甲基化的檢測(cè)方法與臨床應(yīng)用

1、甲基化的檢測(cè)方法與臨床應(yīng)用麻守君 張茂林 楊志甫(內(nèi)蒙古包頭醫(yī)學(xué)院·包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī) 院內(nèi)蒙古包頭014010)【中圖分類號(hào)】r446文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】a【文章編號(hào)】1672-5085 (2012) 4-0433-02 【摘要】dna甲基化是表觀遺傳修飾最基本的方式，在維持正常細(xì)胞功能、胚胎 發(fā)育和腫瘤發(fā)牛、動(dòng)脈粥樣硬化中起著重要的作用,是當(dāng)前學(xué)術(shù)研究的重點(diǎn)和熱 點(diǎn)。隨著研究的深入，各種各樣的甲基化檢測(cè)方法被開(kāi)發(fā)出來(lái)同時(shí)在臨床應(yīng)用也 初見(jiàn)端倪，甲基化的深入研究必將對(duì)人類健康產(chǎn)牛深遠(yuǎn)的影響。【關(guān)鍵詞】表觀遺傳dna甲基化pcr檢測(cè)重亞硫酸鹽單親遺傳病腫 瘤動(dòng)脈粥樣硬化老化dn

2、a甲基化是一種重要的遺傳外修飾,是表觀遺傳學(xué)(epigenetics)的重要 組成部分1。甲基化是指由dna甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo),在胞嚅唳的第5位碳原子上加 上一甲基基團(tuán)，使之變成5甲基胞嚅唳(5mc啲化學(xué)修飾過(guò)程。它參與了動(dòng)物胚胎 發(fā)育、基因卬跡、x染色體失活等過(guò)程，在基因表達(dá)的調(diào)控中具有重要作用?；?組正常甲基化模式改變與某些遺傳病和腫瘤以及動(dòng)脈粥樣硬化性有著密切 相關(guān)性。木文就目前常用的甲基化檢測(cè)方法和臨床應(yīng)用予以綜述。1基因甲基化的檢測(cè)方法1.1高效液相色譜柱ku。等首次報(bào)道高效液相色譜柱(hplc),它能夠定量測(cè)定基因組整體甲 基化水平，其過(guò)程是：用酸或酶將dna裂解為五類單核昔酸(包括

3、5-mc)o因五類 核昔酸在極性溶液中的溶解度不同，在經(jīng)過(guò)非極性的過(guò)濾柱時(shí)，出柱時(shí)間也不同， 用波長(zhǎng)260 nm的紫外光測(cè)定流出液的吸收峰并定量。此法靈敏度高，是目前測(cè) 定基因組dna中5-mc總量最標(biāo)準(zhǔn)的方法，但不能了解甲基化的位置和狀態(tài)信息 且對(duì)dna純度要求較高。1.2特異性位點(diǎn)的dna甲基化的檢測(cè)1.2.1甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶pcr/southern法甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶(methylation-sensitiverestri ctionendonuclease ms-re)-pcr/southern方法利用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶對(duì) 甲基化區(qū)的不切割的特性，將dna消化為不同

4、大小的片段后再進(jìn)行分析。常用的 酶有hpa il-msp i (識(shí)別序列ccgg)其中hpa ii和msp i均能識(shí)別ccgg序列撚而 當(dāng)序列中的胞卩密噪發(fā)生甲基化吋,hpa ii不切割，利用hpaiimsp i的這種屬性處 理dna,隨后進(jìn)行southern或pcr擴(kuò)增分離產(chǎn)物，明確甲基化狀態(tài)。其優(yōu)點(diǎn)是可 同時(shí)檢測(cè)基因組內(nèi)多個(gè)cpg位點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果易解釋，成本低廉。缺點(diǎn)是:由于cg 不僅僅限于ccgg序列中，因此非該序列中的cg將被忽略;只有檢測(cè)與轉(zhuǎn)錄相關(guān) 的關(guān)鍵性位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)時(shí)，該檢測(cè)方法的結(jié)果才有意義;需要樣本量大; 存在酶消化不完全引起的假陽(yáng)性的問(wèn)題;不適用于混合樣本。1.2.2直接

