SODPODCATMDA和可溶性蛋白的測定

1、SOD、POD、MDA 、可溶性蛋白、脯氨酸、電導(dǎo)率、可溶性糖的測定一、磷酸緩沖液的配制：A 液： 0.2M 的 KH2PO4 溶液 稱取分析純 KH2PO427.216 克，用蒸餾水定容至 1000 毫升。B液：0.2M的KaHPO溶液稱取分析純KaHPO?3H2O45.644克，用蒸餾水定容至 1000毫升。 或（A液：0.2M的NaHPQ溶液 稱取分析純 NaHPQ?2H2O 31.21克，用蒸餾水定容至 1000 毫升。B液：0.2M的NaaHPQ溶液 稱取分析純 Na2HPQ?12HQ 71.64 克，用蒸餾水定容至 1000 毫升。）二、酶液的制備：稱取0.5g樣品放入研缽中， 加

2、2毫升0.05M PH=7.8的磷酸緩沖液及少量石英砂，冰浴研磨，勻漿倒入10毫升離心管中，再加3毫升磷酸緩沖液沖洗研缽，4C 冷凍離心 20分鐘（若做可溶性蛋白， 轉(zhuǎn)速為 4000轉(zhuǎn)/分鐘， 若不做， 則 10000轉(zhuǎn)/分鐘）， 上清液（酶液）倒入試管中，置于040C 下保存待用。三、SOD 的測定：1.SOD 反應(yīng)液的配制：母液的配制：（1）0. 05M 磷酸緩沖液（PH=7.8 ）： A 液 21.25 ml+B 液 228.25ml 定容至 1000 ml;（2）130mM Met（甲硫氨酸）：取1.9399克Met用磷酸緩沖液定容至 100ml;棕色瓶避光4 C保存。（3） 750卩

3、M四氮唑藍（NBT ）：取0.06133gNBT用磷酸緩沖液定容至 100 ml;棕色瓶避光4C保存。（4）100卩M EDTA-Na 2:取0.0372g EDTA-Na 2用磷酸緩沖液定容至 1000ml，棕色瓶避光保存;（5）20卩M FD （核黃素）:0.00753gFD用蒸餾水定容至 1000ml。隨用隨配。棕色瓶避光保存;SQD 反應(yīng)混液：磷酸緩沖液：Met: NBT : EDTA-Na 2：出0的比例為15： 3: 3： 3： 2.5,按母液順序 配制，然后依次加入核黃素和酶液。2.SOD的測定：取型號相同的試管，吸取 20微升的酶液，加入 3毫升，4000LUX照光30分 鐘，

4、同時取兩支試管， 一支做對照， 一支做空白 （對照、 空白不加酶液， 以緩沖液代替） ; 空白置暗處，對照（CK）與酶液同置于4000LUX條件下照光30分鐘，反應(yīng)后遮光保存， 以空白調(diào)零，560nm比色。每個試驗重復(fù)三次（3試驗+3空白+3對照）3. 結(jié)果計算SOD 總活性（吸光度 /g FW） = （ Ack Ae）x V/（ WX 0.5 X Vt X Ack） 單位： NBT 光還原 50%為單位SOD比活性（酶單位/mg蛋白）=SOD總活性/蛋白質(zhì)濃度SOD總活性以鮮重酶單位每克表示（u/g FW）;比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示；Ack為照光對照管的吸光度；Ae為樣品管的吸光度；

5、V為樣品液總體積；Vt為測定時的酶液用量（ml, 30ul） ； W為樣品鮮重（g）；蛋白質(zhì)含量單位為 mg/g。注意 ： 1.要 10ml 離心管，不要大試管，否則槍頭夠不著，不好吸；2提取液預(yù)冷；3. 測的樣品值要在最大管的一半左右才合適，否則要調(diào)整酶量4. 照光時間和強度嚴格控制，試管要透明，質(zhì)地均一。四、 POD 的測定：1. 0.1M PH6.0 磷酸緩沖液的配制： A 液 219.25+B 液 30.75，定容至 1000 毫升；2. POD 反應(yīng)液的配制 ：0.1M PH 6.0 的磷酸緩沖液 50 毫升于燒杯中，加入愈創(chuàng)木酚 28微 升，磁力攪拌器加熱攪拌使之完全溶解，冷卻后加

