The Promise of Stem Cell Research in Pigs and Other Ungulate Species

1、The Promise of Stem Cell Research in Pigs and Other Ungulate Species摘要：經(jīng)過近二十年的努力仍未成功建立包括牛、豬在內(nèi)的有蹄類動物的胚胎干細胞系，只在嚙齒類和靈長類動物中成功獲得真正意義上的胚胎干細胞（embryonic stem cells ,ESC）。雖然有很多關(guān)于其它物種的類胚胎干細胞的報道，但這些細胞系的獲得都是依賴于小鼠和人的分離方法，細胞系不具備在體外自我更新的能力，并且其全能性也并未得到認證。由于有蹄類動物在胚胎植入前胚胎發(fā)育的特殊性以及缺乏內(nèi)細胞團(inner cell mass ,ICM)和外胚層的特異性標記

2、物，這都為有蹄類動物胚胎干細胞系的建立增加了難度。對于包括生長因子等的培養(yǎng)體系的選擇尤其重要。最近通過在原來的培養(yǎng)條件下添加特殊的蛋白酶抑制劑，成功分離獲得了大鼠和之前非允許的小鼠品系的胚胎干細胞。新改良的培養(yǎng)系統(tǒng)使得細胞依賴于LIF信號通路，穩(wěn)定了維持多能性的生物化學網(wǎng)絡。此外，最近已經(jīng)成功誘導出豬的誘導多能性干細胞（induced pluripotent stem cells ,iPS），將其方法用于其它物種有助于推進該領(lǐng)域的研究進展。豬作為檢測多能性干細胞用于臨床的安全性的生物醫(yī)學的模式動物具有重要的價值，因此豬多能性細胞系的建立是非常必須的。前言：1981年Evans和Kaufman首

3、次從受精3.5d的小鼠胚胎成功分離獲得胚胎干細胞1-2。之后發(fā)現(xiàn)從早期卵裂期胚胎的全能卵裂球同樣可以建立ESC系3-4。約15年后研究人員成功獲得猴5、人6-8的ESCs系。這些細胞系的相繼建立歸功于培養(yǎng)條件的改善，使其更適用于靈長類動物。有研究發(fā)現(xiàn)從綿羊和豬的外胚層分離獲得的細胞可以分化形成包括心肌細胞在內(nèi)的多種不同的細胞類型，但作者并沒有驗證這一發(fā)現(xiàn)的重要性9。有人嘗試從豬囊胚的內(nèi)細胞團分離胚胎干細胞，但并沒驗證獲得的細胞是否具有多能性、是否能長期生長10。繼二十世紀90年代靈長類ESCs系的建立以來，研究人員相繼獲得了具有部分多能性的綿羊11、倉鼠12、狗13、貓14、貂15、兔16、馬

4、17、牛18-19、豬10,20,21ESCs。成功建立大鼠的ESCs22-23。所有其它物種的類ESC細胞不符合干細胞的標準。ESC的兩大特征：一，在特定的條件下能夠無限增殖；二，具有多能性，能夠分化形成包括外胚層、中胚層、內(nèi)胚層三胚層的任意細胞24-25。利用ESC在體外長期培養(yǎng)的特性，ESC可以作為研究驅(qū)動細胞分化及衰老的穩(wěn)定的細胞模型26。ESC的多能性可用于再生醫(yī)學的研究。此外，小鼠ESC能夠在體外無限增殖，通過同源重組技術(shù)對mESC進行基因敲除或敲入，有利于突變細胞的篩選，將突變體與受體囊胚結(jié)合產(chǎn)生嵌合體小鼠，同時將突變基因在種系間進行傳遞，這對于轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域的研究具有革命性的意義2

