transwell試驗(yàn)方法

1、第一節(jié) 概念這里想明確兩個(gè)概念，一個(gè)是Transwell，另一個(gè)是腫瘤細(xì)胞侵襲模型。1.Transwell關(guān)于Transwell這個(gè)詞該如何解釋，查了很多資料也未見準(zhǔn)確的注解，我覺(jué)得可以這么理解吧，trans-這個(gè)詞根有轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)運(yùn)、穿過(guò)等意思，well有小室的意思，可以從字面上理解，這是一類有通透性的杯狀的裝置，根據(jù)Corning公司的Transwell說(shuō)明書中的介紹，可以認(rèn)為這是一種膜濾器（Membrane filters），也可認(rèn)為是一種有通透性的支架（permeable supports）。更準(zhǔn)確地說(shuō)，Transwell應(yīng)該是一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)的主要材料是Transwell小室（Tr

2、answell chamber，Transwell insert），其外形為一個(gè)可放置在孔板里的小杯子，不同廠家對(duì)Transwell會(huì)有不同的命名，而不同型號(hào)也可有不同形狀，不同大小，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，可有不同選擇。但無(wú)論是何種外形，其關(guān)鍵部分都是一致的，那就是杯子底層的一張有通透性的膜，而杯子其余部分的材料與普通的孔板是一樣。這層膜帶有微孔，孔徑大小有0.112.0µm，根據(jù)不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。下圖是一個(gè)Transwell裝置的縱切面將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上室內(nèi)盛裝上

3、層培養(yǎng)液，下室內(nèi)盛裝下層培養(yǎng)液，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。我們將細(xì)胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)等的影響。應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)過(guò)不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進(jìn)行共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等多種方面的研究。下面參考guxuefeng戰(zhàn)友和cosmosci戰(zhàn)友的帖子具體來(lái)談?wù)効讖降倪x擇，當(dāng)然不同細(xì)胞其體積不同，具體選擇時(shí)要考慮到細(xì)胞大小。這里主要談幾種大家常用的實(shí)驗(yàn)： （1）共培養(yǎng)體系：小于3.0um孔徑條件下，細(xì)胞不會(huì)遷徙通過(guò)，因此，若研究不涉及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力，不需要細(xì)胞穿過(guò)聚碳酸酯膜，則應(yīng)選

4、擇3.0µm以下孔徑。常用 0.4、3.0µm。我們實(shí)驗(yàn)室用的是0.4µm。將細(xì)胞A種于上室，細(xì)胞B種于下室，可以研究細(xì)胞B分泌或代謝產(chǎn)生的物質(zhì)對(duì)細(xì)胞A的影響。（2）趨化性實(shí)驗(yàn)可用5.0、8.0、12.0µm膜，上室細(xì)胞可穿過(guò)聚碳酸酯膜進(jìn)入下室，計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量可反映下室成分對(duì)上室細(xì)胞的趨化能力。細(xì)胞B對(duì)細(xì)胞A的趨化作用：將細(xì)胞A種于上室，細(xì)胞B種于下室，可以研究細(xì)胞B分泌或代謝產(chǎn)生的物質(zhì)對(duì)細(xì)胞A的趨化作用。趨化因子對(duì)細(xì)胞的趨化作用：將細(xì)胞種于上室，下室加入某種趨化因子，可研究該趨化因子對(duì)細(xì)胞的趨化作用。（3）腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)常用8.0、12.0&#

5、181;m膜，上室種腫瘤細(xì)胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細(xì)胞會(huì)向營(yíng)養(yǎng)成分高的下室跑，計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量可反映腫瘤細(xì)胞的遷移能力。（4）腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)常用8.0、12.0µm膜，原理與腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)類似。上室種腫瘤細(xì)胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細(xì)胞會(huì)向營(yíng)養(yǎng)成分高的下室跑，但與腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)不同的是，聚碳酸酯膜上室側(cè)鋪上一層基質(zhì)膠，用以模仿體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞欲進(jìn)入下室，先要分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）將基質(zhì)膠降解，方可通過(guò)聚碳酸酯膜。計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量可反映腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。2.腫瘤細(xì)胞侵襲模型 用于研究腫瘤細(xì)胞侵襲能力的腫瘤細(xì)胞侵襲模型有如

