腫瘤個(gè)體化用藥相關(guān)基因突變檢測(cè)試劑技術(shù)審查指導(dǎo)原則》（征求意見(jiàn)稿

1、指導(dǎo)原則編號(hào)：口口口腫瘤個(gè)體化用藥相關(guān)基因突變檢測(cè)試劑技術(shù)審查指導(dǎo)原則（征求意見(jiàn)稿）二零一三年六月一、前言3二、適用范圍4三、注冊(cè)申報(bào)資料要求4（一）綜述資料4（二）產(chǎn)品說(shuō)明書5（三）擬定產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)及編制說(shuō)明12（四）注冊(cè)檢測(cè)13（五）主要原材料研究資料13（六）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料18（七）分析性能評(píng)估資料19（八）參考值（參考范圍）確定資料24（九）穩(wěn)定性研究資料24（十）臨床試驗(yàn)研究25四、名詞解釋31五、參考文獻(xiàn)32腫瘤個(gè)體化用藥相關(guān)基因突變檢測(cè)試劑技術(shù)審查指導(dǎo)原則（征求意見(jiàn)稿）前言本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)腫瘤個(gè)體化用藥相 關(guān)基因突變檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫，同

2、時(shí)也為 技術(shù)審評(píng)部門對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的技術(shù)審評(píng)提供參考。本指導(dǎo)原則是針對(duì)腫瘤個(gè)體化用藥相關(guān)基因突變檢測(cè) 試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi) 容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù), 并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和 細(xì)化。本指導(dǎo)原則是對(duì)申請(qǐng)人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不 包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行, 如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但 需要詳細(xì)闡明理由，并對(duì)其科學(xué)合理性進(jìn)行驗(yàn)證，提供詳細(xì) 的研究資料和驗(yàn)證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提 下使用本指導(dǎo)原則。本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水

3、 平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的 不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。二、適用范冃本文所述腫瘤個(gè)體化用藥相關(guān)基因突變檢測(cè)試劑是指 利用熒光探針聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)方法，以個(gè)體化用藥 相關(guān)的腫瘤突變基因?yàn)闄z測(cè)目標(biāo)，對(duì)人體樣本(包括組織、 體液等)提取的核酸組分中的目標(biāo)序列進(jìn)行體外檢測(cè)的試劑。本文所指基因突變的類型包括置換、插入、缺失、基因 重排、拷貝數(shù)異常及rna表達(dá)異常等廣義的基因突變。本文所涉及試劑的方法學(xué)不包括熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, fish )、核酸序 列測(cè)定、染色體核型分析及免疫組化技術(shù)等

4、用于腫瘤個(gè)體化 用藥指導(dǎo)的其他方法學(xué)；本文提出的相關(guān)要求亦不完全適用 于pcr熔解曲線、luminex平臺(tái)或核酸檢測(cè)芯片等其他分子 生物學(xué)技術(shù)，但有利之處可以參考執(zhí)行。本指導(dǎo)原則適用于 進(jìn)行首次注冊(cè)申報(bào)和相關(guān)許可事項(xiàng)變更的產(chǎn)品。三、注冊(cè)申報(bào)資料要求(%1) 綜述資料綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物 安全性的說(shuō)明、研究結(jié)果的總結(jié)評(píng)價(jià)以及同類產(chǎn)品上市情況 介紹等內(nèi)容，其中同類產(chǎn)品上市情況介紹部分應(yīng)著重從方法 學(xué)及不同腫瘤突變類型檢出能力等方面寫明擬申報(bào)產(chǎn)品與 目前市場(chǎng)上已獲批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。若尚無(wú)同 品種批準(zhǔn)上市，則應(yīng)詳細(xì)論述作為檢測(cè)靶標(biāo)的突變基因與個(gè) 體化用藥的相關(guān)性

5、，說(shuō)明理論依據(jù)。提交的資料應(yīng)符合體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法（試行）» （國(guó)食藥監(jiān)械2007229號(hào)）（以下簡(jiǎn)稱辦法）和體 外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料基本要求（國(guó)食藥監(jiān)械 2007 609號(hào)）的相關(guān)要求。（二）產(chǎn)品說(shuō)明書說(shuō)明書承載了產(chǎn)品預(yù)期用途、標(biāo)本采集及處理、實(shí)驗(yàn)方 法、檢測(cè)結(jié)果解釋以及注意事項(xiàng)等重要信息，是指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室 工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果給出合理醫(yī)學(xué)解 釋的重要依據(jù)，因此，產(chǎn)品說(shuō)明書是體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào) 最重要的文件之一。產(chǎn)品說(shuō)明書的格式應(yīng)符合體外診斷試 劑說(shuō)明書編寫指導(dǎo)原則的要求，境外試劑的中文說(shuō)明書除 格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說(shuō)明書的一致性，翻 譯力求準(zhǔn)

6、確且符合中文表達(dá)習(xí)慣。產(chǎn)品說(shuō)明書的所有內(nèi)容均 應(yīng)與申請(qǐng)人提交的注冊(cè)申報(bào)資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一 致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，則應(yīng)以規(guī)范格式對(duì)此內(nèi)容 進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)列明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。結(jié)合體外診斷試劑說(shuō)明書編寫指導(dǎo)原則的要求，下 面對(duì)腫瘤個(gè)體化用藥相關(guān)基因突變檢測(cè)試劑說(shuō)明書的重點(diǎn)內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，以指導(dǎo)注冊(cè)申報(bào)人員更合理地完成說(shuō)明 書編制。1. 【預(yù)期用途】應(yīng)至少包括以下幾部分內(nèi)容：(1) 臨床背景的介紹，包括相關(guān)適用人群特征、腫瘤 的組織類型、適用的樣本類型、待測(cè)靶基因序列的特征及選 擇依據(jù)，靶基因及其表達(dá)蛋白在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中 可能起到的作用，相關(guān)藥物及其作用機(jī)理，以及藥物與待