6、入30%H 2O219 微升混合，保存于冰箱中。3. POD 的測定 ： 20 微升酶液 +3 毫升反應(yīng)液于比色皿中，以 PBS 為對照調(diào)零，在 470nm 下每隔1分鐘讀數(shù)一次，共讀三次，以每分鐘吸光度變化值（ A470/min mg pr或厶A470/ mgFW ）表示酶活力的大小。結(jié)果計算：POD 活性 POD= （ A470X V） / （W VsXO.01 X）（u/g min） A470為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重（g）; t為反應(yīng)時間（min） ; Vt為提取酶液總體積（ ml）； Vs 為測定時取用酶液體積（ ml）五、MDA 的測定：1. MDA反應(yīng)液的配置：0.6

7、克TBA （硫代巴比妥酸），先用少量1MNaOH溶解，用10%TCA （三氯乙酸）定容至 100 毫升。1. MDA 的測定： 1 毫升酶液 +2 毫升 0.6%的 TBA ，封口沸水浴 15分鐘，迅速冷卻后 1500 轉(zhuǎn) 10min 離心，取上清液，在 600、532、450nm 三個波長下比色。2. 結(jié)果計算：MDA濃度 C （umol/L）=6.45（OD532-OD600）-0.56OD450MDA含量（umol/g FW）=C X V/WV為提取液體積（ml） , W為樣品鮮重（g）六、可溶性蛋白的測定反應(yīng)液配制：0.1克G-250溶于50毫升90%乙醇中，加入100毫升85%磷酸，

8、定容至 1000 毫升，在過夜后過濾并貯于棕色瓶中，常溫下可在暗中保存一個月。100卩g/m牛血清蛋白（BSA）標準溶液：10mg BSA,0.9 %氯化鈉溶解，定容至 100ml 測定：20微升酶液+80卩1 0.05M , pH7.8磷酸緩沖液+2.9毫升G-250放置2分鐘，595 納米比色，同時做空白（100微升緩沖液+3毫升G-250為對照調(diào)零）。結(jié)果計算： 可溶性蛋白可溶性蛋白質(zhì)含量（mg/g） =（CXVT）/（WXVSX1000）C為標準曲線查得的蛋白質(zhì)含量（卩g）; VT為提取液總體積（稀釋后的體積 ml）; VS為測定時所用提取液體積（ml, 20卩l(xiāng)）; W為樣品鮮重（g

9、）七、脯氨酸含量的測定試劑配制：0.3%磺基水楊酸： 3克磺基水楊酸，定容至 100毫升：2.5%酸性茚三酮（現(xiàn)配）：60 ml冰醋酸、16.4 ml磷酸加蒸餾水定容至 100 ml，再加入 2.5 g 茚三酮，溶解后避光保存標準脯氨酸液： 25mg 脯氨酸定容至 100nl。測定： 0.3 克葉片，加入 5 毫升磺基水楊酸研磨提取，倒入離心管，沸水浴 10分鐘，冷 卻3000轉(zhuǎn)離心10min，吸取濾液2毫升（同時作空白，吸取2毫升蒸餾水）、2毫升冰醋酸和 3 毫升酸性茚三酮，沸水浴 40 分鐘，冷卻，加入 5 毫升甲苯，充分振蕩，靜止分層，取 上層甲苯溶液于比色皿中，以甲苯為空白對照， 52

10、0納米下比色。結(jié)果計算：脯氨酸含量（卩g/g鮮重）=CX V/Va/W八、植物細胞質(zhì)膜透性的測定（電導(dǎo)儀法）（ 1 ）取新鮮葉片或根系（不能萎蔫） 0.3g ，用自來水沖洗表面污漬，再用去離子水沖洗幾 遍后用吸水紙吸干水分；（ 2）樣品剪碎（也可打孔取樣）放入試管（或15ml 大離心管）中，加 10ml 去離子水，在室溫下放置3h,期間多次搖動，使葉片充分吸水后測定溶液電導(dǎo)率（R1）;（3）再放入恒溫水浴鍋中在100 C沸水浴中煮 20min以殺死葉片組織，用冷水冷卻到室溫后測定溶液電導(dǎo)率 （R2）；（ 4）用公式計算質(zhì)膜相對透性（用相對電導(dǎo)率表示）：相對電導(dǎo)率（% =R1/R2X 100%還可以計算植株傷害程度：傷害率=（處理電導(dǎo)率一對照電導(dǎo)率）/ （煮沸電導(dǎo)率一對照電導(dǎo)率）x 100%九、可溶性糖105C殺青30 min , 85C烘干至恒重用于可溶性糖的測定將處理后的葉片稱取 0.02 g于刻度試