?；撬嵋种迫毖跽T導大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖和信號轉(zhuǎn)導機制

1、?；撬嵋种迫毖跽T導大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖和信號轉(zhuǎn)導機制收稿日期2013-10-16基金項目國家自然科學基金項目(81270113, 91339107)；研究生創(chuàng)新基金項目(yjscx2012-zz8hsd)；哈 爾濱科技創(chuàng)新人才項目(2013rfxxj092)；大慶重點項目 (scxz01011)通信作者*孫鵬，e-mail： sunpenghashangda126. com作者簡介張曉丹，教授，e-mai 1: zhangxd85163. com摘要目的：探討?；撬?taurine, tau)對缺氧誘 導的大鼠肺動脈平滑肌細胞(pasmcs)增殖的影響，并且研 究細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2

2、(erk1/2)通路是否參與了 tau 抑制pasmcs增殖的過程及可能的分子機制。方法：原代培 養(yǎng)大鼠pasmcs,選用第25代用于實驗。tau給藥濃度為80 mmol l-1, erk1/2 阻斷劑(pd98059)濃度為 50 nmol l-1,給藥時間24 ho體外嗟11 坐藍比色法(mtt)、細胞免 疫熒光和蛋白免疫印記法檢測?；撬嵩诓煌瑮l件下對大鼠 pasmcs增殖能力的影響，將細胞分為4組：常氧組、常氧+tau 組、缺氧組、缺氧+tau組。蛋白免疫印記法檢測erk1/2 通路是否參與了 tau抑制缺氧誘導pasmcs增殖的進程中。 實驗分為5組：常氧組、缺氧組、缺氧+tau組、缺

3、氧 +tau+pd98059組、缺氧+pd98059組。結(jié)果：缺氧可誘導 pasmcs增殖，常氧情況下tau對pasmcs細胞增殖無影響， 常氧及缺氧條件下tau對pasmcs中腫瘤壞死因子-a(tnf-a )的表達無影響。tau可以逆轉(zhuǎn)缺氧誘導的細胞增 殖核抗原(pcna) (p 1.4免疫熒光測pcna 6孔板中 放入蓋玻片，細胞消化后均勻鋪于6孔板的蓋玻片上，細胞 生長密度適宜后給藥，細胞給藥時間結(jié)束后，pbs沖洗細胞, 4%多聚甲醛固定15 min后棄掉，再用pbs沖洗3次，每次5 mine加入0. 5% triton透化穿孔10 min, pbs洗3次，每 次5 mino加入3%bs

4、a, 37 °c下封閉30 min。pbs洗后6孔 板中每孔加入pcna抗4 £孵育過夜。第2天回收一抗， pbs洗5 min, 一共3次，6孔板中每孔加入100 nl cy3熒 光二抗，避光37 °c下孵育2 ho時間結(jié)束后pbs洗3次， 每次5 mine每孔加入100 u l dapi孵育15 min。pbs洗3 次，每次5 min。抗淬滅劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察。1. 5免疫蛋白印跡分析各組加藥培養(yǎng)24 h后收集細 胞，預冷的磷酸鹽緩沖溶液反復沖洗細胞3遍，加入細胞裂 解液，冰上裂解15 min后刮取細胞，低溫離心機4 °c下13 500 r

5、min-1離心15 min,取上清，釆用bca法測定蛋白 濃度。蛋白溶液按4 : 1比例加入5 x loading buffer, 95 °c 煮5 min, 8% sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)印到 nc膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用5%脫脂奶粉封閉lh,加入1： 400 稀釋的一抗4 °c孵育過夜。次日回收一抗，tbst洗膜液洗 膜4次，每次10 min,辣根過氧化酶標記的兔二抗、鼠二抗 孵育lh, tbst振蕩洗膜4次，每次10 mine ecl顯色5 min 后顯影。曝光后x光片在quantity one軟件中進行分析。1.6統(tǒng)計學分析 應(yīng)用spss 6.0軟件進行

6、統(tǒng)計學分析， t檢驗和方差分析，p 圖6 tau對p-erkl/2表達的影 響（土 s，n=6）fig.6 effect of taurine on p-erkl/2 expression ofpasmcs （±s, n=6）tau相比，pd98059+tau組pcna表達下降最顯著（p 參考文獻1 ghofrani h a, voswinckel r, reichenberger f, et al. hypoxia and non-hypoxia-related pulmonary hypertention established and new therapiesj cardio

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8、se in expression and secretion of extracellular superoxide dismutase induced by homocysteinej circulation, 2001, 104： 1165.4 hu s j, huang y w. effect of taurine on proliferation of rat vascular smooth muscle cellsj. chin j pharmacol toxicol, 1997, 11 (1)： 35.5 liao x b, zhou x x, li j m, et al. tau

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