7、測(cè) 突變位點(diǎn)可能存在的關(guān)系等。如無(wú)合理的臨床驗(yàn)證，不建議 在此涉及具體藥物產(chǎn)品(商品)名稱、生產(chǎn)企業(yè)等信息；若 有相關(guān)臨床驗(yàn)證，可在此明確具體藥物，但需在說(shuō)明書中對(duì) 相關(guān)的臨床研究情況進(jìn)行簡(jiǎn)介。(2) 試劑盒用于特定腫瘤患者人群，通過(guò)檢測(cè)人體樣 本提取的核酸組分中是否存在靶基因突變，對(duì)臨床上特定腫 瘤患者的個(gè)體化用藥提供參考意見(jiàn)。腫瘤的類別及適用樣本 類型應(yīng)結(jié)合實(shí)際的臨床研究完成情況進(jìn)行確認(rèn)。(3) 明確說(shuō)明該試劑盒僅用于對(duì)特定腫瘤患者靶基 因序列的檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，不應(yīng)作為患者個(gè) 體化治療的唯一依據(jù)，臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情、藥物適應(yīng) 癥、治療反應(yīng)及其它實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)等因素對(duì)檢測(cè)結(jié)

8、果進(jìn)行 綜合判斷。2. 【檢驗(yàn)原理】（1）對(duì)試劑盒檢測(cè)能夠覆蓋的所有突變位點(diǎn)或突變類型進(jìn)行詳細(xì)描述（靶序列長(zhǎng)度、基因座位、突變類型及相關(guān)特征等），對(duì)引物及探針設(shè)計(jì)、不同樣品反應(yīng)管組合、對(duì)照品設(shè)置及熒光信號(hào)檢測(cè)原理等進(jìn)行逐項(xiàng)介紹。(2)核酸提取方法、原理等。(3)試劑盒技術(shù)原理的詳細(xì)介紹，建議結(jié)合適當(dāng)圖示進(jìn)行說(shuō)明。如反應(yīng)體系中添加了相關(guān)的防污染組分（如udg酶），也應(yīng)對(duì)其作用機(jī)理作適當(dāng)介紹。3. 【主要組成成份】(1)詳細(xì)說(shuō)明試劑盒內(nèi)各組分的名稱、數(shù)量、內(nèi)容物、比例或濃度、穩(wěn)定性等信息，陰性/陽(yáng)性對(duì)照品（或質(zhì)控品） 可能含有生物源性物質(zhì)的組分，應(yīng)說(shuō)明其生物學(xué)來(lái)源、活性 及其他特性；說(shuō)明不同批號(hào)試

9、劑盒中各組分是否可以互換。(2)試劑盒中不包含但對(duì)該項(xiàng)檢測(cè)必須的組分，企業(yè)應(yīng)列出相關(guān)試劑/耗材的名稱、注冊(cè)證號(hào)（如有）及其他必 要的信息。（3）如果試劑盒中不包含用于核酸分離/純化的試劑 組分，則應(yīng)在此注明經(jīng)驗(yàn)證后推薦配合使用的商品化核酸分 離/純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱以及該產(chǎn)品的醫(yī)療器 械注冊(cè)證號(hào)等詳細(xì)信息。4. 【儲(chǔ)存條件及有效期】試劑盒的效期（實(shí)時(shí)）穩(wěn)定性、開(kāi)瓶穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定 性、運(yùn)輸穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求等。5. 【適用儀器】所有適用的儀器型號(hào)，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以 指導(dǎo)用戶操作。6. 【樣本要求】重點(diǎn)明確以下內(nèi)容：（1）對(duì)適用的樣本類型作詳細(xì)介紹，包括樣本來(lái)源及 取材要

10、求、樣本處理方式（如組織樣本的固定及包埋方式）、 腫瘤細(xì)胞比例等。樣本的取材及處理方式等若有通用的技術(shù)規(guī)范或指南, 則應(yīng)遵循，并在此處引用。（2 ）樣本處理及保存：核酸提取前樣本的預(yù)處理、保 存條件及期限（短期、長(zhǎng)期）、運(yùn)輸條件等。（3）在提取過(guò)程結(jié)束后，立即采用適當(dāng)方法（如分光 光度計(jì)法）對(duì)提取后的核酸儲(chǔ)備液進(jìn)行濃度確定，并依據(jù)性 能驗(yàn)證結(jié)果在此給出用于擴(kuò)增試驗(yàn)的核酸濃度要求。舉例： 擴(kuò)增反應(yīng)終體系中需要50ng的dna量，而在終體系中需加 入25 n 1的dna儲(chǔ)備液，則在dna提取完成后應(yīng)將dna儲(chǔ)備 液的濃度調(diào)整至2ng/ in 1的濃度。注：基于試劑盒分析靈敏度的考慮，應(yīng)對(duì)提取后的核