6、下幾種（引自司徒鎮(zhèn)強(qiáng)細(xì)胞培養(yǎng)）：2.1 體內(nèi)癌細(xì)胞侵襲模型2.1.1 皮下移植侵襲模型2.1.2 肌肉內(nèi)移植侵襲模型2.1.3 腹腔內(nèi)移植侵襲模型2.1.4 小鼠腎包膜下移植侵襲模型2.1.5 鼠睪丸包膜下移植侵襲模型2.1.6 小鼠耳廓皮下移植侵襲模型2.1.7 鼠爪墊皮下移植侵襲模型2.1.8 視網(wǎng)內(nèi)界膜侵襲模型2.2 體外癌細(xì)胞侵襲模型2.2.1 體外靜止器官培養(yǎng)法2.2.1.1 半固體培養(yǎng)基單細(xì)胞器官培養(yǎng)法2.2.1.2 液體培養(yǎng)基單細(xì)胞器官培養(yǎng)法2.2.2 半體外半體內(nèi)器官培養(yǎng)法2.2.3 單層細(xì)胞器官培養(yǎng)法2.2.4 瘤細(xì)胞球體器官培養(yǎng)法2.2.4.1 靜止球體器官培養(yǎng)法2.2.4

7、.2 旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)球體器官培養(yǎng)法2.2.5 單層細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?.2.6 Transwell侵襲小室測(cè)定法可見，Transwell與侵襲實(shí)驗(yàn)之間并不能劃等號(hào)，Transwell有多種應(yīng)用，侵襲實(shí)驗(yàn)也有多種方法。所謂Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，其實(shí)是指將Transwell這一技術(shù)應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞侵襲研究的一種實(shí)驗(yàn)。由于其簡(jiǎn)單易行、重復(fù)性好，因而得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，但不能認(rèn)為研究腫瘤侵襲只有Transwell一種方法。第二節(jié) Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 我的課題涉及Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)，其他方面的Transwell應(yīng)用我不太清楚，因此這里主要談?wù)?Transwel

8、l侵襲實(shí)驗(yàn)。1.實(shí)驗(yàn)用品： Transwell小室：多種廠家可提供，論壇里常用的是Costar、Corning、BD生產(chǎn)的小室，我們實(shí)驗(yàn)室用的是Chemicon公司的ECM550系列，另有 Boyden chamber、Millipore公司的millicell和雕弓滿月射天狼戰(zhàn)友介紹的Thincert。這些廠家提供的小室，有的已鋪好基質(zhì)膠，買來(lái)就可以用，很方便，但也比較貴，我們實(shí)驗(yàn)室用的Chemicon公司的ECM550系列是已經(jīng)鋪好膠的，質(zhì)量很好，但是非常貴，24孔板配套的小室，每個(gè)價(jià)格約130元，不推薦給大家。BD也有已包被好的，價(jià)格不清楚。Coster和Corning公司生產(chǎn)的小室，是

9、論壇里比較常用的，好像是要自己鋪膠，但據(jù)說(shuō)每個(gè)小室成本只有40左右，應(yīng)該比較適合中國(guó)國(guó)情。下面是一些戰(zhàn)友提供的價(jià)格，具體建議大家聯(lián)系代理商咨詢。linanping1979戰(zhàn)友提供的價(jià)格：coster的24孔板的transwell 的價(jià)格是456元RMB,8µm，用于腫瘤的侵襲實(shí)驗(yàn)。iceyxy戰(zhàn)友提供的價(jià)格：Millipore的8µm的50個(gè)1760RMB,0.4µm的 2000多,是一次性的。梅林戰(zhàn)友提供的BD價(jià)格： 240RMB一塊（6.5um,24孔,12instert），好像是沒(méi)膠的。liguofan說(shuō)國(guó)產(chǎn)的boyden30塊一個(gè)。jjyy提供的價(jià)格是：c

10、orning cat No.3422. 6.5mm transwell with 8.0um prore polycarbonate membrane insert, Qty 48,950人民幣不到。平均每個(gè)20元不到。Transwell小室按照公司的要求，都是一次性使用的。不過(guò)其實(shí)洗洗泡泡還是可以重復(fù)用的。我用的Chemicon公司的ECM554，用完后擦去基質(zhì)膠，再用胰酶和75%酒精泡，可以把膜洗得很干凈，用前用紫外里外都照30min。sword01戰(zhàn)友提供的處理方法：用棉簽輕輕擦去膠和反面細(xì)胞，清水沖洗，超聲清洗，低擋，30min，清水3×5min，蒸餾水3×5min