5、7-28。家養(yǎng)有蹄類動物包括豬、綿羊、山羊、牛、馬ESCs的建立對于農(nóng)牧業(yè)發(fā)展以及生物醫(yī)學的應用具有重要的意義。例如大動物特別是像豬這種單胃的適用于研究人類基因疾病的動物模型，而嚙齒類則不合適29。能夠持續(xù)增殖且保持正常核型，可用于基因敲入或敲除的模型，可以提高對商品化的物種進行基因修飾的效率，提高產(chǎn)量。在體細胞核移植技術(shù)（SCNT）中，利用未分化的細胞要比分化的細胞進行核移植的重編程的效率高，因此ESCs在SCNT的應用中同樣占據(jù)一定的優(yōu)勢30。有蹄類動物ESCs最大的益處可能在于移植方面的研究。為探討hESC的全能性或其替代物誘導多能干細胞（iPSC），在用于移植前，對于這些細胞的安全性和

6、效力以及移植的方法都應測試充分。鑒于小鼠不適合作為受試模型，應尋找其它物種。像豬或牛其自身以及其器官大小在解剖學、生理學以及壽命上比小鼠的更接近人類，因此豬或牛更適于移植生物學的動物模型。本研究涉及到有蹄類動物ESCs研究的意義、存在的問題以及發(fā)展前景。近二十年有大批研究人員致力于牛和豬ESCs的研究。有蹄類動物ESCs研究（進展）現(xiàn)狀Evans等利用豬體內(nèi)7-9天擴展囊胚第一次建立了豬胚胎干細胞系（pESC）20。pESC在STO飼養(yǎng)層上能維持生長一年多并能形成類似于類胚體的細胞簇，但不論是pESCs還是細胞簇內(nèi)分化形成的細胞都不能精確的定義。pESC具有堿性磷酸酶活性但無波形蛋白，而細胞簇

7、內(nèi)形成的胚層也只是停留在形態(tài)特征的層面上31。Piedrahita等人幾乎在同一時間從豬體內(nèi)7-8天囊胚內(nèi)細胞團利用免疫外科法分離獲得pESC21。同樣建立了一些類ESC細胞系或上皮樣的ESCs。這些類ESC細胞最多傳至第10代，上皮樣的ESCs能傳至42代。有趣的是這些上皮樣的ESCs可以在體外形成由極化的上皮細胞組成的囊狀聚集物，這表明此聚集物并不是真正意義上的類胚體，而類ESCs不具備體外分化能力。相繼出現(xiàn)嘗試利用不同時期胚胎分離ESCs，包括4-6細胞期，桑椹胚期32，第5-6天胚胎33以及第9-12天胚胎34-35和將要孵化的擴展囊胚，但都未成功。值得一提的是，豬第6-7天囊胚的IC

8、M能夠形成嵌合體37，說明此時期的ICM具有多能性是獲得ESCs的潛在來源。但事實上，這些細胞在體外培養(yǎng)一段時間后其多能性會丟失。與豬ESCs的研究一樣，大多數(shù)研究人員都是從牛囊胚分離培養(yǎng)ESCs18,38-43。除此之外，X等人利用第12-14天已形成胚盤的胚胎試圖獲得，同樣以失敗告終44。一些嘗試從受精卵或早期卵裂期胚胎分離bESC都失敗19,45，X等從牛胚胎2細胞期獲得的細胞系在體外培養(yǎng)近3年45，X等從牛胚胎16細胞階段分離獲得的細胞系在體外培養(yǎng)9個月之多18-19。所有這些細胞系雖然能夠形成類似類胚體的結(jié)構(gòu)，但不能形成畸胎瘤，說明細胞系的分化潛能具有局限性。盡管沒有得到真正意義上的

9、ESCs，但研究獲得的牛和豬的ESCs在體外能夠維持一定階段的增殖，有的能夠分化形成類似類胚體和畸胎瘤的結(jié)構(gòu)33,46。并且X等人利用pESC制備了嵌合體，雖然不是生殖系嵌合32。一些從豬原生殖細胞分離獲得的ESC具有嵌合能力，但同樣不能通過生殖系傳遞47-50。得出一致的結(jié)論是所有的這些細胞系都不具有多能性，不是真正意義上的ESC51-52。在分離獲得的方法或培養(yǎng)體系上可能有些問題還沒有考慮到34,51-52。農(nóng)場動物多能性細胞系建立存在的困難根據(jù)現(xiàn)有的報道，雖然能夠從豬和牛的胚胎獲得類ESC的克隆，但受到外部和內(nèi)部的多種因素的影響，這些細胞系都不能在體外進行長期培養(yǎng)。最近有很多研究中提到了

