PrimerPremier5

1、primer premier 5.0 primer premier是大名頂頂?shù)囊镌O(shè)計(jì)軟件，用來(lái)幫助研究人員設(shè)計(jì)最適合引物的應(yīng)用軟件利用它的高級(jí)引物搜索引物數(shù)據(jù)庫(kù)巢式引物設(shè)計(jì)引物編輯和分析等功能可以設(shè)計(jì)出有高效擴(kuò)增能力的理想引物也可以設(shè)計(jì)出用于擴(kuò)增長(zhǎng)達(dá)50kb以上的 pcr 產(chǎn)物的引物序列，由加拿大的 premier公司開發(fā)的專業(yè)用于pcr 或測(cè)序引物以及雜交探針的設(shè)計(jì)，評(píng)估的軟件，和plasmid premier2.02一起是該公司推出的最新的軟件產(chǎn)品。 其主要界面同樣也是分為序列編輯窗口（ genetank） ，引物設(shè)計(jì)窗口（ primer design） ，酶切分析窗口（ restric

2、tion sites）和紋基分析窗口（motif） 。下載地址： primer premier 5.0下載oligo 6.71 引物分析著名軟件， 主要應(yīng)用于核酸序列引物分析設(shè)計(jì)軟件，同時(shí)計(jì)算核酸序列的雜交溫度（tm ）和理論預(yù)測(cè)序列二級(jí)結(jié)構(gòu)下載地址： oligo 6.71下載用軟件設(shè)計(jì)引物（ primer premier & oligo）-附下載（轉(zhuǎn)自你愛香芋我愛豆角的博客）使用不合適的pcr 引物容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失?。?表現(xiàn)為擴(kuò)增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等?，F(xiàn)在 pcr 引物設(shè)計(jì)大都通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行，軟件的立足點(diǎn)也是按照引物設(shè)計(jì)的基本原則。只是

3、更加快速和自動(dòng)化而已。 我們可以直接提交模板序列到特定網(wǎng)頁(yè)，如著名的primer3（ /） ，得到設(shè)計(jì)好的引物。也可以在本地計(jì)算機(jī)上運(yùn)行引物設(shè)計(jì)專業(yè)軟件。一般來(lái)說(shuō)， 專門入行 pcr 引物設(shè)計(jì)的專業(yè)軟件功能更為強(qiáng)大，但使用起來(lái)卻不太容易。軟件的引物設(shè)計(jì)功能主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：首先是引物分析評(píng)價(jià)功能，該功能只有少數(shù)商業(yè)版軟件能夠做到，其中以oligo 6 最優(yōu)秀；其次是引物的自動(dòng)搜索功能。各種軟件在這方面的側(cè)重點(diǎn)不同。因此自動(dòng)搜索的結(jié)果也不盡相同。據(jù)筆者的經(jīng)驗(yàn)， 自動(dòng)搜索功能以premier primer為最強(qiáng)且方便使用， oligo 6 其次，其他

4、軟 件 如 vector nti suit、 dnasis、 omiga和dnastar都帶有引物自動(dòng)搜索功能。但搜索結(jié)果不是十分理想。 要想得到效果很好的引物，在自動(dòng)搜索的基礎(chǔ)上還要輔以人工分析。 筆者認(rèn)為引物設(shè)計(jì)軟件的最佳搭配是oligo和premier軟件合并使用。以premier進(jìn)行自動(dòng)搜索， oligo進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，如此可快速設(shè)計(jì)出成功率很高的引物。primer premier 5.0 的使用技巧簡(jiǎn)介1. 功能premier的主要功能分四大塊，其中有三種功能比較常用，即引物設(shè)計(jì)、限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分析和dna 基元 (motif)查找。premier還具有同源性分析功能，但并非其特長(zhǎng)，

5、在此略過(guò)。此外，該軟件還有一些特殊功能，其中最重要的是設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，另外還有序列 朗讀 、dna 與蛋白序列的互換、語(yǔ)音提示鍵盤輸入等等。有時(shí)需要根據(jù)一段氨基酸序列反推到dna 來(lái)設(shè)計(jì)引物，由于大多數(shù)氨基酸（ 20 種常見結(jié)構(gòu)氨基酸中的18 種）的遺傳密碼不只一種，因此。由氨基酸序列反推dna 序列時(shí)，會(huì)遇到部分堿基的不確定性。這樣設(shè)計(jì)并合成的引物實(shí)際上是多個(gè)序列的混和物，它們的序列組成大部分相同。但在某些位點(diǎn)有所變化。稱之為簡(jiǎn)并引物。 遺傳密碼規(guī)則因物種或細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的不同而異，比如在線粒體內(nèi)的遺傳密碼與細(xì)胞核是不一樣的。premier可以針對(duì)模板dna 的來(lái)源以相應(yīng)的遺傳密碼規(guī)則轉(zhuǎn)換dna