11、，室溫涼干，用前紫外線小室正面3h，反面6h，微波，低火 10min×2。因?yàn)槲屹I的是鋪好膠的，所以沒(méi)買Matrigel，二次利用的小室只用來(lái)做不需要鋪膠的遷移實(shí)驗(yàn)。以前的Chemicon ECM550系列，膜很結(jié)實(shí)，擦不壞，可以反復(fù)用很多次，但現(xiàn)在的膜已經(jīng)改用一種很薄很脆的材料，一般只能重復(fù)用一次，真黑??！很多戰(zhàn)友說(shuō)Costar和 Corning也是可以重復(fù)用的，大家可以試試。本人沒(méi)見過(guò)，有興趣的可以自己研究一下。另外，根據(jù)論壇戰(zhàn)友提供的信息，osmonic公司有專用的膜出售，鼎國(guó)生物代理。Transwell小室用過(guò)后，可把原來(lái)的膜切下，貼上 osmonic公司的膜，這樣又可以用了

12、，不過(guò)我沒(méi)用過(guò)，有興趣的可以試試。maojianwen戰(zhàn)友的使用方法： trasnwell小室做一次后，將原來(lái)的膜去掉，重新泡酸，泡酒精，使用前照紫外，然后用女士用指甲油（注意用無(wú)色較稀的）將osmonic公司的膜貼上，剪掉多余的邊緣。再照紫外。 上層培養(yǎng)液：上層培養(yǎng)液采用無(wú)血清培養(yǎng)基，為維持滲透壓，需加入0.05%-0.2% BSA。 細(xì)胞：值得注意的是，有侵襲能力的細(xì)胞才可用于Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。建議實(shí)驗(yàn)前先用酶譜法檢測(cè)MMPs的表達(dá)，特別是MMP-2的表達(dá)。如果不清楚細(xì)胞MMPs的表達(dá)情況，就盲目進(jìn)行Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，可能會(huì)造成不必要的浪費(fèi)，一次Transwell侵襲實(shí)

13、驗(yàn)花錢少則數(shù)百，多則數(shù)千，并不是筆小數(shù)目，還是小心為妙。另外，為了讓實(shí)驗(yàn)結(jié)果更明顯，可先撤血清讓細(xì)胞饑餓1224h，再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 基質(zhì)膠： 常用的是人工重構(gòu)基底膜材料Matrigel，主要成分為層黏連蛋白和型膠原，生產(chǎn)廠家有BD、美國(guó)Collaborative Rsearch公司等。CaoY戰(zhàn)友的帖這么說(shuō)的：Matrigel是BD公司生產(chǎn)的，是一種細(xì)胞外基質(zhì)，4度時(shí)是液體，在37度會(huì)逐漸凝固成膠狀，不可逆。同樣的東西在sigma叫ECM。zhangyong1036戰(zhàn)友提供的價(jià)格：BD公司的matrigel 1500左右。如果購(gòu)買的小室是已經(jīng)鋪好基質(zhì)膠的，那么Matrigel就不需要購(gòu)買了。 下

14、層培養(yǎng)液：下層常用含5%10% FBS的培養(yǎng)基，具體濃度根據(jù)細(xì)胞侵襲力而定，侵襲力弱的細(xì)胞可適當(dāng)提高FBS濃度。下層也可用趨化因子，有戰(zhàn)友將纖維粘連蛋白加入下層培養(yǎng)液作為趨化因子，但個(gè)人認(rèn)為，F(xiàn)BS仍是最合適的。 細(xì)胞培養(yǎng)板：常用于Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)板有6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔最常用。細(xì)胞培養(yǎng)板沒(méi)什么特殊要求，普通的細(xì)胞培養(yǎng)板就可以。但要注意，細(xì)胞培養(yǎng)板應(yīng)當(dāng)與購(gòu)買的Transwell小室相配套。 此外，膜的下室面可涂上纖維粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N，Sigma有售)，這樣做的目的是使穿過(guò)膜的細(xì)胞更好地附著在膜上，也可用膠原（collagen）或明膠（

15、gelatin）。很多戰(zhàn)友認(rèn)為這不是必須的，而且我也是不涂的，細(xì)胞照樣貼壁很好。如果貼壁不好的話可以試試看。 linanping1979戰(zhàn)友認(rèn)為，如果培養(yǎng)時(shí)間很長(zhǎng)（>24h），細(xì)胞還是會(huì)掉到下室里面去，所以有條件的話，最好還是在膜下層涂上FN。另外，值得一提的是，膜下層涂上FN還有一定的趨化作用。2步驟2.1 Transwell小室制備2.1.1 無(wú)基質(zhì)膠Transwell小室制備 包被基底膜：用50mg/LMatrigel 1:8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4風(fēng)干。如果需要在下室面鋪FN的話，可將200ul槍頭的尖端剪掉,吸取FN均勻涂抹在小室的下面。用膠原（col