11、酸 儲(chǔ)備液的核酸濃度設(shè)定低限要求，如提取后的核酸儲(chǔ)備液濃 度低于其低限要求，應(yīng)擴(kuò)大樣本量重新進(jìn)行核酸的提取。(4 )操作過(guò)程中各種制備液的穩(wěn)定性要求，如各類混 合液(mix)、dna/rna儲(chǔ)備液、反應(yīng)終體系等(常溫/冷藏/ 冷凍/凍融次數(shù)限制等)。7. 【檢驗(yàn)方法】詳細(xì)說(shuō)明實(shí)驗(yàn)操作的各個(gè)步驟，旬括：(1 )實(shí)驗(yàn)條件：實(shí)驗(yàn)室分區(qū)、實(shí)驗(yàn)環(huán)境的溫度、濕度、 空調(diào)氣流方向控制等注意事項(xiàng)。(2) 試劑配制方法、注意事項(xiàng)。(3) 詳述核酸提取的條件、步驟及注意事項(xiàng)。對(duì)照品 (質(zhì)控品)應(yīng)參與樣本核酸的平行提取，以對(duì)核酸提取環(huán)節(jié)進(jìn)行合理的質(zhì)量控制。(4) 擴(kuò)增反應(yīng)前準(zhǔn)備：各組分加樣體積、順序、相關(guān) 注意事項(xiàng)

12、等。(5) 逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程(如涉及)的溫度和時(shí)間設(shè)置、pcr 各階段的溫度、時(shí)間設(shè)置、循環(huán)數(shù)設(shè)置及相關(guān)注意事項(xiàng)。(6) 儀器設(shè)置：特殊參數(shù)，待測(cè)基因、內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)的 熒光通道選擇等。8. 【參考值(參考范圍)】參考值(參考范圍)的描述包括基線的確定方法和循環(huán) 閾值(ct值)的要求。除ct值要求外，建議結(jié)合是否出現(xiàn) 典型s形曲線對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷。9. 【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】結(jié)合陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照以及樣本管中靶基因和內(nèi)標(biāo)的 檢測(cè)結(jié)果(ct值)，對(duì)所有可能出現(xiàn)的結(jié)果組合及相應(yīng)的解 釋進(jìn)行詳述。如存在檢測(cè)灰區(qū)，應(yīng)對(duì)灰區(qū)結(jié)果的處理方式一 并詳述。10. 【檢驗(yàn)方法的局限性】(1) 本試劑盒的檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，對(duì)

13、患者個(gè)性 化治療的選擇應(yīng)結(jié)合其癥狀/體征、病史、其他實(shí)驗(yàn)室檢查 及治療反應(yīng)等情況綜合考慮。(2) 陰性結(jié)果不能完全排除靶基因突變的存在，樣本 中腫瘤細(xì)胞過(guò)少、過(guò)度降解或擴(kuò)增反應(yīng)體系中靶基因濃度低 于檢測(cè)限亦可造成陰性結(jié)果。(3) 不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)及處理、以及不當(dāng)?shù)脑?驗(yàn)操作和實(shí)驗(yàn)環(huán)境均有可能導(dǎo)致假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。(4) 明確該檢測(cè)僅限于規(guī)定的樣本類型及檢測(cè)系統(tǒng) (包括適用機(jī)型、核酸提取試劑、檢測(cè)方法等)。11. 【產(chǎn)品性能指標(biāo)】詳述以下性能指標(biāo)：(1) 對(duì)相應(yīng)國(guó)家參考品(如有)檢測(cè)的符合情況。(2) 最低檢測(cè)限(分析靈敏度)：試劑盒能夠覆蓋的 所有突變靶序列的最低檢出濃度，重點(diǎn)考慮原始

14、模板中突變 基因的百分率和擴(kuò)增終體系中核酸濃度兩個(gè)因素對(duì)分析靈 敏度的影響。簡(jiǎn)單介紹最低檢測(cè)限的確定方法以及對(duì)最低檢 測(cè)限驗(yàn)證所采用的靶序列的信息。(3) 企業(yè)內(nèi)部陽(yáng)性/陰性參考品符合率，陽(yáng)性/陰性參 考品的組成、來(lái)源、濃度梯度設(shè)置以及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)等信息。(4) 精密度：精密度參考品的組成、來(lái)源、濃度梯度 要求及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。(5 )分析特異性%1 野生型驗(yàn)證：應(yīng)采用不同濃度的野生型核酸樣本進(jìn)行 驗(yàn)證，其結(jié)果應(yīng)均為陰性。%1 試劑盒內(nèi)交叉反應(yīng)：如考核試劑包括對(duì)多個(gè)突變位點(diǎn) 的檢測(cè)，則應(yīng)對(duì)該試劑盒覆蓋范圍內(nèi)的所有突變類型間進(jìn)行 交叉反應(yīng)驗(yàn)證。%1 序列相近或具有一定同源性的其他較常見(jiàn)突變或野生型基序列間

15、的交叉反應(yīng)驗(yàn)證。%1 潛在干擾物質(zhì)驗(yàn)證。如果經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)某些序列與靶序列的交叉反應(yīng)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，則應(yīng)該對(duì)存在交叉反應(yīng)的核酸序列及濃度進(jìn)行驗(yàn)證 并在產(chǎn)品說(shuō)明書中表明這種假陽(yáng)性發(fā)生的可能，做出相關(guān)的 提示。（6）對(duì)比試驗(yàn)研究（如有）：簡(jiǎn)要介紹參比試劑（方 法）的信息、所采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。12. 【注意事項(xiàng)】應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：（1）如該產(chǎn)品含有人源或動(dòng)物源性物質(zhì)，應(yīng)給出具有 潛在感染性的警告。（2 ）臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增 管理辦法（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)2010194號(hào)）等有關(guān)分子生物 學(xué)實(shí)驗(yàn)室、臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范執(zhí)行。（三）擬定產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)及編制說(shuō)明擬定產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符合體

