不同濃度rhEPO對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)增殖的影響

1、不同濃度rhepo對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)增殖的影響:胡萌，呂剛，梅晰凡，張世民【摘要】 目的觀(guān)察不同濃度rhepo對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)增殖 的影響，探討rhepo聯(lián)合神經(jīng)干細(xì)胞移植治療脊髓損傷修復(fù)的影 響。方法 用不同濃度(5、50、500 u/ml)rhepo干預(yù)從新生sd大鼠 (出生24 h以?xún)?nèi))取材來(lái)的神經(jīng)干細(xì)胞，分別檢測(cè)每組神經(jīng)干細(xì)胞克 隆形成率;在不同時(shí)間分別用mtt法檢測(cè)細(xì)胞增殖率;神經(jīng)干細(xì)胞分 化的免疫細(xì)胞化學(xué)染色及計(jì)數(shù)。結(jié)果添加rhepo各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增 殖較快最終神經(jīng)球的數(shù)量多于對(duì)照組，以50 u/ml rhepo組作用顯著; 添加rhepo各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞牛長(zhǎng)曲線(xiàn)均高于對(duì)照組,尤

2、其是50 u/ml rhepo組顯著高于對(duì)照組;nse和gfap免疫細(xì)胞化學(xué)染色和計(jì)數(shù)結(jié) 果顯示,50 u/ml rhepo組中nse免疫陽(yáng)性細(xì)胞明顯多于對(duì)照組 (p<0.01)o結(jié)論rhepo對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)增殖有促進(jìn)作用， 尤以適中濃度(50 u/ml)作用更加明顯?！娟P(guān)鍵詞】神經(jīng)干細(xì)胞;rhepo;體外培養(yǎng);增殖abstract: objective to observe the effect ultiplies in vitro raise to the nerve stem cell of different density rhepo, and to discus

3、s the influence of rhepo, associated cell transplant, in curing spinal cord damage repair. methods the present research firstly intervened the nerve stem cell, obtained from the neouse (born l). then, a distinctive examination of the rate of clone formation in each group s nerve stem cells ethod ine

4、 the cell reproducibility in different times and nerve stem cell differentiation s immunocytochemistry dyeing and counting. results the cell multiplication in experimental groups arkable in 50 u/mlepo group. the cell groental groups arkable in 50 u/ml epo group. the nse and gfap immunocytochemistry

5、dyeing and the counting results shomunity masculine cells in the 50 u/ml epo group ore than that in the control group (p<0.01). conclusions rhepo has the positive effect on the nerve stem cell in vitro raise multiplication, ore obvious oderate density (50 u/ml).key cell; rhepo; in vitro raise

6、; multiplication神經(jīng)干細(xì)胞(nerve stem cell,nscs)是一種具有復(fù)制能力和多向分 化潛能的原始細(xì)胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)研究中逐漸引起醫(yī) 學(xué)界的關(guān)注。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)干細(xì)胞不僅存在于胚胎腦組 織，而且已發(fā)育成熟的 內(nèi)也存在神經(jīng)干細(xì)胞1。正常情況下這些 nscs處于“靜止”或“休眠”狀態(tài)，在特定因素的作用下，例如損 傷或刺激，其分裂、分化的潛能就被激活，從而出現(xiàn)增殖現(xiàn)象。堿 性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast groega公司)、胰蛋白酶、谷 氨酰胺（sigma）, mtt（卩塞呼蘭）、dmso（二甲基亞颯），及其他相關(guān) 試劑。1.2

7、方法1.2.1神經(jīng)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)新生sd大鼠經(jīng)75%酒精消毒，無(wú)菌條件下將前腦完整取 出，借助顯微鏡在視交叉平面和海馬平面各做一道冠狀切口，留取 自視交叉至海馬約2 mm厚的腦塊。將留取的腦塊冠狀面朝上放 置，然后在側(cè)腦室外側(cè)做兩道矢狀切口，并且在臍月氐體上方做一水 平切口，留取中間圍繞側(cè)腦室前角的腦塊。此部位包含側(cè)腦室前角 室下帶（subventricular zone, svz）,富含神經(jīng)干細(xì)胞。去除軟腦膜 和脈絡(luò)叢組織。將腦組織轉(zhuǎn)移到另一培養(yǎng)皿，用剪刀反復(fù)剪切至約 1 mm3大小組織塊，加入dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基23 ml,用吸管反 復(fù)吹打，制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液用200目銅網(wǎng)過(guò)

