產(chǎn)青霉素酶枯草芽孢桿菌的分離、純化與相關(guān)酶活性的檢測

1、產(chǎn)青霉素酶桿菌的分離、優(yōu)化及酶活力的檢測一、實驗目的1、了解采集土樣的要求和方法。2、掌握由土壤中分離產(chǎn)青霉素酶的基本原理和操作技術(shù)。3、學習并掌握土壤稀釋法和微生物的純培養(yǎng)技術(shù)。4、學習并掌握細菌培養(yǎng)基的制備。5、學習并掌握細菌發(fā)酵液產(chǎn)酶活性的檢測方法。二、實驗原理青霉素酶 (EC3. 5. 2. 6) 是催化水解青霉素 -酰胺環(huán) , 使青霉素變成無抗菌活性的青霉素 酮酸的一類 - 酰胺酶 。 早 在 1940 年青霉素還 未廣 泛應用于 臨床時,Abraham 等就從耐青霉素的 E.coliK12 中發(fā)現(xiàn)了青霉素酶 , 該酶也是關(guān)于 -酰胺酶的首次報道。隨后在地衣芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌中相

2、繼發(fā)現(xiàn)了這種特性的青霉素酶。并對地衣芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌產(chǎn)青霉素酶的發(fā)酵條件、酶學性質(zhì)和基因序列進行了研究。雖然細菌產(chǎn)生青霉素酶是導致出現(xiàn)耐藥性的原因之一, 但利用青霉素酶具有水解 -酰胺類抗生素的特點 , 可將其用于抗生素藥品質(zhì)量檢驗和新抗菌藥物篩選。該酶最具廣闊應用前景的用途是用于對牛奶中的青霉素殘留量的快速定量測定和對青霉素超標牛乳進行處理。 國外在 20 世紀 80 年代中期就開展了青霉素酶固定化及處理青霉素超標牛乳的研究 , 近年對青霉素酶生物傳感器的研究非常活躍。 另外 , 由于青霉素酶具有價格低廉和靈敏度高等優(yōu)點 , 其可在酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA ) 中替代傳統(tǒng)的辣根過

3、氧化物酶和堿性磷酸酶。 我國在青霉素酶的研究方面起步較晚。 1999 年 ,中國藥品生物制品檢定所在我國最先分離出一株能產(chǎn)生青霉素酶的蠟狀芽孢桿菌 CM CC(B ) 63301, 并對該酶的發(fā)酵方法、水解酶譜和保存穩(wěn)定性等方面進行了研究。該菌株作為青霉素酶產(chǎn)生菌已被收入中國藥典。但目前國在青霉素酶的研究和應用方面的報道較少?？莶菅挎邨U菌芽孢桿菌屬的一種。單個細胞0.7 0.8 ×23 微米，著色均勻。無莢膜，周生鞭毛，能運動。革蘭氏陽性菌，芽孢0.6 0.9 ×1.0 1.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在

4、液體培養(yǎng)基中生長時，常形成皺醭。需氧菌?？衫玫鞍踪|(zhì)、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。有的菌株是 - 淀粉酶和中性蛋白酶的重要生產(chǎn)菌；有的菌株具有強烈降解核苷酸的酶系，故常作選育核苷生產(chǎn)菌的親株或制取 5'- 核苷酸酶的菌種。在遺傳學研究中應用廣泛，對此菌的嘌呤核苷酸的合成途徑與其調(diào)節(jié)機制研究較清楚。廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名?？莶菅挎邨U菌的作用機理：1、枯草芽孢桿菌菌體生長過程中產(chǎn)生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短桿菌肽等活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)對致病菌或源性感染的條件致病菌有明顯的抑制作用；2 、枯草芽孢桿菌迅速消耗環(huán)境中的游離氧，造成腸道低氧，促進