16、外診斷試劑注冊(cè)管理辦法（試 行）和體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料基本要求的相關(guān)規(guī) 定。另外，對(duì)于國(guó)產(chǎn)試劑，應(yīng)參考中國(guó)生物制品規(guī)程（ 2000 年版），將申報(bào)產(chǎn)品的主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品檢定 等內(nèi)容作為附錄附于標(biāo)準(zhǔn)正文后，并在正文的“產(chǎn)品分類” 項(xiàng)中引出該附錄內(nèi)容。附錄中應(yīng)將待測(cè)靶基因的基因位點(diǎn)、 引物/探針設(shè)計(jì)及來(lái)源、參考品設(shè)置、來(lái)源及驗(yàn)證情況、各 種酶的來(lái)源、特性及驗(yàn)證等重點(diǎn)內(nèi)容予以明確。腫瘤個(gè)體化用藥相關(guān)基因突變檢測(cè)試劑的注冊(cè)檢測(cè)應(yīng) 主要包括以下性能指標(biāo)：物理性狀、試劑盒內(nèi)陰/陽(yáng)性對(duì)照 品（質(zhì)控品）的ct值要求（包括內(nèi)標(biāo)）、陰/陽(yáng)性參考品符合率、精密度、最低檢測(cè)限（分析靈敏度）等。陽(yáng)性參考

17、品 主要考察對(duì)試劑盒覆蓋范圍內(nèi)不同突變基因的檢測(cè)符合性, 陰性參考品則重點(diǎn)對(duì)申報(bào)試劑的分析特異性進(jìn)行驗(yàn)證。如果申報(bào)試劑已有相應(yīng)的國(guó)家/行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布，則企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求不得低于國(guó)家/行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求。（四）注冊(cè)檢測(cè)根據(jù)體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法（試行）的要求, 首次申請(qǐng)注冊(cè)的第三類產(chǎn)品應(yīng)該在國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理 局認(rèn)可的、具有相應(yīng)承檢范圍的醫(yī)療器械檢測(cè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行連續(xù) 3個(gè)生產(chǎn)批次樣品的注冊(cè)檢測(cè)。對(duì)于已經(jīng)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的檢 測(cè)項(xiàng)目，在注冊(cè)檢測(cè)時(shí)應(yīng)采用相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行，對(duì)于 目前尚無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的項(xiàng)目，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)建立自己的參考品 體系并提供相應(yīng)的內(nèi)部參考品。（五）主要原材料研究資料應(yīng)提供主要原材料如引物、探

18、針、企業(yè)參考品的選擇與 來(lái)源、制備過(guò)程、質(zhì)量分析和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究資料。若 主要原材料為企業(yè)自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須相對(duì)穩(wěn)定，并 提交工藝驗(yàn)證報(bào)告；如主要原材料購(gòu)自其他供貨商，應(yīng)提供 的資料包括：對(duì)物料供應(yīng)商審核的相關(guān)資料、供貨方提供的 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢定報(bào)告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗(yàn) 資料。1. 核酸分離/純化組分（如有）的主要組成、原理介紹 及相關(guān)的驗(yàn)證資料。2. pcr和/或rt-pcr組分的主要原料（包括引物、探針.各種酶及其他主要原料）的選擇、制備、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及實(shí) 驗(yàn)研究資料，主要包括以下內(nèi)容：（1）脫氧三磷酸核 （dntp ）核酸的組成成分，包括：datp、dutp、dgtp、

19、dctp和 dttp,對(duì)純度、濃度、保存穩(wěn)定性等的驗(yàn)證資料。（2）引物由一定數(shù)量的dntp構(gòu)成的特定序列，通常采用dna合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（page）或其 他適宜方法純化。需提供對(duì)分子量、純度、穩(wěn)定性、功能性 實(shí)驗(yàn)等的驗(yàn)證資料。如為外購(gòu)，應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成 產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如page電泳結(jié)果或高效液相色譜法（hplc ）分析圖譜。（3）探針特定的帶有示蹤物（標(biāo)記物）的已知核酸片段（寡聚核 昔酸片段），能與互補(bǔ)核酸序列退火雜交，用于特定核酸序 列的探測(cè)。合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（page）或其他適 宜方法純化，在5-端（和/或3-端）進(jìn)行標(biāo)記，并經(jīng)hplc或 其他

20、適宜方法純化，純度應(yīng)達(dá)到hplc純。應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu) 出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如hplc分析圖譜，應(yīng)對(duì)探針 的分子量及標(biāo)記的熒光素進(jìn)行核實(shí)，并進(jìn)行功能性試驗(yàn)驗(yàn)證。(4) 酶dna聚合酶，應(yīng)具有dna聚合酶活性，無(wú)核酸內(nèi)切酶活 性，具熱穩(wěn)定性，女口： 94c保溫1小時(shí)后仍保持50%活性； 尿嚅唳糖基化酶(ung),具有尿囉唳糖基化活性，無(wú)核酸 外切酶及核酸內(nèi)切酶活性，應(yīng)對(duì)酶活性有合理驗(yàn)證；逆轉(zhuǎn)錄 酶，具逆轉(zhuǎn)錄酶活性，無(wú)核酸內(nèi)切酶活性。3. 核酸類檢測(cè)試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無(wú)dnase和 rnase污染。4. 企業(yè)內(nèi)部參考品：應(yīng)詳細(xì)說(shuō)明有關(guān)企業(yè)內(nèi)部參考品 的原料選擇、制備、定值過(guò)程等試驗(yàn)資料。具體