16、lagen）的話，一般配成0.5mg/ml，直接用槍吸了涂在膜上。 水化基底膜：吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50ul含10g/LBSA的無(wú)血清培養(yǎng)液，37，30min。另有tianjin_glioma戰(zhàn)友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀釋后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80µl (注意體積不可太大，以剛把聚碳酸酯膜浸濕為最好)，置37 30min使Matrigel聚合成凝膠。2.1.2 有基質(zhì)膠的Transwell小室制備Chemicon公司的ECM550系列說(shuō)明書要求，將小室放入培養(yǎng)板中，在上室加入300µl預(yù)溫的無(wú)血清培養(yǎng)基，室溫下靜置1530

17、min，使基質(zhì)膠再水化。再吸去剩余培養(yǎng)液。2.2 制備細(xì)胞懸液 制備細(xì)胞懸液前可先讓細(xì)胞撤血清饑餓1224h，進(jìn)一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。 消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗12遍，用含BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至110×105，個(gè)人認(rèn)為不要超過(guò) 5×105。具體實(shí)驗(yàn)時(shí)采用密度要自己摸索，因?yàn)椴煌?xì)胞，其侵襲能力是不同的。個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，細(xì)胞量過(guò)多，穿過(guò)膜的細(xì)胞會(huì)過(guò)多過(guò)快，如果最后用計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)結(jié)果的話將難以計(jì)數(shù)；而過(guò)少的話，可能還沒(méi)到檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)，所有的細(xì)胞都已穿過(guò)，因此最少也要保證在收樣的時(shí)候，上室內(nèi)還要有一定量的細(xì)胞存在。個(gè)人認(rèn)為，對(duì)照

18、組和處理盡量不要分開計(jì)數(shù)，因?yàn)榧?xì)胞數(shù)目的差異會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如果需要對(duì)細(xì)胞預(yù)處理而不得不分開計(jì)數(shù)，那么計(jì)數(shù)一定要多重復(fù)幾次，力求準(zhǔn)確，盡量保證對(duì)照組和處理組細(xì)胞密度一致。2.3 接種細(xì)胞 取細(xì)胞懸液100200µl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室對(duì)細(xì)胞懸液量有不同要求，請(qǐng)參考說(shuō)明書。24孔板小室一般200µl。 24孔板下室一般加入500µl含F(xiàn)BS或趨化因子的培養(yǎng)基，不同的培養(yǎng)板加的量有不同要求，具體請(qǐng)參考說(shuō)明書。這里要特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會(huì)有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，

19、在種板的時(shí)候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。 培養(yǎng)細(xì)胞：常規(guī)培養(yǎng)1248h（主要依癌細(xì)胞侵襲能力而定）。時(shí)間點(diǎn)的選擇除了要考慮到細(xì)胞細(xì)胞侵襲力外，處理因素對(duì)細(xì)胞數(shù)目的影響也不可忽視。以我的課題為例，我使用的藥物不僅會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞侵襲力，還對(duì)細(xì)胞增殖有明顯抑制。我選擇的藥物濃度是用MTT篩選出的72h的IC50。用這個(gè)濃度處理細(xì)胞，24h內(nèi)對(duì)細(xì)胞增殖并無(wú)明顯抑制，但24h后，抑制作用就開始出現(xiàn)了。所以，用這個(gè)濃度來(lái)做Transwell，處理時(shí)間也必須限定在24h 內(nèi)，否則一旦藥物抑制了細(xì)胞增殖或者誘導(dǎo)出凋亡，使處理組細(xì)胞數(shù)目少于對(duì)照組，那么就難以肯定穿過(guò)膜的