10、這些影響因素34,51-52。內(nèi)部因素1. 發(fā)育能力Evans等人成功建立小鼠胚胎干細胞系后嘗試分離豬ESCs以失敗告終10,20。之后也只是在一些特定的近交系小鼠品系如129和C57BL/6小鼠中建立ESCs53。在其他近交系或遠交系小鼠品系中分離ESC要更困難一些54-55。此外，只是在其他兩個物種中成功分離獲得真正意義上的ESCs，即猴子和人，這些細胞系的獲得改變了傳統(tǒng)的培養(yǎng)條件5-6。2. 胚胎著床前發(fā)育生物學的差異小鼠和有蹄類動物的早期胚胎發(fā)育不遵循相同的時間和路徑。小鼠中，第3.5天胚胎期發(fā)生第一次分化事件，形成ICM和TE。第3.5-4.5天胚胎的內(nèi)細胞團底部形成原始內(nèi)胚層或胚外

11、內(nèi)胚層細胞，最終將襯于整個囊胚腔排成一行。小鼠胚胎形成三胚層細胞經(jīng)歷的時間要比其它物種短很多。人56,豬和牛57-59囊胚的形成以及孵化都比小鼠要晚幾天。小鼠胚胎第5.5-6.5天時內(nèi)細胞團迅速增殖并形成上胚層60，將來產(chǎn)生胚胎的三胚層細胞。上胚層維持的時間很短，第6.5天形成原腸胚。對有蹄類動物而言，在胚胎孵化之前，ICM與TE相比較小，第6天時出現(xiàn)上胚層，與小鼠相比上胚層能維持較長時間。在豬約第10天胚胎和牛第12天牛胚胎時，覆蓋于上胚層的極化的滋胚層細胞（Rauber layer）發(fā)生退化，使得上胚層充分暴露于子宮腔內(nèi)，并直接侵入子宮上皮62-63。Rauber層的消失伴隨著胎體開始迅速

12、的長大。例如豬，第10天時，直徑8-10mm的球狀囊泡的擴展囊胚開始延伸為長約1米的絲狀胚胎64-65。這一胚胎延伸和重組的過程涉及到滋養(yǎng)層和胚外內(nèi)胚層且不包括上胚層，并且可能也反映出孕體對胚胎著床前的準備工作，包括增加其表面積，獲得來自子宮母源性分泌物的營養(yǎng)支持。然而，對于小鼠，在受精后4.5天滋胚層開始入侵子宮內(nèi)膜，而有蹄類動物在第12-14天才開始著床，在第17-19天豬胚胎完全著床，而牛胚胎完全著床發(fā)生在第19-20天?？傊瑢τ谂：拓i而言，不像小鼠或人，其胚胎在著床前要經(jīng)歷一段與滋養(yǎng)層相關(guān)的胚胎延伸期并且胚胎的生長也發(fā)生滯后。因此，難以確定合適的胎齡用于豬或牛ESCs的建立。3. 缺

13、乏真正意義上的多能性細胞標記物與小鼠相比，對于有蹄類動物的早期胚胎發(fā)育及伴隨譜系決定發(fā)生的分子事件知之甚少。用于鑒定嚙齒類和靈長類物種的多能性的因子和細胞表面標記抗原對于有蹄類動物并不奏效。例如，OCT4蛋白在有蹄類動物的TE中較小鼠中表達的時間較長66-68。牛TE和上胚層中都有NANOG蛋白的表達39，對于SOX2轉(zhuǎn)錄本是否局限表達于牛和豬的多能性孕體中仍存在懷疑69-71。有研究發(fā)現(xiàn)SOX2和NANOG蛋白至少表達于一個豬滋養(yǎng)層細胞系中72。除了轉(zhuǎn)錄因子外，特定的細胞表面標記抗原在鑒定ESC的多能性上同樣占據(jù)重要的地位。牛中，表面標記物SSEA1，-3和-4，TRA-1-60以及TRA-