21、要求如下：(1)陽(yáng)性參考品試劑盒(分型或不分型)所能覆蓋的所有突變位點(diǎn)均應(yīng) 設(shè)置相應(yīng)的陽(yáng)性參考品，每個(gè)突變位點(diǎn)設(shè)置至少三個(gè)突變百 分率梯度，其中需包括至少一份弱陽(yáng)性參考品。陽(yáng)性參考品 的突變形式及濃度需經(jīng)過(guò)金標(biāo)準(zhǔn)方法或已上市同類分型試 劑的確認(rèn)。如申報(bào)試劑用于dna樣本的檢測(cè)，則陽(yáng)性參考品可以采 用臨床樣本提取的dna儲(chǔ)備液或相應(yīng)質(zhì)粒作為原料。如申報(bào) 試劑用于rna樣本的檢測(cè)，陽(yáng)性參考品可以采用臨床樣本提 取的rna儲(chǔ)備液、相應(yīng)rna凍干粉或假病毒的形式；如覆蓋 突變位點(diǎn)過(guò)多，可以對(duì)其中部分突變位點(diǎn)采用質(zhì)粒的形式, 但不能全部采用質(zhì)粒，需包括部分突變類型（申請(qǐng)人自行確 定其代表性）rna為模板

22、的陽(yáng)性參考品以對(duì)逆轉(zhuǎn)錄（rt）過(guò) 程進(jìn)行監(jiān)控。（2）陰性參考品可采用源于健康人、經(jīng)確認(rèn)無(wú)相應(yīng)靶突變序列的野生型dna儲(chǔ)存液。（3）靈敏度參考品（檢測(cè)限參考品）靈敏度參考品的原料要求參考陽(yáng)性參考品，需包括所有 的突變類型，可以僅設(shè)置分析靈敏度水平的一個(gè)濃度即可。（4）精密度參考品精密度參考品原料要求參考陽(yáng)性參考品，需包括陰性、 弱陽(yáng)性、中或強(qiáng)陽(yáng)性三個(gè)濃度水平的精密度驗(yàn)證，陰性和中 /強(qiáng)陽(yáng)性精密度參考品可不必包括所有突變類型，以常見(jiàn)突 變類型（申請(qǐng)人自行確定其代表性）為主，但弱陽(yáng)性參考品 需包括所有突變位點(diǎn)。5. 試劑盒內(nèi)對(duì)照品（質(zhì)控品）試劑盒的質(zhì)控體系通過(guò)設(shè)置各種試劑盒對(duì)照品來(lái)實(shí)現(xiàn), 質(zhì)控體系需

23、考慮對(duì)樣本核酸提取、配液及加樣、試劑及儀器 性能、擴(kuò)增反應(yīng)抑制物（管內(nèi)抑制）、交叉污染、靶核酸降 解等因素可能造成的假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行合理的質(zhì)量 控制。所有陽(yáng)性對(duì)照品的核酸性質(zhì)應(yīng)與待測(cè)樣本的靶核酸性 質(zhì)一致，如同為dna或rna。申報(bào)資料應(yīng)對(duì)試劑盒對(duì)照品有 關(guān)原料選擇、制備、定值過(guò)程等試驗(yàn)資料詳細(xì)說(shuō)明。申請(qǐng)人 應(yīng)視申報(bào)產(chǎn)品具體情況設(shè)置合理的試劑盒對(duì)照品（質(zhì)控品）， 試劑盒質(zhì)控體系主要考慮以下幾方面要求。（1）陽(yáng)性對(duì)照品（質(zhì)控品）建議對(duì)每個(gè)樣品反應(yīng)管設(shè)置至少一份陽(yáng)性對(duì)照品（質(zhì)控 品），陽(yáng)性對(duì)照品應(yīng)參與樣本核酸的平行提取，以對(duì)樣本提 取、試劑及儀器性能、擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程等環(huán)節(jié)進(jìn)行質(zhì)量控制， 企業(yè)應(yīng)

24、對(duì)各種陽(yáng)性對(duì)照（質(zhì)控）品的ct值做出明確的范圍 要求。如樣本反應(yīng)管內(nèi)可以覆蓋多種突變序列的檢測(cè)（分型 或不分型），相應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照管可以不必涉及所有突變類型, 但應(yīng)選擇較常見(jiàn)突變序列或理論上較難測(cè)得的突變序列作 為陽(yáng)性對(duì)照。（2）內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）可以對(duì)管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行 質(zhì)量控制，尤其是靶核酸為rna、用于基因重排或基因表達(dá) 異常等檢測(cè)目的時(shí)，可以采用管家基因或與靶基因濃度水平 相當(dāng)?shù)钠渌蛐蛄凶鳛橄鄳?yīng)的內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）。申請(qǐng)人應(yīng) 對(duì)內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）的引物、探針和模板濃度做精確驗(yàn)證，既 要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽(yáng)性曲線又要盡量降低對(duì)靶 基因檢測(cè)造成的抑制而導(dǎo)致假陰性。(3)

25、 陰性對(duì)照陰性對(duì)照對(duì)可能存在的交叉污染進(jìn)行假陽(yáng)性結(jié)果的質(zhì) 控。(%1) 主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料應(yīng)能對(duì)反應(yīng)體系涉及 到的基本內(nèi)容，如臨床樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件、質(zhì) 控體系設(shè)置、ct (臨界)值確定等，提供確切的依據(jù)，配制 工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求，原材料應(yīng)混合均 勻，配制過(guò)程應(yīng)對(duì)ph、電導(dǎo)率等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行有效控制。主 要包括以下內(nèi)容：1. 主要生產(chǎn)工藝介紹，可以圖表方式表示。2. 反應(yīng)原理介紹。3. 基因位點(diǎn)選擇、(rt)-pcr方法學(xué)特性介紹。4. 確定最佳(rt)-pcr反應(yīng)體系的研究資料，包括酶濃 度、引物/探針濃度、dntp濃度、陽(yáng)