5、有益厭氧菌生長，并產(chǎn)生乳酸等有機酸類，降低腸道PH值，間接抑制其它致病菌生長；3、刺激動物免疫器官的生長發(fā)育，激活T、B 淋巴細胞，提高免疫球蛋白和抗體水平，增強細胞免疫和體液免疫功能，提高群體免疫力； 4、枯草芽孢桿菌菌體自身合成 - 淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類，在消化道中與動物體的消化酶類一同發(fā)揮作用；5、能合成維生素B1、B2、 B6、煙酸等多種 B 族維生素，提高動物體干擾素和巨噬細胞。三、實驗材料1. 溶液和試劑牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、硫酸鐵、1mol/L 氫氧化鈉、 1mol/L 鹽酸、瓊脂、枸櫞酸鈉、 K 2HPO42儀器和其他用品試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、天

6、平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH試紙（ pH5.59.0 ）、棉花、牛皮紙、記號筆、麻繩、紗布、移液槍（ 20L、200L、1000L）、槍頭四、實驗步驟及結(jié)果注意：所有試驗操作均要在無菌條件下進行，防雜菌污染。（1） 操作在無菌室，吳俊祥，超凈工作臺上進行，雙手用70-75%酒精棉球擦拭。（2） 培養(yǎng)容器（試管，培養(yǎng)皿等）要事先滅菌，培養(yǎng)時加蓋。（3） 接種用具要滅菌。試驗流程：取土樣稀釋接種梯度培養(yǎng)優(yōu)化菌種重復優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)保存菌種重復誘導保存菌種紫外誘變正交優(yōu)化測酶活測酶活時間安排：5月 16 日：采集土樣（縉云山土，沙土，泥土） 。5月 19 日：土樣稀釋、倒平板、接種。5月 21 日：

7、初選菌落，培養(yǎng)24 小時。5月 22 日：配制含有 10000 單位 /mL 青霉素的平板5 個，將 4000 單位青霉素的平板上的菌落轉(zhuǎn)接到 10000 單位 /mL 青霉素的平板上， 30 培養(yǎng) 24 小時。5月 23日：配制含有 20000 單位 /mL 青霉素的平板4 個，轉(zhuǎn)接， 30 培養(yǎng) 24 小時。5月 24日：選出生長較好的12 株菌，接種到含有20000 單位 /mL 青霉素的液體培養(yǎng)基試管，搖床培養(yǎng)24 小時。5月 25日：觀察發(fā)現(xiàn)只有一支試管（沙 3）中液體出現(xiàn)渾濁，保存菌種于一支斜面。5月 28日：又發(fā)現(xiàn)了 3 支試管中液體出現(xiàn)渾濁，并將他們保種于斜面。將沙3 的菌種取

8、出 1mL接到含 1 萬單位青霉素的搖瓶 ,1mL 接到含 2 萬單位青霉素的搖瓶中，搖床培養(yǎng) 24 小時。同時將 3 支渾濁試管中的菌液各取出1mL接到含 1萬單位青霉素的搖瓶中，搖床培養(yǎng) 24 小時 . 5 月 29 日：正交試驗，紫外誘變 5 月 30 日：酶活力的測定5 月 31 日：酶活力的測定實驗步驟：（一）菌種的分離與純化牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基【配方】牛肉膏3g蛋白胨10g氯化鈉5g瓊脂15-20g水1000mlPH7.0-7.2材料及儀器土壤樣品，無菌水，無菌玻璃棒，接種環(huán)，酒精燈，采土鏟，細目篩，藥勺，稱量紙，試管架，小天平，記號筆，鑷子，圓濾紙片， 15×150mm試