14、1-80表達于ICM和TE39。但在豬和山羊中SSEA1和4的表達不是特異性的68。以上數(shù)據(jù)更加說明了嚙齒類和靈長類在著床前生物學上與有蹄類動物相比其差異性存在的重要性。對于特定的物種建立的體系在一些情況下并不適用于所有的物種。毋庸置疑應該尋求一更廣泛的用于區(qū)別有蹄類動物ESCs的標記物，不需要與那些小鼠或人的鑒定標準相一致42.73。外部因素1. 細胞類型發(fā)生污染完整胚胎培養(yǎng)在分離細胞時除了ICM外同樣可能會混入TE以及原始內(nèi)胚層細胞。即使為除掉TE細胞通過免疫外科技術(shù)將胚盤進行剝離，但還會有可能夾雜內(nèi)胚層以及少量的TE細胞。分離得到的ICM或上胚層細胞在體外進行培養(yǎng)時，混入的其它細胞具有與

15、ICM相當?shù)脑鲋乘俣?，甚至比ICM或上胚層細胞的速率還要高以至于占據(jù)主導地位42,74-77。所以建立ESC細胞系時，在缺乏標記細胞多能性的專有標記物的情況下，這種普遍存在的細胞類型污染問題進一步增加了鑒定所得到的細胞群落的多能性的難度。2. 培養(yǎng)條件a） 同源或異源的飼養(yǎng)層細胞：經(jīng)歷屢次失敗后，研究人員將目光轉(zhuǎn)移到飼養(yǎng)層細胞上，大家開始懷疑異源飼養(yǎng)層細胞例如STO和小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）是否適用于有蹄類動物ESC建系的培養(yǎng)51,78-79。小鼠和農(nóng)場動物存在一定的進化距離，由細胞分泌的因子與有蹄類動物的受體的結(jié)合不如與小鼠的效果好，因此不能像mESC一樣支持uESC的自我更新。然而不論

16、是豬胚胎成纖維細胞33,80-81還是豬子宮細胞35,82能夠促進pESC的增殖并不分化。也許其它的細胞作為飼養(yǎng)層其效果會好一些，但目前并沒有相關(guān)方面的研究。但是有研究發(fā)現(xiàn)滅活的MEF能夠充分維持豬誘導多能性干細胞的生長83-85，這說明不論是小鼠細胞分泌的生長因子的類型還是其與豬或其它有蹄類動物受體的親和性對于細胞多能性維持方面都存在著局限性。同樣需要強調(diào)的是，很多嘗試建立uESCs的研究都沒用描述所用的飼養(yǎng)層細胞的密度。對飼養(yǎng)層細胞密度的選擇與選擇飼養(yǎng)層細胞類型同樣是至關(guān)重要的。所以確定最佳的飼養(yǎng)層細胞類型以及其最適密度對于將來uESCs的建立非常關(guān)鍵。最后，同樣需要確定那些能夠促進uES

17、Cs的增殖并能維持其多能性的生長因子以及小分子物質(zhì)。b） 對于生長因子的需求（LIF與FGF2）：在ESC研究中很大的困擾來源于對于生長因子的選擇。近來有研究發(fā)現(xiàn)mESC和hESC對生長因子的需求不同，而且小鼠ICM分離得到的ESC與上胚層分離得到的ESC在生長因子的需求上也不同86-87，這都促使人們不得不考慮該如何選擇適于uESC的生長因子。在飼養(yǎng)層的基礎上，從小鼠ICM分離獲得的ESC依賴于LIF，而來源于囊胚的hESC依賴于FGF2（bFGF）來共同維持細胞的增殖及其多能性。LIF用于不同胎齡的胚胎分離uESC，包括緊縮前囊胚、孵化囊胚、延長的囊胚，但都沒有效果，也許在其它。例如，人L