26、離子濃度等。5. 確定逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程(如涉及)的溫度和時(shí)間的研究資 料，pcr反應(yīng)各階段溫度、時(shí)間及循環(huán)數(shù)的研究資料。6. 對(duì)于基線閾值(threshold)和閾值循環(huán)數(shù)(ct)確 定的研究資料。7. 不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述。8. 如申報(bào)產(chǎn)品包含核酸提取試劑，應(yīng)提交對(duì)核酸提取 過(guò)程進(jìn)行工藝優(yōu)化的研究資料。（七）分析性能評(píng)估資料企業(yè)應(yīng)提交在產(chǎn)品研制階段對(duì)試劑盒進(jìn)行的所有性能 驗(yàn)證的研究資料，包括具體研究方法、內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、 統(tǒng)計(jì)分析等詳細(xì)資料。建議著重對(duì)以下分析性能進(jìn)行研究。 如有相應(yīng)的國(guó)家參考品，應(yīng)在分析性能評(píng)估階段采用國(guó)家參 考品對(duì)產(chǎn)品性能進(jìn)行驗(yàn)證。1. 樣本核酸提取樣

27、本核酸的提取主要有以下目的：富集靶核酸濃度、保 證靶核酸序列的完整性、增加pcr模板溶液均一性、去除pcr 抑制物，樣本核酸提取是決定后續(xù)核酸擴(kuò)增過(guò)程成敗的要素 之一。尤其是石蠟包埋組織樣本在福爾馬林固定過(guò)程中，會(huì) 使樣品中的核酸與核酸之間，核酸與蛋白之間發(fā)生交聯(lián)，并 且樣本在不當(dāng)?shù)谋４鏃l件下容易造成核酸的片段化或降解, 增加了核酸提取的難度。因此，無(wú)論申報(bào)產(chǎn)品是否含有核酸 分離/純化的組分，企業(yè)都應(yīng)對(duì)核酸提取的環(huán)節(jié)做充分的驗(yàn) 證。除最大量分離出目的核酸外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化步驟, 盡可能去除pcr抑制物。常見(jiàn)的核酸分離純化均有其優(yōu)勢(shì)和 不足，申請(qǐng)人應(yīng)結(jié)合申報(bào)產(chǎn)品的特性，合理選擇核酸分離/ 純化

28、試劑，并提供詳細(xì)的驗(yàn)證資料。2. 陽(yáng)性/陰性參考品符合率各水平、各突變位點(diǎn)的陽(yáng)性參考品均應(yīng)按要求檢出陽(yáng)性, 考慮到濃度梯度的不同，應(yīng)對(duì)各水平陽(yáng)性參考品設(shè)置相應(yīng)ct 值的限制；陰性參考品在各個(gè)引物探針組合的檢測(cè)條件下均 應(yīng)檢出為陰性；如有野生型參考品的設(shè)置，在其相應(yīng)的引物 探針組合下檢測(cè)應(yīng)為陽(yáng)性。3. 最低檢測(cè)限（分析靈敏度）建議采用95%（n>20）的陽(yáng)性檢出率作為最低檢測(cè)限確定的標(biāo)準(zhǔn)，擴(kuò)增反應(yīng)終體系中的突變序列百分率和總核酸濃度兩個(gè)素對(duì)分析靈敏度的影響較大，終體系中突變序列的百分率越高、所含的dna （ rna ）量越多，則越容易檢出。因 此，試劑盒最低檢測(cè)限主要考慮以下兩種情形。（1

29、）在擴(kuò)增反應(yīng)終體系特定核酸濃度下，突變序列所占百分率的最低檢測(cè)限。采用野生型臨床樣本和較高突變百分率的臨床樣本提取的核酸儲(chǔ)備液進(jìn)行混合，確定擴(kuò)增反應(yīng)終體系中的核酸濃 度，采用合理的試驗(yàn)方法（如深測(cè)序）對(duì)混合后樣本中突變序列所占百分率進(jìn)行確認(rèn)，并逐漸調(diào)整野生型和突變型核酸 儲(chǔ)備液的比例以得到含不同突變序列百分率的混合液，對(duì)各 份混合液進(jìn)行不少于20次的重復(fù)檢測(cè)，確定95%陽(yáng)性檢出率水平，作為在固定的核酸濃度條件下，可以檢測(cè)到的最低的 突變序列百分率。舉例：在50ng/40ul水平,可以達(dá)到95%陽(yáng)性檢出率的 最低突變序列百分率為10%。(2) 在特定突變序列百分率下，反應(yīng)終體系中核酸濃 度的最低

30、檢測(cè)限。采用合理的實(shí)驗(yàn)方法確定待測(cè)樣本中的突變序列所占 的百分率(如固定在10%的水平)，再逐級(jí)稀釋成不同核酸 濃度樣本，分別對(duì)各梯度濃度樣本進(jìn)行不少于20次的重復(fù) 檢測(cè)，確定95%陽(yáng)性檢出率的最低dna ( rna )濃度。舉例：在10%的突變序列百分率水平，40ul擴(kuò)增反應(yīng)終 體系中，dna濃度的最低檢測(cè)限為50ng/40ulo(3) 評(píng)價(jià)腫瘤組織含量、dna(rna)降解等因素對(duì)分 析靈敏度可能造成的影響。4. 分析特異性(1) 野生型驗(yàn)證：釆用不同濃度的野生型核酸樣本進(jìn) 行驗(yàn)證，結(jié)果應(yīng)為陰性。(2) 交叉反應(yīng)，對(duì)于此類產(chǎn)品的交叉反應(yīng)驗(yàn)證主要考 慮以下幾方面情形：%1 申報(bào)試劑所覆蓋的全