9、管，無菌漏斗，牛皮紙袋，培養(yǎng)皿， 1ml、5ml 吸管， 250ml 三角瓶 ( 帶玻璃珠 ) ，玻璃刮鏟，實驗具體步驟：稱量和溶化按要求稱取藥品，并加熱攪拌使之溶解。調(diào)節(jié) pH先確定溶液此時的PH，再根據(jù)情況調(diào)節(jié)pH至 7.0-7.2分裝將配制好的培養(yǎng)基分裝入四個200ml 的三角瓶，每瓶約150ml，注意不要使培養(yǎng)基粘在瓶口上，以免引起污染。加紗布與包扎三角瓶加塞后，外包牛皮紙，用線繩以活結(jié)形式扎好，在皮紙上標明名稱、組別、日期。滅菌0.1Mpa 1530min高壓蒸汽滅菌。（將培養(yǎng)皿、玻璃棒、分裝器一起滅菌。）冷卻待冷卻至 60，取出兩瓶 150ml 的培養(yǎng)基，向其中一瓶加入18.75m

10、g 的青霉素，使其青霉素濃度為200u/ml ，傾倒斜面平板， 待冷卻后，將另外的 150ml 培養(yǎng)基分裝于平板上，是平板成平面，并在平板底部做好標記，濃度的梯度趨勢。（1）采樣：選取離地面5 10 cm 處的土，用小鏟子取樣，將采集到的土樣盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。準確取樣 10 克，加入裝有 90ml 無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，震蕩約 20min，使土樣與水充分混勻，靜置，取上清液。（2） 稀釋 用一支無菌吸管從中吸取1ml 土壤懸液加入裝有9ml 無菌水的試管中， 吹吸 3 次，讓菌液混合均勻，即成10-2 稀釋液 ; 以此類推，制成10-1 ，10-2 ，10-6 等一系列稀釋菌液，

11、編號。（3） 將梯度培養(yǎng)基編號。-3-4（4） 將無菌平板編上 10 ,10，每濃度涂布兩個平板， 共有三個土樣， 每個每個土樣接種兩個濃度。用無菌吸管按無菌操作要求吸取10-3 10-4稀釋液各 0.1ml 放入編號的平板中，再用無菌玻璃棒將菌液在平板上涂抹均勻。（三種土樣，每個稀釋度各涂布兩個培養(yǎng)基，共需要 12 個培養(yǎng)基）（5） 培養(yǎng)在 30條件下倒置培養(yǎng) 24h。菌落的判斷菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長時，常形成皺醭 ,需氧菌 . 在肉汁培養(yǎng)基上的菌落為扁平、邊緣不整齊、白色、表面粗糙皺褶， 24h 后菌落直徑為 3mm。配制青霉素濃度分別為 1000u/ml

12、2000u/ml 4000u/ml 濃度的培養(yǎng)基各兩個。即共制作 6 個培養(yǎng)基，待接種使用。（6） 觀察不同培養(yǎng)基上菌落的形態(tài)，首先根據(jù)芽孢桿菌的菌落特診初步判斷菌落種類，然后用結(jié)晶紫染色的方法確定是否為所需桿菌，挑選出生長良好的 20 株桿菌菌落，分別接種于三個不同濃度的培養(yǎng)基中， 每個培養(yǎng)基點接 10 個菌落，30恒溫箱中培養(yǎng) 24h。配制青霉素濃度分別為 10000u/ml,20000u/ml 濃度的培養(yǎng)基各兩個， 即共配制 4 個培養(yǎng)基，待接種使用。（7） 觀察不同培養(yǎng)基上菌落的生長狀況，挑取生長良好的 12 株菌落，分別接種于培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基接種 6 株，在 30條件下倒置培養(yǎng)

13、24h。配制青霉素濃度為20000u/ml 的 LB 液體培養(yǎng)基，分裝于12 支試管中。（8）觀察培養(yǎng)基上菌落的生長狀況將青霉素濃度為 20000u/ml 的培養(yǎng)基上的所有菌落都接種于 LB液體培養(yǎng)基中， 挑取青霉素濃度為 10000u/ml 培養(yǎng)基上長勢良好的菌落也接種于液體培養(yǎng)基中，共挑選了12 株， 32恒溫搖床培養(yǎng)24h。（9）通過培養(yǎng)，有一支試管培養(yǎng)基變渾濁，將試管中的菌種斜面保存。另外，量取試管中菌液各 1ml，分別接種在青霉素濃度為10000u/ml,20000u/ml的兩個含 100mlLB 液體培養(yǎng)基中， 32恒溫搖床培養(yǎng)24h。(10) 兩個搖瓶培養(yǎng)基中都十分渾濁，分別取菌

