(chǎn)生耐藥性抗體的了解很少，一些現(xiàn)象提示用抗EGFR 和抗HER2抗體治

35、療的病人體內(nèi)有耐藥機(jī)制的建立。在EGER中的二次突變表明了免疫調(diào)節(jié)藥物與EGFR的結(jié)合受到破壞從而調(diào)節(jié)了抵抗力。除此之外，最近的研究還證明了EGFR或HER2的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活可以分別繞過西妥昔單抗或曲妥單抗的抑制；這些包括EGFR配體水平增加，MET RTK的擴(kuò)增或過度表達(dá)，下游或平行激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在癌癥治療中MET受體已經(jīng)變成了最具關(guān)注的目標(biāo)，因?yàn)楹芏嘌芯勘砻鳎琈ET在多種人類腫瘤中具有組成性活性。它的失調(diào)可能是由于不同的機(jī)制包括過度表達(dá)，基因擴(kuò)增，激活突變和受體介導(dǎo)的刺激自分泌或旁分泌的增加。生殖細(xì)胞的激活突變的識(shí)別和遺傳型腎乳頭狀癌直接證明了MET和人類腫瘤發(fā)生有關(guān)的概念。MET

36、的酪氨酸激酶的結(jié)構(gòu)域中激活突變位點(diǎn)已經(jīng)在散發(fā)腫瘤中確定。然而，在人類癌癥中變化頻繁的是轉(zhuǎn)錄表達(dá)的過程，這個(gè)過程是由原癌基因激活誘導(dǎo)抑癌基因失活和對(duì)特定的為mRNA或缺氧刺激的下調(diào)過程。在原發(fā)性腫瘤中由基因擴(kuò)增引起的MET過度表達(dá)是少見的，但在肺癌和結(jié)腸癌中變得抗靶向其它RTKs治療的情況更頻繁。臨床證據(jù)表明癌細(xì)胞是沉溺在原癌基因中的細(xì)胞，在這種細(xì)胞中的MET具有組織性活性并且它們的抑制結(jié)果就是使其致瘤性被破壞。然而，用小劑量的激酶抑制劑延長(zhǎng)對(duì)嗜MET細(xì)胞的處理會(huì)導(dǎo)致二倍抗性的出現(xiàn)，這種機(jī)制可以被維持比如MET擴(kuò)增或突變,KRAS的擴(kuò)增或EGFR家族成員的活化。在我們的研究中表明,在嗜MET細(xì)胞中對(duì)MET特定抗體MV-DN30的抗性獲得是由于MET復(fù)制數(shù)量的大量增加。這一現(xiàn)象的機(jī)理解釋依賴于染色體外的MET復(fù)制的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，造成了一種癌癥對(duì)治療的適應(yīng)性程序。MET上調(diào)的增加是由于MET基因擴(kuò)增造成的這種現(xiàn)象并不明顯當(dāng)抗性細(xì)胞培養(yǎng)在有抗體（這種抗體介導(dǎo)了MET的下調(diào)）存在的條件下，但是在沒有這種抗體存在的條件卻是很明顯清晰的。我們觀察到蛋白的增加平行下來是METmRNA增加的23倍。EBC1 原代細(xì)胞的METcDNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)可以達(dá)到一個(gè)和抗性細(xì)胞一樣是表達(dá)水平，證明了事實(shí)上細(xì)胞表達(dá)更多的MET可以減少對(duì)MV-DN30抑制活