18、IF對于牛的ESC和著床前胚胎的生長是有害的88-89，但小鼠的LIF其效果較好，這種不同的結(jié)果引起人們的思考，關(guān)于小鼠LIF是否是通過結(jié)合牛中的受體而發(fā)揮作用的89。另一方面，當提高使用濃度時，人的LIF能夠促進第10天豬胚胎的生長，但仍不能阻止pESC的體外分化81。不論LIF因子是否有效，都應該避免在孵化囊胚或延長囊胚時期分離ESC，因為此時胚胎正處于從多能性的ICM像多能性上胚層轉(zhuǎn)化的初期，甚至已經(jīng)完成了分化事件。重要的是，即使在小鼠中，上胚層干細胞干性的維持仍然需要FGF2細胞因子86-87，這表明目前所獲得的大部分甚至所有的干細胞系都屬于上胚層干細胞類型。在這方面，第11天豬胚胎的

19、上胚層中，編碼FGFR1和FGFR2甚至是FGF2本身的基因具有相對較高的表達量，但幾乎沒有檢測到LIF和LIFR的轉(zhuǎn)錄本61。雖然已經(jīng)證實至少有兩條信號轉(zhuǎn)導通路同時發(fā)揮作用以維持不同類型的多能性細胞，但仍沒有完全弄清楚小鼠和人中維持ESC的多能性的基因表達網(wǎng)絡。這些信號通路在有蹄類動物體系中也有可能維持細胞的多能性，如果這些通路能夠適當?shù)谋患せ睿瑢⒂欣趗ESC細胞系的成功分離和獲得。未來發(fā)展方向1. 新技術(shù)及發(fā)展前景成功分離獲得大鼠的胚胎干細胞系是干細胞生物學中的一大進步22。X等人在含LIF培養(yǎng)基的基礎上另外添加了兩種蛋白酶抑制劑，PD0325901(PD)和CHIR99021(CH)。

20、其中PD能夠抑制細胞分裂素活化蛋白激酶(ERK)信號通路，CH能夠激活糖原合成激酶3(GSK3)。得到的ESCs的多能性在體內(nèi)和體外都經(jīng)過了驗證，并且能夠產(chǎn)生生殖系嵌合體。Hanna90等人利用類似的方法獲得了非肥胖型糖尿病鼠系NOD的LIF依賴的ESCs，而在這之前NOD鼠系被認為是不被允許的鼠系。一般有兩種方法成功分離獲得ESCs：異位上調(diào)c-MYC和KLF4的表達；通過在mESC培養(yǎng)基的基礎上添加小分子化合物來激活調(diào)控c-MYC和KLF4表達的信號通路90(圖1)。X等人利用小分子化合物CH抑制GSK3的活性，進而上調(diào)Wnt信號通路，以此來模擬異位表達c-MYC蛋白的作用；另外一種化合物

21、KP，是GSK3和細胞周期蛋白CDK1/B的選擇抑制劑，能夠代替KLF4蛋白的功能92。Hanna90等人通過添加兩種不同的小分子化合物組合，分別是PD/CH和KP/CH(圖1和2)，成功分離獲得依賴LIF/Stat的NOD品系小鼠ESC。NOD-ESC與129小鼠品系的ESC形態(tài)相似，并能夠產(chǎn)生嵌合體。一些其它的小分子化合物能夠促進或穩(wěn)定ESC的多能性或自我更新。讀者可在Feng等的報告中得到更詳細的信息93。這些改良的方法可能會對有蹄類動物或其它物種ESC的建立提供一種新的思路。與允許型的129品系小鼠相比，有蹄類動物和其它物種的ICM中內(nèi)源性c-MYC和KLF4的表達水平要低(圖2)。除

22、非提高這些轉(zhuǎn)錄因子的濃度，否則無法分離獲得大鼠或有蹄類動物的ESC，或不能促進其生長。即使形成了ESC，其表現(xiàn)為上胚層類型，例如人的ESC就是依賴于FGF2/Activin/Nodal而不是LIF信號通路(圖2)。希望能夠通過添加適當?shù)男》肿踊衔锢鏚P/CH來提高內(nèi)源性c-MYC和KLF4的表達量上調(diào)并穩(wěn)定LIF/Stat信號通路進而維持ESC的生長(圖2)。小鼠中KLF4是LIF/Stat信號通路下游的信號肽中間產(chǎn)物,這進一步支持了這一說法94。我們推測利用這些方法或?qū)⑵溥M行改良，在不久的將來能夠成功建立有蹄類動物的ESCs。2.干細胞的替代物-誘導多功能干細胞(iPSC)雖然通過改良培