14、液保種?！靖阶ⅰ拷Y(jié)晶紫染色法結(jié)晶紫染色液 (Crystal Violet Staining Solution) 是一種組織或細胞染色時常用的可以把細胞核染成深紫色染色后的的染色液。用于革蘭氏染色. ，結(jié)晶紫是一種堿性染料，可以和細胞核中的DNA結(jié)合，從而產(chǎn)生細胞核染色。簡單染色法是一種最基本的染色方法，是只用一種染料使細菌著色以顯示其形態(tài)的方法。因細菌蛋白質(zhì)等電點較低，當它生長于中性、堿性或弱酸性的溶液中時常帶負電荷，而堿性染料的離子帶正電荷，能和帶負電荷的物質(zhì)結(jié)合。所以通常采用堿性染料（如美藍、結(jié)晶紫、堿性復紅、孔雀綠或蕃紅）等進行染色，當這類染料解離后，染料離子帶正電荷，使菌體著色實驗步驟

15、：1 、涂片：用消毒棉球擦拭雙手，用鑷子取干凈載玻片一塊，在載玻片的左、右兩端各加一滴蒸餾水，按無菌操作法取菌涂片，涂培養(yǎng)基中生長良好的菌落，做成濃菌懸液。亦可直接在載玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。2、晾干：讓涂片自然晾干或者在酒精燈火焰上方用文火烘干。3、固定：手執(zhí)玻片一端，讓菌膜朝上，通過火焰2 3 次固定，以不燙手為宜。4、染色：用將固定過的涂片放在廢液缸上的擱架上，加結(jié)晶紫染液1-2min 。5、水洗：水洗去涂片上的染色液。6、干燥：將洗過的涂片放在空氣中晾干或用吸水紙吸干，勿將菌體擦掉。7、鏡檢：先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當?shù)囊曇昂?，將高倍鏡轉(zhuǎn)出，在涂片上加香柏油一滴，將

16、油鏡頭浸入油滴中仔細調(diào)焦觀察細菌的形態(tài)。（二）菌種的紫外誘變（1）取青霉素濃度為 20000u/ml 的液體培養(yǎng)基中 1ml，按十倍稀釋法稀釋到 10-4 ，然后將稀釋 1000 倍的菌液涂布于 5 個 LB 培養(yǎng)基上，分別將 5 個培養(yǎng)基在紫外線照射45s、 75s、105s、135s、165s，同樣，將稀釋 10000 倍的菌液涂布 5 個 LB 培養(yǎng)基上，紫外線誘變同樣時間。（2）30恒溫培養(yǎng) 24h 后，觀察菌落生長情況。菌落生長的很小，在培養(yǎng)基靠邊緣的地方有很多菌落生長，因為紫外線沒有照射到。（3）30恒溫繼續(xù)培養(yǎng)24h 后，觀察得稀釋1000 倍誘變 135s、稀釋 10000 倍

17、誘變75s 的生長情況最好。誘變結(jié)果將生長在稀釋 1000 倍誘變 135s、稀釋 10000 倍誘變 75s 兩個培養(yǎng)基上菌落挑取，保存于斜面。（三）菌種產(chǎn)青霉素酶的條件的選擇（1）為了使分離后得到菌種產(chǎn)生更多的青霉素酶，設計正交試驗，配制9 個 100ml的液體培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)集成分如下：蛋白胨1.5g甘油5g牛肉膏0.4-0.5g硫酸鎂0.02g氯化鈉K2HPO 4枸櫞酸鈉水定容到100ml表 1. 正交表實驗設計因素水平氯化鈉K 2HPO4枸櫞酸鈉10.3g0.3g0.488g20.4g0.4g0.588g30.5g0.5g0.688g表 2. 正交表實驗方案編號氯化鈉K2 HPO4枸