5、測(cè)序法直接測(cè)序是由frommer等提出的研究dna甲基化的方法。過(guò)程是:重亞 硫酸鹽使dna中未發(fā)生甲基化的胞嚅喘脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嚅喘，而甲基化的胞嚅喘 保持不變，用不含任何cpg位點(diǎn)的引物行pcr擴(kuò)增。擴(kuò)增后尿喀噪全部轉(zhuǎn)化成胸 腺喀呢，對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序并且與未經(jīng)處理的序列比較，根據(jù)缺失條帶判斷cpg 位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化。此方法是一種可靠性及精確度高的方法，能明確目的片段 中每一個(gè)cpg位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，但需要人量的克隆測(cè)序,操作過(guò)程繁瑣口費(fèi)用昂 貴。1.2.3甲基化特異性的pcrherman等在重亞硫酸鹽處理的基礎(chǔ)上提出了甲基化特異性的 pcr(methylation-specific p

6、cms-pcr),它將dna先用重亞硫酸鹽處理，隨后行引物 特異性的pcro用針對(duì)甲基化dna鏈的引物能擴(kuò)增出片段則為甲基化;用針對(duì)非 甲基化dna鏈的引物能擴(kuò)增出片段則為非甲基化,由此明確待測(cè)序列中cpg位點(diǎn) 是否存在甲基化。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是:避免了使用限制性內(nèi)切酶及相關(guān)問(wèn)題; 敏感性高;可用于石蠟包埋樣本6。缺點(diǎn)是:引物設(shè)計(jì)要求高，可靠的mspcr引 物需設(shè)計(jì)包含2個(gè)或多個(gè)完全甲基化或非甲基化cpg位點(diǎn)腫此限制了 mspcr 的使用;這種方法只能作定性研究，不能作定量檢測(cè);存在重亞硫酸鹽處理不 完全導(dǎo)致的假陽(yáng)性。1.2.4methylighteads等報(bào)道m(xù)ethylight是一種基于ta

7、qman探針的甲基化特異性定量 pcr技術(shù)。與ms-pcr不同的是加入了 taqman探針,探針的5*端連接報(bào)告熒光 3′端連接淬滅熒光。如果探針能夠與dna雜交，則在pcr用引物延伸至探 針時(shí),taqdna聚合酶5′到3′端的外切酶活性會(huì)將探針序列5′ 端的報(bào)告熒光切下,3′端淬滅熒光不再抑制寧端報(bào)告熒光，報(bào)告熒光發(fā)光，測(cè) 定報(bào)告熒光的強(qiáng)度即可得到該位點(diǎn)的甲基化情況及水平;高敏感、快速是本方法 最顯著的特點(diǎn)，此外該法具備可重復(fù)、所需樣本量少、不需要電泳分離的特點(diǎn)，可 以為臨床樣本的研究提供可靠

8、的技術(shù)支持。缺點(diǎn)是費(fèi)用高，測(cè)定每個(gè)位點(diǎn)都要用 一對(duì)引物和探針，受較多因素影響。1.2.5 dna微陣列法yan等將以分子雜交為基礎(chǔ)的微陣列技術(shù)應(yīng)用于dna甲基化檢測(cè)中, 具體方法是：首先對(duì)待研究片段用重亞硫酸鹽處理，再行pcr擴(kuò)增，其產(chǎn)物的 3′端用熒光素標(biāo)記然后與5′端固定于玻璃板上的gc的探針或ac 的探針雜交、掃描。探針的熒光信號(hào)強(qiáng)度與m/m+u值（m表示甲基化,u表示非 甲基化）存在線性關(guān)系9。該法可用于多樣本、多位點(diǎn)甲基化的檢測(cè)，樣本需要量 少,適于臨床樣本，但不能得到每個(gè)cpg位點(diǎn)的信息，且探針可能存在交叉雜交，致 結(jié)果假陽(yáng)性，影響分析。1.