8、濾，去除殘 留未分散組織，將濾液移入無(wú)菌10 ml離心管。離心機(jī)將過(guò)濾的細(xì) 胞懸液以1 000 r/min離心10 min,以便收集細(xì)胞。吸管小心吸除 上清液體，將沉淀的細(xì)胞重懸于2ml含b27和20 ng/ml bfgf, 20 ng/ml egf的dmem/f12培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后以2-5x105個(gè) 細(xì)胞/ml接種于25 cm3培養(yǎng)瓶。置37 oc, 5%co2培養(yǎng)箱內(nèi)培 養(yǎng)。培養(yǎng)45 d后，將含細(xì)胞的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中，1 000 r/min離心10 min,收集細(xì)胞。同樣方法小心吸除上清液體，用相同 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后，接種于更換的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。每57天 換液1次。培養(yǎng)2周左

9、右時(shí)見(jiàn)神經(jīng)干細(xì)胞克隆形成，34周見(jiàn)大 量神經(jīng)干細(xì)胞球。以后用機(jī)械法分散神經(jīng)球方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。1.2.2神經(jīng)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)將細(xì)胞移入無(wú)菌10 ml離心管，以1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min,收集細(xì)胞。吸除上清液體，向沉淀中加入3倍體積的0.25%胰 蛋白酶/edta（1： 1）消化液，37 °c水浴5 min。用吸管輕輕吹打成單 細(xì)胞懸液（此步驟時(shí)間不超過(guò)5 min）o加入1/10體積的血清終止消 化。以25x105個(gè)細(xì)胞/ml細(xì)胞濃度繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)基成分同 上。1.3實(shí)驗(yàn)分組取第3代神經(jīng)干細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液,分別接種于含rhepo 5、 50、500 u/ml的無(wú)血清培

10、養(yǎng)基中，同時(shí)設(shè)不含rhepo的對(duì)照組，其中 實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組無(wú)血清培養(yǎng)基含bfgf濃度均為20 ng/mlo將各組 神經(jīng)干細(xì)胞懸液置于5%co2、37 °c培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每組均設(shè)復(fù)孔, 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.4檢測(cè)指標(biāo)141檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞克隆形成率將各組細(xì)胞作梯度倍數(shù)稀釋接種于25 cm3培養(yǎng)皿中靜置培養(yǎng)。 細(xì)胞培養(yǎng)7 d時(shí)，取對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)皿放置在一張帶網(wǎng)格的透 明膠片上,在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù)，計(jì)算公式如下：克隆形成率(戶(hù)單位面積克隆數(shù)/單位面積接種細(xì)胞數(shù)x 100o1.4.2 mtt法檢測(cè)細(xì)胞的活性將各組細(xì)胞以每孔大約1.0x105個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中, 每孔體積150

11、 ul,每日檢測(cè)od值。1.4.3神經(jīng)干細(xì)胞分化的免疫細(xì)胞化學(xué)染色及計(jì)數(shù)將各組神經(jīng)干細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中(預(yù)先置有涂多聚賴(lài)氨酸 的蓋玻片),每孔平均接種50個(gè)神經(jīng)球，加入有血清培養(yǎng)基3.0 ml,靜 置培養(yǎng)，每3天換液。10 d后收集貼有細(xì)胞的蓋玻片,分別做nse、 gfap免疫細(xì)胞化學(xué)染色。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取20個(gè)視野，普通光鏡下 觀(guān)察并計(jì)數(shù)每個(gè)視野的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分率，取平均值。2.2 mtt檢測(cè)結(jié)果mtt結(jié)果顯示，添加rhepo各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)高于對(duì)照 組,尤其是50 u/ml rhepo組顯著高于對(duì)照組。2.3細(xì)胞分化比例檢測(cè)及顯微測(cè)量結(jié)果對(duì)照組神經(jīng)球貼壁率低，可見(jiàn)許多細(xì)

12、胞團(tuán)漂浮在培養(yǎng)基中，最終漂 浮的細(xì)胞團(tuán)變?yōu)榧?xì)胞碎片。添加rhepo各實(shí)驗(yàn)組中，部分神經(jīng)球貼壁 困難，一旦神經(jīng)球貼壁，隨即有突起長(zhǎng)出，胞體和突起生長(zhǎng)較快,雙突起 和多突起細(xì)胞多于對(duì)照組，第2 d即可見(jiàn)部分細(xì)胞建立突觸聯(lián)系。3 d細(xì)胞多數(shù)可形成較密集網(wǎng)絡(luò)，胞體較豐滿(mǎn)，細(xì)胞突起生長(zhǎng)快,可見(jiàn)多 角形細(xì)胞。對(duì)照組細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)稀疏，細(xì)胞胞體較小，突起變短、變粗，有 的胞體內(nèi)可見(jiàn)空泡。顯微測(cè)量結(jié)果顯示,50 u/ml rhepo組中細(xì)胞突 起長(zhǎng)度顯著高于對(duì)照組(p<0.01)onse和gfap免疫細(xì)胞化學(xué)染色和計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,50 u/ml rhepo組中nse免疫陽(yáng)性細(xì)胞明顯多于對(duì)照組(p&

