NorthernBlot實(shí)驗(yàn)方法步驟

1、精品文檔Northern Blot 實(shí)驗(yàn)方法步驟實(shí)驗(yàn)原理在變性條件下將待檢的 RNA 樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳， 繼而按照同 Southern Blot 相同的原 理進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和用探針進(jìn)行雜交檢測。用途：檢測樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）及其含量。實(shí)驗(yàn)試劑1. NorthernMax Kit ( Cat.# 1940 ， Ambion, Inc.)2. 瓊脂糖3. DEPC4. X 光底片5. 底片暗盒6. Ran dom Primer7. dNTP Mixture8. 111 TBq/mmola-32PdCTP9. Exo-free Kle now Fragme nt 和 10 X B

2、uffer10. Sephadex G-5011. SDS12. 雙氧水，滅菌水等實(shí)驗(yàn)設(shè)備1. 恒溫水浴箱2. 電泳儀3. 凝膠成像系統(tǒng)4. 真空轉(zhuǎn)移儀5. 真空泵6. UV 交聯(lián)儀7. 雜交爐8. 恒溫?fù)u床9. 脫色搖床10. 漩渦振蕩器11. 分光光度計(jì)12. 微量移液器13. 電爐（或微波爐）14. 離心管，燒杯，量筒，三角瓶等精品文檔實(shí)驗(yàn)材料總 RNA 樣品或 mRNA 樣品，探針模板 DNA（25 ng），尼龍膜實(shí)驗(yàn)步驟1. 用具的準(zhǔn)備：180 度烤器皿：三角錐瓶、量筒、鑷子、刀片等4 小時(shí)。電泳槽：清洗梳子和電泳槽，并用雙氧水浸泡過夜，用DEPC 水沖洗，干燥備用。處理 DEPC

3、水（2 L）備用。2. 用 RNAZaP 去除用具表面的 RNase 酶污染用 RNAZap 擦洗梳子，電泳槽，刀片等，然后用DEPC 水沖洗二次，去除 RNAZap。3. 制膠1）稱取 0.36mg 瓊脂糖加入三角錐瓶中，加入32.4mlDEPC 水后，微波爐加熱至瓊脂糖完全熔解。60C空氣浴平衡溶液（需加 DEPC 水補(bǔ)充蒸發(fā)的水分）。2）在通風(fēng)廚中加入 3.6ml 的 10 * Denaturing Gel buffer ，輕輕振蕩混勻。 注意盡量避免產(chǎn)生氣泡。3）將熔膠倒入制膠板中，插上梳子。如果膠溶液上存在氣泡，可以用熱的玻璃棒或其它方法去除，或?qū)馀萃频侥z的邊緣。注： 膠的厚度不能

4、超過 0.5cm。4）膠在室溫下完全凝固后，將膠轉(zhuǎn)移到電泳槽中，加入 1x MOPS Gel Running buffer 蓋過膠面約 1cm，小心拔出梳子。（配制 250ml1 * MOPS Gel Running buffer，在電泳過程中補(bǔ)充蒸發(fā)的 buffer。）5）檢查點(diǎn)樣孔。4. RNA 樣品的制備在 RNA 樣品中加入 3 倍體積的 formaldehyde load dye 和適當(dāng)?shù)?EB （終濃度為 10ug/ml ）。 混勻后，65C空氣浴 15min。短暫低速離心后，立即放置于冰上5min。5. 電泳：1）將 RNA 樣品小心加到點(diǎn)樣孔中。2）在 5V/cm 下跑膠（5x

5、14cm ）。在電泳過程中，每隔30min 短暫停止電泳，取出膠，混勻兩極的電泳液后繼續(xù)電泳。當(dāng)膠中的溴紛藍(lán)（500bp ）接近膠的邊緣時(shí)終止電泳。3）紫外燈下，檢驗(yàn)電泳情況，并用尺子測量18S、28S、溴紛藍(lán)到點(diǎn)樣孔的距離。注意不要讓膠在紫外燈下曝光太長時(shí)間。6. 轉(zhuǎn)膜1）用 3%雙氧水浸泡真空轉(zhuǎn)移儀后，用DEPC 水沖洗。2）用 RNAZap 擦洗多孔滲水屏和塑膠屏，用DEPC 水沖洗二次。3）連接真空泵和真空轉(zhuǎn)移儀，剪取一塊適當(dāng)大小的膜（膜的四邊緣應(yīng)大于塑膠屏孔口的5mm ），膜在 Transfer buffer 浸濕 5 分鐘后，放置在多孔滲水屏的適當(dāng)位置。4）蓋上塑膠屏，蓋上外框，扣

