實(shí)驗(yàn)三血標(biāo)本的微生物學(xué)檢驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)三三 血標(biāo)本的微生物學(xué)檢驗(yàn)血標(biāo)本的微生物學(xué)檢驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩?shí)驗(yàn)?zāi)康模?掌握血液標(biāo)本的采集與處理、常見病原菌及一般微生物學(xué)檢驗(yàn)程序。 掌握葡萄球菌及鏈球菌的鑒定方法；熟悉它們的生物學(xué)性狀。 血液標(biāo)本的采集與處理：血液標(biāo)本的采集與處理： 血液標(biāo)本血液標(biāo)本應(yīng)在病人發(fā)熱12日或發(fā)熱高峰采集培養(yǎng)為宜。此時(shí)陽性率高。 采血培養(yǎng)應(yīng)該盡量在使用抗菌藥物之前進(jìn)行，從不同部位采集血液標(biāo)本，做2次血培養(yǎng)；心內(nèi)膜炎急性病例，在抗生素治療前，從不同部位采血3次做血液培養(yǎng)；亞急性心內(nèi)膜炎病例，第一天24h內(nèi)，相隔1h連續(xù)采集3次血標(biāo)本培養(yǎng)，若2448h全部陰性，再采集23次血標(biāo)本培養(yǎng)。 對(duì)間歇性寒戰(zhàn)或發(fā)熱應(yīng)在寒戰(zhàn)

2、或體溫高峰到來之前0.51h 采集血液，或于寒戰(zhàn)或發(fā)燒后1h進(jìn)行。 入院前兩周內(nèi)接受抗菌藥物治療的患者，連續(xù)3d，每天采2 份。（如果病人曾服用磺胺類藥物，應(yīng)在每50 ml 培養(yǎng)基內(nèi)加對(duì)氨苯甲酸2.5 mg ， 以防止磺胺類藥物對(duì)細(xì)菌的抑制作用。如果病人已用青霉素治療，應(yīng)在培養(yǎng)基中加入青霉素酶100 U50 ml （青霉素酶不耐熱，應(yīng)在臨用時(shí)加入）。若病人已用其他抗生素治療時(shí)，可用硫酸鎂肉湯增菌。） 采集時(shí)應(yīng)以無菌手續(xù)由靜脈取血510ml，兒童15ml，立即注入適當(dāng)?shù)囊后w增菌增菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)（培養(yǎng)基與血液的比例為10:1），并迅速輕搖，使充分混勻，以防凝固，并有利于細(xì)菌生長(zhǎng)。（疑似細(xì)菌性心內(nèi)膜炎時(shí)

3、，以肘動(dòng)脈疑似細(xì)菌性心內(nèi)膜炎時(shí)，以肘動(dòng)脈或股動(dòng)脈采血為宜或股動(dòng)脈采血為宜） 作厭氧菌培養(yǎng)時(shí)，抽血后應(yīng)立即接種厭氧培養(yǎng)基中，避免接觸空氣，并盡快送往細(xì)菌室放入溫箱，避免溫度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)不利。 采血后應(yīng)該立即送檢，如不能立即送檢，可室溫保存（25 ），切勿冷藏。 采血和接種時(shí)應(yīng)嚴(yán)格注意無菌操作，避免污染雜菌。 培養(yǎng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高的細(xì)菌用肝浸液或胰胨肉湯等。 同一份血液標(biāo)本，必須同時(shí)做需氧和厭氧培養(yǎng)。種種 類類病病 原原 菌菌革蘭陽性球菌革蘭陽性球菌金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌、草綠金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌、草綠色鏈球菌、腸球菌色鏈球菌、

4、腸球菌革蘭陽性桿菌革蘭陽性桿菌結(jié)核分枝桿菌、產(chǎn)單核李斯特菌、陰道加特納菌結(jié)核分枝桿菌、產(chǎn)單核李斯特菌、陰道加特納菌革蘭陰性球菌革蘭陰性球菌腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、卡他布蘭漢菌腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、卡他布蘭漢菌革蘭陰性桿菌革蘭陰性桿菌大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、克雷伯桿菌、腸桿菌、變形桿菌、沙雷菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、克雷伯桿菌、腸桿菌、變形桿菌、沙雷菌、沙門菌、不動(dòng)桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌、嗜血桿菌沙門菌、不動(dòng)桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌、嗜血桿菌真菌真菌念球菌、曲霉菌、隱球菌、球孢子菌念球菌、曲霉菌、隱球菌、球孢子菌厭氧菌厭氧菌擬桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌擬桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌常見病原體：常見病原體： 檢驗(yàn)程序