6、和氨基酸序列。軟件共給出八種生物亞結(jié)構(gòu)的不同遺傳密碼規(guī)則供用戶選擇，有纖毛蟲大核（ ciliate macronuclear） 、無(wú)脊椎動(dòng)物線粒體（invertebrate mitochondrion） 、 支原體（mycoplasma） 、植 物 線 粒 體 （ plant mitochondrion）、 原 生 動(dòng) 物 線 粒 體（protozoan mitochondrion） 、一般標(biāo)準(zhǔn)（ standard） 、脊椎動(dòng)物線粒體（vertebrate mitochondrion）和酵母線粒體（yeast mitochondrion） 。2. 使用步驟及技巧其主要功能在主界面上一目了然。

7、限制性酶切點(diǎn)分析及基元查找功能比較簡(jiǎn)單， 點(diǎn)擊該功能按鈕后， 選擇相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶或基元（如-10 序列， -35 序列等），按確定即可。常見的限制性內(nèi)切酶和基元一般都可以找到。你還可以編輯或者添加新限制性內(nèi)切酶或基元。入行引物設(shè)計(jì)時(shí)，打開dna序列后點(diǎn)擊按鈕primer，出現(xiàn)search criteria窗口，有多種參數(shù)可以調(diào)整。 搜索目的（seach for ） 有三種選項(xiàng)，pcr 引物（ pcr primers） ，測(cè)序引物（ sequencing primers）， 雜 交 探 針 （ hybridization probes） 。搜索類型 (search type)可選擇分別或同時(shí)

8、查找上、下游引物（ sense/anti-sense primer，或 both ） ，或者成對(duì)查找（ pairs ） ，或者分別以適合上、下游引物為主（compatible with sense/anti-sense primer） 。另外還可改變選擇區(qū)域（search ranges） ，引物長(zhǎng)度（ primer length） 。選 擇 方 式 （ search mode）， 參 數(shù) 選 擇 （ search parameters）等等。使用者可根據(jù)自己的需要設(shè)定各項(xiàng)參數(shù)。如果沒有特殊要求， 建議使用默認(rèn)設(shè)置。 然后按 search，隨之出現(xiàn)的search progress 窗口中顯示 s

9、earch completed 時(shí)，再按ok ，這時(shí)搜索結(jié)果以表格的形式出現(xiàn)，有三種顯示方式，上游引物（sense ） 。下游引物 (anti-sense)，成對(duì)顯示 (pairs)。默認(rèn)顯示為成對(duì)方式。并按優(yōu)劣次序（ rating）排列，滿分為100 。即各指標(biāo)基本都能達(dá)標(biāo)。點(diǎn)擊其中一對(duì)引物，如第1# 引物，并把上述窗口挪開或退出，顯示peimer premier主窗口，所得結(jié)果分三部分，最上面是圖示pcr 模板及產(chǎn)物位置。中間是所選的上下游引物的一些性質(zhì)，最下面是四種重要指標(biāo)的分析，包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin） ，二聚體（ dimer） ，錯(cuò)誤引發(fā)情況（ false priming） ，

10、及上下游引物之間二聚體形成情況（cross dimer） 。當(dāng)所分析的引物有這四種結(jié)構(gòu)的形成可能時(shí)，按鈕由變成，點(diǎn)擊該按鈕。在左下角的窗口中就會(huì)出現(xiàn)該結(jié)構(gòu)的形成情況。一對(duì)理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)， 因此最好的情況是最下面的分析欄沒有。只有。值得注意的是中間一欄的末尾給出該引物的最佳退火溫度，可參考應(yīng)用。在需要對(duì)引物進(jìn)行修飾編輯時(shí)，如在5 端加入酶切位點(diǎn)，可點(diǎn)擊。然后修改引物序列。若要回到搜索結(jié)果中，則點(diǎn)擊按鈕。如果要設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。只需根據(jù)源氨基酸序列的物種來(lái)源選擇前述的八種遺傳密碼規(guī)則，反推至dna 序列即可。對(duì)簡(jiǎn)并引物的分析不需像一般引物那樣嚴(yán)格?？傊?。 premier有優(yōu)秀的引

11、物自動(dòng)搜索功能，同時(shí)可進(jìn)行部分指標(biāo)的分析，而且容易使用，是一個(gè)相當(dāng)不錯(cuò)的軟件。3.下載鏈接：http:/cid- .aspx/software/oligo6.65.rar oligo 6.22 使用技巧簡(jiǎn)介1. 功能在專門的引物設(shè)計(jì)軟件中。 oligo是最著名的。 它的使用并不十分復(fù)雜， 但初學(xué)者容易被其復(fù)雜的圖表嚇倒。 oligo 5.0 的初始界面是兩個(gè)圖：tm 圖和 g 圖； oligo 6.22 的界面更復(fù)雜，出現(xiàn)三個(gè)圖，加了個(gè) frq 圖。oligo的功能比 premier還要單一，就是引物設(shè)計(jì)。但它的引物分析功能如此強(qiáng)大以至于能風(fēng)靡全世界。2. 使用（以 oligo 6.22 為例