6、上鎖。5）將膠的多余部分切除，切后的膠四邊緣要能蓋過塑膠屏孔，并至少蓋過邊緣約2mm ,以防止漏氣。6）將膠小心放置在膜的上面，膜與膠之間不能有氣泡。7）打開真空泵，使壓強(qiáng)維持在5058mbar ;立即將 transfer buffer 加到膠面和四周。每隔 10min 在膠面加上 1ml transfer buffer ，真空轉(zhuǎn)移 2 小時(shí)。8）轉(zhuǎn)膜后，用鑷子夾住膜，于1x MOPS Gel Running buffer 中輕輕泡洗 10 秒，去除殘余的膠和鹽。精品文檔9) 用吸水紙吸取膜上多余的液體后，將膜置于 UV 交聯(lián)儀中自動(dòng)交聯(lián)。10) 將膠和紫外交聯(lián)后的膜，在紫外燈下檢測轉(zhuǎn)移效率。

7、( 避免太長的紫外曝光時(shí)間 )12)將膜在-20C保存。7.探針的制備1) 在 1.5ml 離心管中配制以下反應(yīng)液： 模板 DNA(25 ng) 1ulRandom Primer 2ul 滅菌水 11ul 總體積： 14ul2) 95 。加熱 3 分鐘后，迅速放置于冰冷卻5min。3) 在離心管中按下列順序加入以下溶液：10 XBuffer2.5uldNTP Mixture 2.5ul111 TBq/mmola-32PdCTP 5 ulExo-free Klenow Fragment 1 ul4) 混勻后(25ul), 37C下反應(yīng) 30 分鐘。短暫離心，收集溶液到管底。5) 65加熱 5mi

8、n 使酶失活。8.探針的純化及比活性測定：1) 準(zhǔn)備凝膠：將 1g 凝膠加入 30ml 的 DEPC 水中，浸泡過夜。用 DEPC 水洗滌膨脹的凝 膠數(shù)次，以除去可溶解的葡聚糖。換用新配制的 TE( PH7.6)。2) 取 1ml 一次性注射器，去除內(nèi)芯推捍，將注射器底部用硅化的玻璃纖維塞住，在注射 器中裝填Sephadex G-50 凝膠。3) 將注射器放入一支 15ml 離心管中，注射器把手架在離心管口上。 1600g 離心 4 分鐘， 凝膠壓緊后，補(bǔ)加 Sephadex G-50 凝膠懸液，重復(fù)此步直至凝膠柱高度達(dá)注射器 0.9ml 刻 度處。4) 100ul STE 緩沖液洗柱，160

9、0g 離心 4min。重復(fù) 3 次。5) 倒掉離心管中的溶液后，將一去蓋的 1.5ml 離心管置于管中，再將裝填了 Sephadex G-50 凝膠的注射器插入離心管中，注射器口對準(zhǔn) 1.5ml 離心管。6) 將標(biāo)記的 DNA 樣品加入 25 ul STE ，取出 0.5ul 點(diǎn)樣于 DE8 paper 上，其余上樣于層 析柱上。7) 1600g 離心 4min ， DNA 將流出被收集在去蓋的離心管中，而未摻入 DNA 的 dNTP 則 保留在層析柱中。取 0.5ul 己純化的探針點(diǎn)樣于 DE8-paper 。8) 測比活性 (試劑比活要求 :106cpm/ml )。9.預(yù)雜交：1) 將預(yù)雜

10、交液在雜交爐中 68C預(yù)熱，并漩渦使未溶解的物質(zhì)溶解。2) 加入適當(dāng)?shù)?ULRAhyb 到雜交管中(以 100cm2膜面積加入 10mlULRAhyb 雜交液)，42C預(yù)雜交 4 hr 。10. 探針變性：1) 用 10 mM EDTA 將探針稀釋 10 倍。2) 90C熱處理稀釋后探針 10min 后，立即放置于冰上 5min。3) 短暫離心，將溶液收集到管底。11. 雜交：1) 加入 0.5ml ULTRAhyb 到變性的探針中，混勻后，將探針加到預(yù)雜交液中。2) 42C雜交過夜(1424hr )。雜交完后，將雜交液收集起來于-20C保存。12.洗膜：1）低嚴(yán)緊性洗膜：加入 Low Stringency Wash Solution#1 （100cm2膜面積加入 20ml 洗膜溶液），室溫下，搖動(dòng)洗膜 5min 兩次。精品文檔2）高嚴(yán)緊性洗膜：加入 High Stringency Wash Solution#2 （100cm2膜面積加入 20ml 洗膜溶液），42C搖動(dòng)洗膜 20min 兩次。13曝光:1）將膜從洗膜液中取出，用保鮮膜包住，以防止膜干燥。2）檢查膜上放射性強(qiáng)度，估計(jì)曝光時(shí)間3）將 X 光底片覆蓋與膜上，曝光4）沖洗 X 光底片，掃描記錄結(jié)果。14. 去除膜上的