5、：血標(biāo)本（無菌采集）血標(biāo)本（無菌采集） 增菌培養(yǎng)增菌培養(yǎng)硫酸鎂葡萄糖肉湯（需氧培養(yǎng);如檢測(cè)沙門氏菌用膽汁葡萄糖肉湯，如檢測(cè)厭氧菌用硫乙醇酸鈉肉湯） 觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況直接涂片染色 分離培養(yǎng) 直接藥敏試驗(yàn)需氧培養(yǎng)（BA） CO2培養(yǎng)（CA） 厭氧培養(yǎng)（BA） 觀察菌落形態(tài)、涂片染色鏡檢血清學(xué)鑒定 生化鑒定 藥敏試驗(yàn)確定病原菌發(fā)報(bào)告 接種于增菌肉湯培養(yǎng)基后，立即置35 1 溫箱內(nèi)孵育，每天取出一次觀察有無細(xì)菌生長(zhǎng)，應(yīng)特別注意觀察肉湯內(nèi)有無混濁、沉淀、菌膜、色素、血液變色、指示劑變色等現(xiàn)象，并記錄之。連續(xù)觀察7天。 35 1 溫箱內(nèi)孵育1218h后，在BA或CA上盲目傳種一次，如無菌生

6、長(zhǎng)繼續(xù)培養(yǎng)到第7天，取出后接種于BA，再在BA或CA上盲目傳種一次經(jīng)培養(yǎng)仍無細(xì)菌生長(zhǎng)，可報(bào)告為：“經(jīng)7天培養(yǎng)無細(xì)菌生長(zhǎng)”。對(duì)于亞急性心內(nèi)膜炎病人標(biāo)本，應(yīng)培養(yǎng)1個(gè)月，才能得出結(jié)論。（可疑布魯菌培養(yǎng)28天，可疑軍團(tuán)菌培養(yǎng)10天） 如有菌生長(zhǎng)，增菌肉湯會(huì)呈現(xiàn)不同生長(zhǎng)現(xiàn)象，若發(fā)生渾濁，多為G-桿菌；若均勻渾濁有綠色熒光，則可疑為綠膿桿菌；上面澄清，下面有沉淀，可疑為鏈球菌；若見自下而上的溶血現(xiàn)象，可疑為溶血性鏈球菌；若呈現(xiàn)肉凍樣凝固現(xiàn)象，疑為葡萄球菌；若表面有灰色菌膜，疑為枯草桿菌或類白喉?xiàng)U菌。 目前L 型菌感染敗血癥亦有報(bào)告，主要是由于使用抑制菌細(xì)胞壁合成的抗菌藥物（青霉素G 、氨基芐青霉素、苯唑青

7、霉素、先鋒霉素、萬古霉素和環(huán)絲霉素等）治療過程中，失去細(xì)胞壁的菌體繼續(xù)繁殖感染所致。因此，結(jié)合臨床，在多次培養(yǎng)無菌生長(zhǎng)的情況下要考慮L型細(xì)菌感染. 檢驗(yàn)程序： 革蘭陽性球菌 觸酶 + - 葡萄糖發(fā)酵 鏈球菌屬 + - + - + - S R玻片凝固酶 微球菌 金黃色葡萄球菌 試管凝固酶 金黃色葡萄球菌 新生霉素敏感 表皮葡萄球菌 腐生葡萄球菌 實(shí)驗(yàn)器材：1、標(biāo)本：已增菌模擬血液標(biāo)本1#、2#、3#、4#。2、培養(yǎng)基：BA、高鹽甘露醇平板。3、試劑：生理鹽水、3%過氧化氫、人血漿、10萬單位溶于pH7.4 0.05M磷酸鹽緩沖液的青霉素、0.05%溴麝香草酚蘭溶液、產(chǎn)內(nèi)酰胺酶陽性菌（金黃色葡萄球

8、菌）和陰性菌（檸檬黃色葡萄球菌）、革蘭染色液等。 實(shí)驗(yàn)方法：實(shí)驗(yàn)方法：一、分離培養(yǎng) 用無菌方法將已增菌模擬血液標(biāo)本1#、2#、3#、4#分別劃線接種于血平板上，置35培養(yǎng)1824小時(shí)。二、直接涂片染色 取上述1#、2#、3#、4#標(biāo)本分別作涂片、革蘭氏染色、鏡檢。（要求繪圖并描述）三、結(jié)果觀察1、菌落形態(tài)描述： 1#標(biāo)本： 2#標(biāo)本： 3#標(biāo)本： 4#標(biāo)本：2、菌體形態(tài)觀察： 分別取1#、2#、3#、4#標(biāo)本的血平板培養(yǎng)物涂片、革蘭染色、鏡檢。 。（要求繪圖并描述） 四、鑒別試驗(yàn)1、觸酶試驗(yàn)（過氧化氫酶試驗(yàn)）：觸酶試驗(yàn)（過氧化氫酶試驗(yàn)）：原理：原理：葡萄球菌產(chǎn)生的觸酶（過氧化氫酶），能催化過氧