13、;lt;0.01)o3討論最近的研究證實(shí)，rhepo在體內(nèi)和體外的多種神經(jīng)細(xì)胞損傷模 型中均有抗凋亡作用。在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元培養(yǎng)中，rhepo能抑制因血清 缺乏或紅藻氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。神經(jīng)細(xì)胞rhepo受體激活后，通 過(guò)干擾jak2和核轉(zhuǎn)錄因子可抑制n甲基d天(門(mén))冬氨酸(nmda) 和no誘導(dǎo)的凋亡3o rhepo還可以通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡過(guò)程中不同基因 的表達(dá)發(fā)揮抗凋亡作用。在自由基損傷模型中，rhepo可調(diào)節(jié)神經(jīng) 膜外部分的磷脂酰絲氨酸(ps)殘基，并通過(guò)調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體的膜電位和 細(xì)胞色素c的釋放以及caspase8> caspase 1和caspase3活化酶的活 性，增加絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶

14、(akt)的活性，促進(jìn)凋廣的蛋白磷酸 化而保持dna的完整性4。rhepo在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)抑制細(xì)胞凋亡的 機(jī)制可能與在紅細(xì)胞內(nèi)的機(jī)制相同。rhepo對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的許多功能活動(dòng)均具有調(diào)節(jié)作用，例如鈣離 子外流、膜的去極化、神經(jīng)遞質(zhì)的合成以及細(xì)胞的凋亡等。rhepo 可能通過(guò)抑制或刺激神經(jīng)遞質(zhì)的合成來(lái)參與突觸可塑性的調(diào)節(jié)。在 pc12細(xì)胞中，rhepo通過(guò)激活鈣離子通道刺激多巴胺的釋放和酪氨 酸疑化酶的活性，誘導(dǎo)膜的去極化，增加一氧化氮(no)的合成，促 進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)(氨基丁酸、乙酰膽堿和多巴胺等)的釋放5。在大鼠脊 髓損傷和坐骨神經(jīng)損傷模型中，rhepo能通過(guò)對(duì)突觸傳遞的直接作 用而起到傷后即刻的神經(jīng)保

15、護(hù)作用。在海馬薄片培養(yǎng)中，rhepo受體被激活后，通過(guò)激活jak2抑 制鈣離子介導(dǎo)的興奮性氨基酸釋放來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)元缺血的保護(hù)。最 近有報(bào)道顯示，rhepo能刺激t型電壓依賴(lài)性鈣通道的活性，人類(lèi)成 神經(jīng)細(xì)胞瘤的膜片鉗研究證實(shí)，有t型鈣通道的表達(dá)。當(dāng)把rhepo 加入到培養(yǎng)基中，可以觀(guān)察到鈣通道的最大峰值電流增加。因此， rhepo可以通過(guò)胞膜上的t型電壓依賴(lài)性鈣通道增加鈣離子流，進(jìn) 而影響神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的平衡來(lái)產(chǎn)生對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用6。rhepo的作用并不僅限于直接影響細(xì)胞的生存，在細(xì)胞培養(yǎng)中 也展示了其營(yíng)養(yǎng)作用。rhepo能啟動(dòng)細(xì)胞的分化，阻止細(xì)胞的死亡 和增強(qiáng)膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶的活性。這些

16、發(fā)現(xiàn)說(shuō)明，rhepo抑制神經(jīng) 元凋亡是其短暫的作用，對(duì)神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)作用則是長(zhǎng)期的?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 romero mi,lin l,lush me,et al. deletion of nflin neurons induces increased axon collateral branching after dorsal root injury j. neurosci, 2007, 27(8):2124-2134.2 karimi-abdolrezaee s,eftekharpour e,ehijardi nz,hatami m,et al. neural differentiation from human embryonic stem cells in a defined adherent culture conditionj.int j dev biol, 2007, 51(5):371-378.5 hu yf,zhang zj,sie