12、）oligo 6.22 的啟動(dòng)界面顯示的三個(gè)指標(biāo)分別為tm 、 g 和 frq ，其中 frq 是 6.22 版本的新功能，為鄰近6 至 7 個(gè)堿基組成的亞單位在一個(gè)指定數(shù)據(jù)庫(kù)文件中的出現(xiàn)頻率。該頻率高則可增加錯(cuò)誤引發(fā)的可能性。因?yàn)榉治鲆婕岸鄠€(gè)指標(biāo)，起動(dòng)窗口的cascade 排列方式不太方便，可從windows菜單改為 tili 方式。如果覺得太擁擠，可去掉一個(gè)指標(biāo)，如frq 。這樣界面的結(jié)構(gòu)同于oligo5.0，只是顯示更清楚了。在設(shè)計(jì)時(shí)， 可依據(jù)圖上三種指標(biāo)的信息選取序列，如果覺得合適， 可點(diǎn)擊 tm 圖塊上左下角的upper 按鈕。選好上游引物。此時(shí)該按鈕變成， 表示上游引物已選取好。

13、 下游引物的選取步驟基本同上， 只是按鈕變成 lower。g 值反映了序列與模板的結(jié)合強(qiáng)度，最好引物的 g 值在 5 端和中間值比較高， 而在 3 端相對(duì)低。tm 值曲線以選取72 附近為佳， 5 到 3 的下降形狀也有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。 frq 曲線為 oligo 6新引進(jìn)的一個(gè)指標(biāo)，揭示了序列片段存在的重復(fù)機(jī)率大小。選取引物時(shí)， 宜選用 3 端 frq 值相對(duì)較低的片段。當(dāng)上下游引物全選好以后， 需要對(duì)引物入行評(píng)價(jià)并根據(jù)評(píng)價(jià)對(duì)引物進(jìn)行修改。首先檢查引物二聚體尤其是3 端二聚體形成的可能性。需要注意的是， 引物二聚體有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之間形成（cros

14、s dimer） 。二聚體形成的能值越高，越不符合要求。一般的檢測(cè)（非克?。┬詐cr。對(duì)引物位置、 產(chǎn)物大小要求較低， 因而應(yīng)盡可能選取不形成二聚體或其能值較低的引物。第二項(xiàng)檢查是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin） ；與二聚體相同。發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好。 一般來(lái)說(shuō)，這兩項(xiàng)結(jié)構(gòu)的能值以不超過(guò) 4.5 為好。當(dāng)然，在設(shè)計(jì)克隆目的的pcr 引物時(shí)，引物兩端一般都添加酶切位點(diǎn)。必然存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)， 而且能值不會(huì)太低。 這種 pcr 需要通過(guò)靈活調(diào)控退火溫度以達(dá)到最好效果，對(duì)引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的檢測(cè)就不應(yīng)要求太高。第三項(xiàng)檢查為gc 含量，以 45-55為宜。有一些模板本身的 gc 含量偏低或偏高，導(dǎo)致引物的gc 含

15、量不能被控制在上述范圍內(nèi)。這時(shí)應(yīng)盡量使上下游引物的gc 含量以及tm 值保持接近，以有利于退火溫度的選擇。如果pcr 的模板不是基因組dna 。而是一個(gè)特定模板序列。那么最好還進(jìn)行false priming site 的檢測(cè)。這項(xiàng)檢查可以看出引物在非目的位點(diǎn)引發(fā)pcr 反應(yīng)的可能性。如果引物在錯(cuò)配位點(diǎn)的引發(fā)效率比較高，就可能出假陽(yáng)性的pcr 結(jié)果。一般在錯(cuò)配引發(fā)效率以不超過(guò)100 為好，但對(duì)于特定的模板序列， 還應(yīng)結(jié)合比較其在正確位點(diǎn)的引發(fā)效率。如果兩者相差很大， 比如在正確位點(diǎn)的引發(fā)效率為450 以上，而在錯(cuò)誤位點(diǎn)的引發(fā)效率為130 ，那么這對(duì)引物也是可以接受的。當(dāng)我們結(jié)束以上四項(xiàng)檢測(cè)，按alt p 鍵彈出 pcr 窗口。其中總結(jié)性地顯示該引物的位置、產(chǎn)物大小、tm 值等參數(shù)，最有用的是還給出了推薦的最佳退火溫度和簡(jiǎn)單的評(píng)價(jià)。由于 oligo軟件的引物自動(dòng)搜索功能與primer premier 5的相類似。并且好像并不比后者更好用，在此不再贅述。其實(shí)，使用軟件自動(dòng)搜索引