原位雜交探針設(shè)計(jì)原則

1、原位雜交探針大體可分為三類(lèi)：寡核苷酸探針，cDNA 探針， RNA 探針。寡核苷酸探針由25bp 左右的核苷酸組成，通常可以由公司合成，由于其序列較短，因此特異性較強(qiáng)，原位雜交時(shí)可以區(qū)分家族基因，同一基因的不同剪切體， cDNA 探針長(zhǎng)約500bp 左右，可以通過(guò)非對(duì)稱(chēng)PCR 擴(kuò)增合成，由于探針式 DNA ，可以有效的避免降解，但 DNA 和 RNA 的結(jié)合不如 RNA 與 RNA 結(jié)合強(qiáng)，通常不采用， RNA 探針長(zhǎng)約 500bp 左右，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄合成，如果設(shè)計(jì)合理，其特異性是可以得到保證的，其主要缺點(diǎn)是容易被RNAse 酶降解。查看原位雜交相關(guān)的文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)， 2000年以前的原位雜交常使用

2、放射性標(biāo)記的寡核苷酸探針，通過(guò)膠片曝光來(lái)顯色，2000 年以后的文獻(xiàn)常使用 RNA探針。許多腎臟發(fā)育的文獻(xiàn)雖然有很多原位雜交數(shù)據(jù)，但卻沒(méi)有附帶上探針序列或者用于探針模板克隆的引物，通過(guò)了解廈門(mén)黃老師斑馬魚(yú)和昆明毛炳宇爪蟾中原位雜交探針設(shè)計(jì)方法，我們可以采用RNA 探針。文獻(xiàn)中很難找到關(guān)于RNA 探針設(shè)計(jì)的原則，有的文獻(xiàn)報(bào)道直接用cDNA 合成 RNA 探針。借鑒爪蟾中原位雜交探針設(shè)計(jì)流程，以小鼠 FGF10的探針設(shè)計(jì)為例進(jìn)行介紹。1. 在 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載該 FGF10 的 mRNA 全序列，然后用 FGF10 的全長(zhǎng)在 NCBI 中 進(jìn) 行 BLAST 比 對(duì) 分 析 ， 比 對(duì) 數(shù)

3、據(jù) 庫(kù) 選 擇 mouse genome+transcript ，比對(duì)程序選擇 somewhat similar sequence 。ZebrafishseqRNAs精選文檔得出的比對(duì)結(jié)果中有一幅圖譜，顯示比對(duì)序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中序列的相似性，探針應(yīng)設(shè)計(jì)在與其它基因不存在明顯相似性的區(qū)段，在比對(duì)結(jié)果的圖譜中選擇可變區(qū)。如下圖黑色框區(qū)域。2. 估計(jì)黑色框堿基在 FGF10 mRNA 中的大致范圍，在這個(gè)范圍內(nèi)選擇長(zhǎng)約500bp 的序列設(shè)計(jì)探針。根據(jù)上圖信息，我們選擇FGF1030003800 的范2精選文檔圍進(jìn)行探針設(shè)計(jì)。agcac agaggcacaa tgctttggtt tatgggtata g

4、gttgcattt3301 tgtggtgttc tttcaacttg ttttctgaca aatgggattt ttaaaatgta tacttcttgt3361 ggttggattc tgtatgttag agtttaattg gtaactgagt ctaaaggctc taatgtaatg3421 aatctctaga agaactaggt atcttttttt acttttattt taaaataata attatacctg3481 acacatgacc atggaccacc cacaaccaaa attaaatgtt tggggagacaaactatagta3541 ttcagtg

5、aca agggtaacag caaatagtgc agacgttgga ttcttatttc actttgccat3601 ttagattact aaagagacta tgtgtaaaca gtcatcatta tagtactcaagacattaaac3661 agcttctagc aaaatgtatc aaagcttgca gagtccaaaa atagaaaacatctttccccc3721 tctcccaccc tacatttccc cctgtatgca tcctaacaga gat底紋標(biāo)注的為引物序列3. 將設(shè)計(jì)好的探針序列在 UCSC 上再次比對(duì)分析， genome 選擇 mouse ， query type 選擇 translated RNA ，點(diǎn)擊 submit ，保證搜索出的條目只有目標(biāo)基因，如果存在其它非目標(biāo)匹配項(xiàng)（既不是來(lái)自 FGF 基因的序列），則需要重新選擇一段探針序列。3精選文檔你可以點(diǎn)擊 browser 瀏覽一下所設(shè)計(jì)的探針序列是否是FGF10 的序列以及所在位置。在選擇探針序列時(shí)，盡量選擇3端的區(qū)域，避開(kāi)可能的選擇性剪切，同時(shí)也要避免mRNA 的末端序列，因?yàn)榭赡艽嬖?/p>