31、部突變類型間的交叉反應(yīng)；%1 核酸序列具有同源性、易引起交叉反應(yīng)的野生型或其 它突變類型間的交叉反應(yīng)。申請(qǐng)人應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的突變或野生型 序列、序列確認(rèn)和濃度選擇等試驗(yàn)資料。有關(guān)交叉反應(yīng)驗(yàn)證 的信息應(yīng)以列表的方式在產(chǎn)品說(shuō)明書的【產(chǎn)品性能指標(biāo)】項(xiàng) 中有所體現(xiàn)。（3）干擾物質(zhì)%1 申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)試劑盒所采用的樣本類型，確定潛在的 干擾物質(zhì)。%1 用于干擾試驗(yàn)的樣本，靶基因濃度應(yīng)至少包含弱陽(yáng)性, 而不應(yīng)僅選擇強(qiáng)陽(yáng)性樣本，使用醫(yī)學(xué)相關(guān)水平的干擾物質(zhì)進(jìn) 行驗(yàn)證。此外，建議申請(qǐng)人同時(shí)在每種干擾物質(zhì)的潛在最大 濃度（“最差條件”）條件下同樣進(jìn)行評(píng)價(jià)。有關(guān)干擾物質(zhì)的研究結(jié)果亦應(yīng)總結(jié)于產(chǎn)品說(shuō)明書的【產(chǎn)

32、 品性能指標(biāo)】項(xiàng)下。5. 精密度測(cè)量精密度的評(píng)價(jià)方法并無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)可依，可根據(jù)不 同產(chǎn)品特征或企業(yè)的研究習(xí)慣進(jìn)行，前提是必須保證研究的 科學(xué)合理性。具體實(shí)驗(yàn)方法可以參考國(guó)際或國(guó)內(nèi)有關(guān)體外診 斷產(chǎn)品性能評(píng)估的文件進(jìn)行。企業(yè)應(yīng)對(duì)每項(xiàng)精密度指標(biāo)的評(píng) 價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)的范圍等。針對(duì) 本類產(chǎn)品的精密度評(píng)價(jià)主要旬括以下要求。（1）對(duì)可能影響檢測(cè)精密度的主要變量進(jìn)行驗(yàn)證，除 申報(bào)試劑（包括提取組分）本身的影響外，還應(yīng)對(duì)pcr分析 儀、操作者、地點(diǎn)等要素進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證。(2) 合理的精密度評(píng)價(jià)周期，例如：為期至少20天 的連續(xù)檢測(cè)，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測(cè)， 從而對(duì)批內(nèi)/批

33、間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度 進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。如有條件，申請(qǐng)人應(yīng)選擇不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行 重復(fù)實(shí)驗(yàn)以對(duì)室間精密度進(jìn)行評(píng)價(jià)。(3) 用于精密度評(píng)價(jià)的質(zhì)控品應(yīng)至少包括3個(gè)水平：%1 陰性參考品：待測(cè)靶核酸濃度低于最低檢測(cè)限或?yàn)榱?濃度，建議選用背景值較高的陰性樣本，陰性符合率應(yīng)為100%(n>20)。%1 弱陽(yáng)性參考品：待測(cè)靶核酸濃度略高于試劑盒的最低 檢測(cè)限，陽(yáng)性檢出率應(yīng)達(dá)到100% (n>20)。注：弱陽(yáng)性參 考品需包括所有的突變位點(diǎn)，如果待測(cè)物靶核酸為rna,則 弱陽(yáng)性精密度參考品中應(yīng)至少部分典型突變位點(diǎn)的原料為 rna,如rna干粉或相應(yīng)的假病毒。%1 高濃度參考品：待測(cè)

34、靶核酸呈中到強(qiáng)陽(yáng)性的濃度，陽(yáng) 性檢出率為100%且cv<15% (n>20) o注：如果試劑盒可 以覆蓋多個(gè)突變位點(diǎn)的檢測(cè)，該參考品可以設(shè)置為對(duì)全部突 變位點(diǎn)進(jìn)行精密度驗(yàn)證，也可以選擇其中部分突變位點(diǎn)進(jìn)行 驗(yàn)證，但應(yīng)至少包含常見(jiàn)突變序列或理論上較難測(cè)得的突變 序列。6. 其他需注意問(wèn)題對(duì)于適用多個(gè)機(jī)型的產(chǎn)品，應(yīng)提供如產(chǎn)品說(shuō)明書【適用 機(jī)型】項(xiàng)中所列的所有型號(hào)儀器的性能評(píng)估資料。若試劑盒 適用的樣本類型不止一種，如既包含石蠟包埋組織切片亦包 含冷凍組織切片或血液樣本等，則需對(duì)所有樣本類型的適用 性進(jìn)行評(píng)估，并提交評(píng)估資料。（a）參考值（參考范圍）確定資料對(duì)于此類試劑，參考值確定資料主

35、要是指ct值的確認(rèn)資料，建議申請(qǐng)人采用受試者工作特征（roc）曲線的方式 對(duì)申報(bào)產(chǎn)品用于結(jié)果判斷的臨界值予以確認(rèn)。（九）穩(wěn)定性研究資料穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報(bào)試劑的穩(wěn)定 性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括實(shí)時(shí)穩(wěn)定性（有 效期）、開(kāi)瓶穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性及凍融次數(shù) 限制等研究，申請(qǐng)人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究 方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的 實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對(duì)于實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究, 應(yīng)提供至少三批樣品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期 后的研究資料。另外，樣本穩(wěn)定性的研究對(duì)于實(shí)驗(yàn)的成敗也至關(guān)重要。 特別是當(dāng)使用標(biāo)本類型包括組織