9、2.6 ms-mlpams-mlpa（methylatiorvspecificmultiplex ligatiorvdependenprobe amplification）是nygren等10在mlpa11基礎(chǔ)上改進(jìn)后提出的用于檢測(cè)特異位點(diǎn) 甲基化的方法。具體過(guò)程:應(yīng)用msmlpa探針（探針的靶基因識(shí)別序列中一定要包含一個(gè)甲基化 敏感的酶限制位點(diǎn)）和標(biāo)本dna進(jìn)行雜交使之結(jié)合形成dna探針復(fù)合物，并用連 接酶將探針連接，然后，加入甲基化敏感限制性內(nèi)切酶（如hha i ）,若含有的 位點(diǎn)存在甲基化，則hha i不切割，探針順利連接,隨后的pcr照常進(jìn)行反之則不能, 最后根據(jù)擴(kuò)增片段明確定靶基因的

10、甲基化情況。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是:需要樣本 的數(shù)量少，由于探針具有非常短的識(shí)別序列，因此mpla可以用于局部降解的dna, 如石蠟包埋的dna樣本;可用于分析大量混合樣本，可一次檢測(cè)多個(gè)靶基因中 cpg位點(diǎn)的甲基化情況。缺點(diǎn)是探針連接位點(diǎn)受限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)識(shí)別的限制， 口要考慮到所用酶的反應(yīng)適宜溫度。2 dna甲基化與臨床應(yīng)用2.1單親遺傳病 單親遺傳病是指由非孟德?tīng)栠z傳方式引起的人類的遺 傳病。該病的發(fā)生與雙親遺傳的等位基因發(fā)生差異甲基化區(qū)域有關(guān)，正常情況下 是不發(fā)病的，但是等位基因中非甲基化一方這段本來(lái)應(yīng)有活性的基因片段出現(xiàn)異 常或未能完整地遺傳給子代，則會(huì)引起一系列人類疾病。主要有:貝克威思

11、威德曼 綜合征(beckwith-wiedemann syndrome,bws),普拉德威利綜合征 (prader-willisyndrome, pws),安格曼綜合征(angelman syndrome,as)和特納綜合征 (turner/ts)等。2.2腫瘤 腫瘤的早期診斷，治療以及預(yù)后評(píng)價(jià)一直是醫(yī)學(xué)的關(guān)注焦點(diǎn)。 腫瘤細(xì)胞dna總體甲基化水平低于正常細(xì)胞，但某些特定基因(如腫瘤抑制基 因)cpg島卻處于高甲基化狀態(tài)12。由于細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中的甲基化現(xiàn)象早于明顯 的惡性表型岀現(xiàn)，甲基化研究可以為腫瘤的早期診斷提供生物學(xué)標(biāo)記，同吋dna 甲基化是一種不改變dna 一級(jí)結(jié)構(gòu)可逆的表觀遺傳修飾，糾正

12、異常的甲基化狀態(tài) 成為治療腫瘤的一種新策略。甲基化改變與傳統(tǒng)的預(yù)后指標(biāo)之間也存在密切聯(lián)系 13 o2.3動(dòng)脈粥樣駛化智艷芳等14首次報(bào)道動(dòng)脈粥樣硬化(as)病人低密 度脂蛋白受體(ldlr)基因啟動(dòng)子區(qū)出現(xiàn)顯著增高的甲基化修飾度。as患者雌 激素受體-α (er-α)基因啟動(dòng)子區(qū)cpg島出現(xiàn)高度甲基化，口甲基 化程度與血同型半胱氨酸(thcy)濃度呈正相關(guān)。高h(yuǎn)ey血癥很可能通過(guò)干擾 er-α基因的甲基化而促進(jìn)as的發(fā)生、發(fā)展。這為心腦血管病的發(fā)病機(jī)理提 供了進(jìn)一步的理論支持。2.4老化隨著年齡的老化，基因組總體dna甲基化水平逐漸降

13、低。這一 甲基化水平的變化，是否僅與老化有關(guān)，還是也參與老化過(guò)程中的腫瘤高發(fā)，尚有 待進(jìn)一步研究。3結(jié)語(yǔ)dna甲基化的研究有許多方法，在選擇時(shí)首先需要考慮的是待測(cè)對(duì)象是 特定基因還是基因組。由于各種方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，準(zhǔn)確的基礎(chǔ)研究和臨床篩查 對(duì)所需方法的要求亦不一樣。本文所介紹的方法，希望對(duì)于dna甲基化的研究有 所幫助。同吋疾病的去甲基化實(shí)驗(yàn)性治療已經(jīng)在有條不紊地進(jìn)行，相信在不久的 將來(lái)在人們完全認(rèn)識(shí)其安全性的基礎(chǔ)上，基因甲基化對(duì)疾病的預(yù)測(cè)、檢測(cè)、治療 和預(yù)后判斷開(kāi)辟另一條廣闊的天地。參考文獻(xiàn)1 wu c tmorris j r.genes,genetics andepigenetics:a

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