9、化氫分解成水和初生態(tài)氧，繼而形成氧分子出現(xiàn)氣泡。方法：方法：用接種環(huán)挑取待檢菌菌落，置于潔凈載玻片上，滴加3%H2O2溶液1滴，1分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。結(jié)果判斷結(jié)果判斷 陽性：產(chǎn)生大量氣泡。 陰性：不產(chǎn)生氣泡或緩慢產(chǎn)生少量氣泡。意義：意義：本試驗(yàn)用于鑒別葡萄球菌和鏈球菌，前者為陽性；后者為陰性。注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：1、本試驗(yàn)不適宜用血平板上的菌落，因紅細(xì)胞內(nèi)含有此酶，會(huì)出現(xiàn)假陽性。2、應(yīng)使用新鮮培養(yǎng)菌，因陳舊培養(yǎng)物可失去酶活性。3、H2O2濃度過高，產(chǎn)生假陽性。2、血漿凝固酶試驗(yàn)、血漿凝固酶試驗(yàn)：（葡萄球菌屬細(xì)菌屬內(nèi)鑒別試驗(yàn)）：（葡萄球菌屬細(xì)菌屬內(nèi)鑒別試驗(yàn)）原理：原理：金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶

10、，可使血漿中的纖維蛋白原變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白，附著于細(xì)菌表面，在玻片上形成凝塊；也可使試管中的血漿發(fā)生凝固。玻片法：玻片法：取兔或人血漿及生理鹽水各一滴（或用接種環(huán)取12環(huán)），分別滴于潔凈載玻片上，用接種環(huán)從血平板上挑單個(gè)菌落，分別與血漿和生理鹽水混合，觀察結(jié)果。結(jié)果判斷結(jié)果判斷 陽性：被檢菌與血漿產(chǎn)生顆粒性凝集而與生理鹽水不產(chǎn)生凝集。 陰性：二者均不凝集。意義：意義：血漿凝固酶試驗(yàn)是鑒定致病性葡萄球菌和非致病性葡萄球菌的重要試驗(yàn)之一，前者多為陽性，后者為陰性。五、五、生化生化鑒定鑒定1、葡萄球菌鑒定： 將1#、2#、3#、4#標(biāo)本中葡萄球菌劃線接種于高鹽甘露醇平板上，置35培養(yǎng)1824小時(shí)。原

11、理：葡萄球菌屬細(xì)菌能耐高鹽（2.5%氯化鈉），且致病性葡萄球菌多能發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色（高鹽甘露醇平板的指示劑為酚紅）。結(jié)果判斷 陽性：培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色。 陰性：培養(yǎng)基仍為紅色。意義：致病性葡萄球菌可呈陽性，非致病性葡萄球菌為陰性。2、鏈球菌鑒定：、鏈球菌鑒定： 將1#、2#、3#、4#標(biāo)本中鏈球菌劃線接種于七葉苷斜面、6.5%NaCl肉湯培養(yǎng)基上，置35培養(yǎng)1824小時(shí)。1）七葉苷分解試驗(yàn)）七葉苷分解試驗(yàn)原理：原理：腸球菌能水解七葉苷，生成葡萄糖和七葉素，七葉素與培養(yǎng)基中的枸櫞酸鐵的Fe3+起反應(yīng)，形成黑色沉淀，使培養(yǎng)基變黑色。結(jié)果判斷：結(jié)果判斷： 陽性 培養(yǎng)基變黑色。

12、 陰性 培養(yǎng)基不變。意義意義： 此試驗(yàn)是鑒定腸球菌和其他鏈球菌的重要試驗(yàn)。腸球菌為陽性，其他鏈球菌為陰性。 2）6.5%NaCl生長(zhǎng)試驗(yàn)： 原理：原理：腸球菌具有很強(qiáng)的耐鹽能力，能在65%NaCl血清肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)呈渾濁。 結(jié)果結(jié)果判斷判斷： 陽性 血清肉湯渾濁生長(zhǎng)。 陰性 血清肉湯透明。 意義意義： 此試驗(yàn)是鑒定腸球菌和其他鏈球菌的重要試驗(yàn)。腸球菌為陽性，其他鏈球菌為陰性（即耐鹽能力較弱，不能在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)）。 六、藥敏試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)內(nèi)酰胺酶檢測(cè)內(nèi)酰胺酶檢測(cè)原理：原理：內(nèi)酰胺酶是主要由金黃色葡萄球菌和淋病奈瑟菌等所產(chǎn)生的抗菌素滅活酶。它能裂解青霉素類和頭孢菌素類抗生素的基本結(jié)構(gòu)內(nèi)酰胺環(huán)，從而使其喪失抗菌活性。細(xì)菌產(chǎn)生的內(nèi)酰胺酶可將內(nèi)酰胺類抗生素降解成酸性產(chǎn)物。pH指示劑檢測(cè)溶液pH變化即可知細(xì)菌對(duì)內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性。方法：方法：1、取3支小試管，各加10萬單位青霉素溶液0.05ml。2、分別用接種環(huán)挑取內(nèi)酰胺酶陽性對(duì)照菌、陰性對(duì)照菌和待測(cè)菌的菌落數(shù)個(gè)于上述3支小試管中，制成濃稠菌懸液，37水浴1小時(shí)。3、分別加入1小滴溴麝香草酚蘭指示劑于試驗(yàn)菌液中，觀察顏色變化。結(jié)果判斷：結(jié)果判斷： 陽性菌：溴麝香草酚蘭指示劑呈黃色。 陰性菌：呈綠色。注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：1、試驗(yàn)菌必須是新鮮菌，細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)，酶失去活性，試驗(yàn)出現(xiàn)假陰性。2、細(xì)菌懸液