18、櫞酸鈉白色圓直徑大小10.3g0.3g0.488g20.3g0.4g0.588g30.3g0.5g0.688g40.4g0.3g0.588g50.4g0.4g0.688g60.4g0.5g0.488g70.5g0.3g0.688g80.5g0.4g0.488g90.5g0.5g0.588gK1K2K3按上述實驗方案，將9 個培養(yǎng)基 32搖瓶培養(yǎng) 24h。（2）制備 KI 淀粉試紙，直徑約 1cm，配制較大濃度的碘液，將試紙浸潤，吹干，滴加 10000u/ml 的青霉素溶液 2 微升，分別滴加 9 瓶中菌液各 1 微升，觀察試紙片白色圈的大小，測量直徑，結(jié)果如表3 所示。表 3. 正交表實驗結(jié)果

19、編號氯化鈉K2 HPO4枸櫞酸鈉白色圓直徑大?。?mm ）10.3g0.3g0.488g5.620.3g0.4g0.588g5.830.3g0.5g0.688g6.340.4g0.3g0.588g5.950.4g0.4g0.688g6.260.4g0.5g0.488g5.870.5g0.3g0.688g5.180.5g0.4g0.488g6.190.5g0.5g0.588g5.9K117.716.617.5K217.918.117.6K317.118.017.6由結(jié)果可知第三組效果最好，將第三組作為測試組。正交試驗結(jié)果分析 ： 氯化鈉因素第二因素17.9 最大，磷酸二氫鉀第二因素18.1 最大

20、，枸櫞酸鈉因素第二、三因素17.6 最大。因此可知，培養(yǎng)集成分如下：蛋白胨1.5g甘油5g牛肉膏0.4-0.5g硫酸鎂0.02g氯化鈉0.4gK HPO40.4g2枸櫞酸鈉0.588g-0.688g水定容到100ml（四）酶活力的測定1. 粗酶液的制備（1） 取青霉素濃度為20000u/ml 的搖瓶培養(yǎng)基中菌液15ml，4000r/min 離心 20min，得上清，冷凍結(jié)冰，除去雜質(zhì)，取出結(jié)冰后菌液溶化，再次 4000r/min 離心 20min，得上清，即為粗酶液1。（2） 取上述正交試驗測試第三組，取 15ml，4000r/min 離心 20min，得上清，冷凍結(jié)冰，除去雜質(zhì)，取出結(jié)冰后菌

21、液溶化，再次 4000r/min 離心 20min，得上清，即為粗酶液 2。2酶活力的測定（1）青霉素溶液稱取青霉素鈉（鉀）適量，用磷酸鹽緩沖液每 1ml 中含青霉素 1 萬單位的溶液。（2）青霉素酶稀釋液取粗酶溶液， 按估計單位用磷酸鹽緩沖液(pH7.0)(pH7.0)，溶解成稀釋 1000倍，在37預熱。（3）測定法 精密量取青霉素溶液 50ml, 置 100ml 量瓶中，預熱至 37后，精密加入已預熱的粗酶稀釋液 25ml，迅速混勻，在 37準確放置 1 小時，精密量取 3ml，立即加至已精密量取的碘滴定液 (0.01mol/L) 精密量取碘滴定液 (0.1mol/L)10ml ，置 1

22、00ml 量瓶中，用醋酸鈉緩沖液 (pH4.5) 稀釋至刻度25ml 中, 在室溫暗處放置 15 分鐘，用硫代硫酸鈉滴定液 (0.01mol/L) 滴定，至近終點時，加淀粉指示液，繼續(xù)滴定至藍色消失。（4）空白試驗 取已預熱的青霉素溶液 2ml，在 37放置 1 小時，精密加入上述碘滴定液 (0.01mol/L)25ml ，然后精密加粗酶稀釋液 1ml，在室溫暗處放置 15 分鐘，用硫代硫酸鈉滴定液 (0.01mol/L)滴定。按下式計算：E(BA)×M×F×D×100BAMF霉素的效價（D式中E為青霉素酶活力，單位(ml. 小時 ) ；為空白滴定所消耗