20、細(xì)胞比對(duì)照組少，究竟是由于侵襲被抑制引起，還是處理后細(xì)胞數(shù)目本身就比對(duì)照組少而引起的了。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)不可以，同樣，過(guò)短也不行，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)會(huì)有一定量的MMPs儲(chǔ)存，短時(shí)間內(nèi)可能侵襲能力不會(huì)有太大改變。同時(shí)從藥物被吸收進(jìn)去，進(jìn)而發(fā)揮作用，影響MMPs表達(dá)，到最后釋放到培養(yǎng)基中，還需要一個(gè)過(guò)程。時(shí)間點(diǎn)的選擇可盡量長(zhǎng)點(diǎn)，也可選擇多個(gè)時(shí)間點(diǎn)研究時(shí)間依賴效應(yīng)，但前提是這個(gè)時(shí)間范圍內(nèi)細(xì)胞數(shù)目不能有明顯變化。另外，我看到細(xì)胞在小室內(nèi)的形態(tài)不是正常培養(yǎng)貼壁的形態(tài)，而是圓形的，仍是懸浮時(shí)的形態(tài)，不過(guò)會(huì)聚集成團(tuán)，所以看到細(xì)胞不正常貼壁也不要緊張，是正常現(xiàn)象在培養(yǎng)過(guò)程中，膜下會(huì)逐漸有少量小氣泡產(chǎn)生，這是正常現(xiàn)象，可不予處

21、理，但我遇到過(guò)培養(yǎng)一段時(shí)間后，膜下出現(xiàn)了大氣泡，幸虧及時(shí)發(fā)現(xiàn)，否則后果將非常嚴(yán)重。因此，個(gè)人建議，最好接種細(xì)胞后12h把培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱里拿出來(lái)看看，確信沒(méi)有大氣泡產(chǎn)生。2.4 結(jié)果統(tǒng)計(jì)檢測(cè)穿過(guò)的細(xì)胞數(shù)有兩種方法：2.4.1 直接計(jì)數(shù)法2.4.1.1 “貼壁”細(xì)胞計(jì)數(shù)這里所謂的“貼壁”是指細(xì)胞穿過(guò)膜后，可以附著在膜的下室側(cè)而不會(huì)掉到下室里面去。如下圖：通過(guò)給細(xì)胞染色，可在鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞 用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞 染色：常用的染色方法有結(jié)晶紫染色、臺(tái)肦藍(lán)染色、Giemsa染色、蘇木精染色、伊紅染色等。個(gè)人推薦采用0.1%結(jié)晶紫染色，這種方法有如下優(yōu)勢(shì)：(1). 不需要固定細(xì)胞，直接染色即可。(

22、2). 配制簡(jiǎn)單方便。(3). 染色后可以用33%醋酸脫色，將結(jié)晶紫完全洗脫下來(lái)，洗脫液可在酶標(biāo)儀上570nm 測(cè)其OD值，間接反映細(xì)胞數(shù)。個(gè)人認(rèn)為這是結(jié)晶紫染色最大的優(yōu)勢(shì)所在。因?yàn)椋m然經(jīng)過(guò)準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)，往往穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)仍難以準(zhǔn)確控制，可能某一批實(shí)驗(yàn)穿過(guò)的細(xì)胞會(huì)特別多，以致細(xì)胞成堆，這種情況下就難以計(jì)數(shù)了，這種情況下就可以用醋酸脫色后用酶標(biāo)儀檢測(cè)。使用結(jié)晶紫染色要注意，染色前要將膜風(fēng)干，否則可能會(huì)染不上。 細(xì)胞計(jì)數(shù)：我們使用的是Leica DC 300F正置顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照，把Transwell小室反過(guò)來(lái)底朝上就可清楚看到小室底膜上下室側(cè)附著的細(xì)胞。也有不少人用手術(shù)刀將膜切下后染色，

23、再貼在玻片上，滴二甲苯，再蓋上蓋玻片，就可以長(zhǎng)期保存，但是這樣做小室就成了一次性的了，未免有點(diǎn)浪費(fèi)。 取若干個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)。論壇里一般采用35個(gè)視野，也有人用10個(gè)，都是隨機(jī)選取，個(gè)人認(rèn)為這樣選擇的視野帶有很大的偶然性，也會(huì)摻進(jìn)人為影響，特別是計(jì)數(shù)視野較少的時(shí)候。我選取16個(gè)視野，不是隨機(jī)選擇，而是有固定的位置。我們使用的顯微鏡所看到的視野的直徑剛好是Chemicon公司的 ECM550系列小室底面膜的直徑的1/4。如圖，藍(lán)色部分表示膜的大小，白色圓形表示視野的大小，綠色方形則表示拍照時(shí)所能拍下的視野的中心部分。這樣，每個(gè)小室都拍攝如下圖的16個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，這樣得到結(jié)果是比較客觀和準(zhǔn)確的

24、。2.4.1.2 “非貼壁”細(xì)胞計(jì)數(shù)由于某些細(xì)胞自身的原因或某些膜的關(guān)系，有時(shí)細(xì)胞在穿過(guò)膜后不能附著在膜上，而是掉進(jìn)下室。如下圖：                                       &