23、養(yǎng)條件仍不能成功獲得uESC，iPSC提供了一種非常有用的替代ESC的方法。Takahashi和Yamanaka95通過逆轉(zhuǎn)錄病毒將四個轉(zhuǎn)錄因子OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC共同轉(zhuǎn)入體細胞，在四個因子的共同作用下誘導體細胞進行重編程，成功獲得小鼠誘導多能性干細胞(miPSC)，在此之后此領(lǐng)域的進展非常迅速。人們在此基礎上不斷的改良創(chuàng)新，嘗試利用不同的轉(zhuǎn)錄因子的組合，提高重編程的效率，使其在移植生物學領(lǐng)域中的應用更高效更安全。已經(jīng)應用于成體細胞、胎兒體細胞以及已分化的非成纖維細胞中95-106。近年來，已經(jīng)在猴子107、大鼠108和豬83-85中成功分離獲得iPSC。最近有報道稱，mi

24、PSC能夠形成ICM并能產(chǎn)生后代，證實iPSC接近于ESC的多能性性質(zhì)109-110。誘導多功能干細胞與胚胎干細胞一樣，在生物醫(yī)學和農(nóng)業(yè)研究中具有很大的應用前景。iPSC能夠提高基因組基因敲入和基因敲除的效率，具有生殖系嵌合能力，而且可高效的用于SCNT30。此外，iPSC在人類移植應用中可能比ESC更具優(yōu)勢，特別是iPSC能夠產(chǎn)生病人特異的干細胞。對于一些體細胞，例如皮膚角質(zhì)化細胞，可以通過皮膚活檢進行快速培養(yǎng)，約幾個星期內(nèi)誘導成iPSC。iPSC可以向特異的組織譜系方向誘導，例如從供體中分離獲得祖細胞，將其誘導生成心肌細胞或特殊的神經(jīng)元前體細胞，并將其移回供體中最大限度的降低免疫排斥的風險

25、。然而，利用ESC或iPSC進行移植治療，到目前為止還不能做到零風險，必須要保證的是移植的細胞在體內(nèi)不會形成包括畸胎瘤在內(nèi)的腫瘤，并且保證不會引起強烈的免疫反應。同時必須要求高效并特異的植入方式，保證植入的細胞能夠正常發(fā)揮作用。在干細胞技術(shù)應用于臨床之前需對其進行全面的動物實驗以保證其安全性。由于小鼠的體型大小以及在解剖學、免疫學、生理學以及壽命上的特征與人類相差較大，因此不能作為常規(guī)細胞安全性檢測的動物模型。鑒于成本的考慮也不大可能用非人類的靈長類動物作為檢測模型，因此豬是最好的模式動物的選擇。幾乎同時發(fā)布的三份報告都報道了成功分離獲得豬的誘導多能性干細胞83-85，這有可能成為豬作為模式動物用于移植生物學研究領(lǐng)域的重要的里程碑30。三個實驗室都是利用同樣的方法，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將OSKM四個因子同時轉(zhuǎn)入豬成纖維細胞從而驅(qū)動細胞的重編程誘導產(chǎn)生多功能干細胞。這些piPSC在表型上并不相同，至少其表面標記物是不同的(表1),與小鼠ESC相比更接近于人的ESC，并且依賴于FGF2細胞因子和滅活的MEF飼養(yǎng)層來維持細胞的干細胞特性。由飼養(yǎng)層MEF分泌的細胞因子包括激動蛋白和nodal蛋白，與FGF2因子共同作用維持人ESC和iPSC的多能性并阻止其分化。本實驗室目前正在驗證是否能通過LIF因子并選擇性添加蛋白酶抑制劑來分離獲