23、的上述硫代硫酸鈉滴定液的容量，為樣品滴定所消耗的上述硫代硫酸鈉滴定液的容量，為硫代硫酸鈉滴定液的濃度，mol/L ；為在相同條件下，每 1ml 的上述碘滴定液 (0.01mol/L)742），單位；為青霉素酶溶液的稀釋倍數(shù)。ml；ml；相當于青【附注】磷酸鹽緩沖液 (pH7.0)取磷酸氫二鉀 7.36g 與磷酸二氫鉀 3.14g, 加水成 1000ml。醋酸鈉緩沖液 (pH4.5)取冰醋酸 13.86ml, 加水使成 250ml；另取結(jié)晶醋酸鈉27.30g, 加水使成 200ml，兩液混合均勻。碘滴定液稱取 13g 碘及 35g 碘化鉀，溶于100 mL 水中，稀釋至 1 000mL，搖勻，貯

24、存于棕色瓶中。3. 酶活力測定結(jié)果粗酶液 1 測定結(jié)果， B=10.2ml A=6.0ml代入公式得E(BA)×M×F×D×100=（10.2-6.0 ）× 0.01 × 742× 1000×100= 3256400（即 325.64 萬）粗酶液 2 測定結(jié)果， B=11.5ml A=6.6ml代入公式得E=（B-A）× M×F× D× 100=(11.5-6.6)×0.01 × 742×1000×100=3635800 (即 363.

25、58 萬)五、實驗存在的問題、討論方法及經(jīng)驗總結(jié)1碘量法測定酶活力方法重復性很差，在試樣測試過程中，我們將粗酶液從 10 倍稀釋到 100 萬倍，分別對照空白試驗，測量結(jié)果均不是很理想，經(jīng)過三次試驗，取得最優(yōu)的實驗結(jié)果。2試驗過程，空白組消耗的硫代硫酸鈉應大于測試組，但實驗有時也會出現(xiàn)空白組消耗體積小的情況，而且隨著粗酶液稀釋倍數(shù)的增加， （B-A）的數(shù)值也并未見成十倍的減少。理論分析實驗過程，青霉素被青霉素酶降解后產(chǎn)生青霉素噻唑酸，青霉素噻唑酸能夠與碘產(chǎn)生反應，碘量法測定即加入過量的碘試液，用硫代硫酸鈉滴定剩余碘，則酶與青霉素反應的時間越長產(chǎn)生的噻肟酸越多，消耗的硫代硫酸鈉越少。實驗結(jié)果會出

26、現(xiàn)與理論分析相反的結(jié)果，可能原因：（1）提純酶的過程，酶液含有未知物質(zhì)，對反映產(chǎn)生干擾大。（2）粗酶提取后，由于放置時間過長，酶的活力受到影響。3. 酶活力測定的影響因素（1）反應速度大多數(shù)酶促反應是可逆反應，其速度既受底物濃度的影響，也受產(chǎn)物生成量的影響。當?shù)孜餄舛容^高時，在反應的初期，其濃度變化甚微，產(chǎn)物生成量也很少，此時反應速度可看作是恒定的。酶反應動力學中所指速度就是反應的初速度。（2）底物濃度米氏方程 = maxS/Km+S 是反映酶促反應速度與底物濃度關(guān)系的方程式，其中 Km稱米氏常數(shù)。Km值是酶的特征常數(shù)之一，只與酶的性質(zhì)有關(guān)，而與酶濃度無關(guān)。不同的酶，Km值不同。同一個酶有幾種底物時，則對每一種底物各有一特定的 Km值，其中 Km值最小的底物一般稱為該酶的最適底物或天然底物。綜上所述，根據(jù)酶的特性及定量原理