25、#160;                          2.4.2 間接計(jì)數(shù)法間接計(jì)數(shù)法主要用于穿過(guò)細(xì)胞過(guò)多，而無(wú)法通過(guò)計(jì)數(shù)獲得準(zhǔn)確的細(xì)胞數(shù)所采用的方法，與常用的MTT實(shí)驗(yàn)是同樣的原理。2.4.2.1 MTT法 用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞 24孔板中加入500µl含0.5mg/ml MTT的完全培養(yǎng)基，將小室置于其中，使膜浸沒(méi)在培養(yǎng)基中，

26、37 4h后取出。 24孔板中加入500µl DMSO，將小室置于其中，使膜浸沒(méi)在DMSO中，振蕩10min，使甲臜充分溶解。取出小室，24孔板于酶標(biāo)儀上測(cè)OD值。2.4.2.2 熒光試劑檢測(cè)這類方法一般是與Transwell小室一起出售的，其原理與MTT法類似，是用一種熒光染料染細(xì)胞，再將細(xì)胞裂解，檢測(cè)熒光值。Chemicon 的ECM554即屬于這類。2.4.2.3 結(jié)晶紫檢測(cè)上文已說(shuō)過(guò)，這里不再贅述，原理與MTT法也是類似的。但結(jié)晶紫染色還有個(gè)優(yōu)點(diǎn)，就是染色和脫色的過(guò)程并不影響膜上細(xì)胞，在脫色后還可重新染色。這是用正置顯微鏡拍攝的圖，結(jié)晶紫染色，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。第三節(jié) Trans

27、well的其他應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)步驟1Transwell腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)過(guò)程與Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)基本一致，不同的只是不需要鋪Matrigel。個(gè)人認(rèn)為，由于沒(méi)有基質(zhì)膠的阻擋，細(xì)胞穿過(guò)膜的速度較侵襲實(shí)驗(yàn)明顯加快，所以細(xì)胞量要更大。我做侵襲實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞密度是1×105，而遷移實(shí)驗(yàn)的密度是1×106。另外，下層培養(yǎng)液的FBS濃度也可適當(dāng)下調(diào)，我做侵襲實(shí)驗(yàn)的濃度是5%，遷移實(shí)驗(yàn)的濃度是2.5%。2cathywxy戰(zhàn)友的Transwell上皮細(xì)胞培養(yǎng)步驟做了一段時(shí)間的原代細(xì)胞培養(yǎng)，把經(jīng)驗(yàn)?zāi)贸鰜?lái)跟大家分享一下吧，請(qǐng)有關(guān)戰(zhàn)友共同探討：(1) 將雄性wistar大鼠麻醉，開胸，將氣管取出，置

28、于4含0.1胰蛋白酶XIV (Sigma)，100 U/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素（Gibco-BRL）、無(wú)Ca 2、Mg2，無(wú)血清的MEM。(2) 用無(wú)菌的細(xì)胞刮棒刮氣管內(nèi)壁，將所得溶液離心后得到游離細(xì)胞。(3) 離心后立即用新鮮的上述MEM溶液（含10胎牛血清）清洗3次，以中和胰蛋白酶，再用含5胎牛血清、100U/ml 青霉素和100 ug/ml 鏈霉素的LHC-8 medium (Biofluids)沖洗一次。(4) 沖洗過(guò)后，將得到的細(xì)胞懸液用臺(tái)盼蘭測(cè)定活力，若存活率大于90，則將細(xì)胞以106/cm2密度接種于可通透的多聚碳濾膜上（12 mm SNAPWELL, Costar）

29、，以37°C 5CO2-95% 空氣含5% 胎牛血清(Gibco-BRL) and 100 U/ml 青霉素and 100ug/ml 鏈霉素的LHC-8 medium孵育610天。(5) 孵育后，經(jīng)測(cè)定跨上皮電阻在10002000之間，即可用于電生理試驗(yàn)。顯微鏡下氣管上皮細(xì)胞形細(xì)胞呈鋪路石狀，圓形核位于中央，生長(zhǎng)時(shí)常彼此緊密連接成單層細(xì)胞片3. metastasis戰(zhàn)友的Transwell B16細(xì)胞的體外遷移實(shí)驗(yàn)我以前用 costar的Transwell做過(guò)B16細(xì)胞的體外遷移實(shí)驗(yàn)，具體是這么做的：首先把Transwell倒置，在Transwell的PVPF膜（0.8 um）的下表面涂一層fibronectin(10 ug/ml，50ul),