36、標(biāo)本時(shí)，腫瘤組織標(biāo)本經(jīng)過(guò)特殊處理后其核酸序列的完整性容易遭到破壞，因此應(yīng)提供 對(duì)樣本保存條件、保存時(shí)間等方面的詳細(xì)研究資料。樣本穩(wěn) 定性研究主要包括核酸提取前樣本穩(wěn)定性和提取后核酸在 儲(chǔ)備液中的穩(wěn)定性兩方面。在合理的溫度范圍內(nèi)選擇多個(gè)溫 度點(diǎn)（應(yīng)至少包括范圍的上限和下限溫度），每間隔一定的 時(shí)間段即對(duì)儲(chǔ)存樣本進(jìn)行全性能的分析驗(yàn)證，從而確認(rèn)不同 類型樣本的穩(wěn)定性。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對(duì)凍融次數(shù)進(jìn) 行評(píng)價(jià)。試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內(nèi)容的研究結(jié)果均應(yīng)在說(shuō)明書【儲(chǔ)存條件及有效期】和【樣本要求】?jī)身?xiàng)中進(jìn)行 詳細(xì)說(shuō)明。（十）臨床試驗(yàn)研究對(duì)于國(guó)內(nèi)外尚無(wú)同類產(chǎn)品被批準(zhǔn)上市的新的腫瘤相關(guān) 基因突變，相關(guān)檢

37、測(cè)試劑進(jìn)行臨床研究時(shí)，申請(qǐng)人應(yīng)將試劑 盒臨床研究納入相關(guān)藥物的臨床研究或臨床應(yīng)用中，通過(guò)對(duì) 特定的腫瘤病人進(jìn)行治療前后的跟蹤隨訪，以臨床對(duì)于患者 個(gè)體化治療方案及有效性的綜合判斷為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)此類試 劑用于指導(dǎo)腫瘤個(gè)體化用藥的臨床性能。研究者應(yīng)明確研究 對(duì)象的入選標(biāo)準(zhǔn)、隨訪標(biāo)準(zhǔn)和隨訪時(shí)間。有關(guān)此類臨床研究 的方案設(shè)計(jì)和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)等應(yīng)符合體外診斷試劑及藥物臨床 研究相關(guān)法規(guī)要求。對(duì)于已有同類產(chǎn)品上市的、基因突變與腫瘤個(gè)體化用藥 方案的相關(guān)性已經(jīng)得到確認(rèn)的產(chǎn)品，則申請(qǐng)人既可采用試劑 盒檢測(cè)與相關(guān)藥物治療相結(jié)合對(duì)特定的腫瘤病人進(jìn)行治療 前后的跟蹤臨床研究的方法，亦可在充分結(jié)合相關(guān)的病例信 息的情況下，

38、采用考核試劑與參比方法進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)的研究 方法，對(duì)考核試劑的臨床應(yīng)用有效性進(jìn)行評(píng)價(jià)。以下要求均 針對(duì)采用對(duì)比試驗(yàn)方法的臨床研究提出。1. 參比方法的選擇可以考慮以下幾方面：(1)如已有同類產(chǎn)品上市，其臨床研究可以選擇境內(nèi) 已批準(zhǔn)上市、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品作為參比試 劑，采用擬申報(bào)產(chǎn)品(以下稱考核試劑)與之進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn) 研究，證明本品與已上市產(chǎn)品等效或優(yōu)于已上市產(chǎn)品。但應(yīng) 充分考慮已上市同類試劑的突變位點(diǎn)選擇、靶序列選擇、分 析靈敏度等特性，確?？己嗽噭┡c申報(bào)試劑具有明確可比性。(2 )申請(qǐng)人亦可采用核酸序列測(cè)定方法作為此類試 劑臨床試驗(yàn)研究的參比方法，驗(yàn)證考核試劑檢測(cè)結(jié)果與核酸 序列

39、測(cè)定結(jié)果之間的一致性情況。臨床研究報(bào)告中應(yīng)對(duì)選用 的測(cè)序方法做詳細(xì)介紹，包括測(cè)序儀型號(hào)、相關(guān)引物設(shè)計(jì)、 性能驗(yàn)證和測(cè)序方法的質(zhì)量控制等資料，以及提供測(cè)序服務(wù) 的機(jī)構(gòu)介紹和選擇依據(jù)等。(3)此外，在充分考慮檢測(cè)結(jié)果具有明確可比性的前 提下，也可以選擇熒光原位雜交(fish)或免疫組化等染色 體或蛋白水平的檢測(cè)技術(shù)作為參比方法，但考慮到檢測(cè)結(jié)果 之間不具有直接的可比性，建議對(duì)所有陽(yáng)性病例采用其他分 子生物學(xué)技術(shù)（如核酸序列測(cè)定）對(duì)結(jié)果予以確認(rèn)。2. 臨床研究單位的選擇建議申請(qǐng)人在選擇臨床單位時(shí)，應(yīng)在國(guó)內(nèi)不同區(qū)域選擇 臨床單位，盡量使各單位的臨床樣本有一定的區(qū)域代表性; 臨床研究單位應(yīng)具有分子病理診

40、斷和分子生物學(xué)方法檢測(cè) 的優(yōu)勢(shì)，實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)有足夠的時(shí)間熟悉檢測(cè)系統(tǒng)的各環(huán) 節(jié)（儀器、試劑、質(zhì)控及操作程序等），熟悉評(píng)價(jià)方案。在 整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，考核試劑和參比方法都應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制 下，最大限度保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。3. 臨床試驗(yàn)方案臨床試驗(yàn)實(shí)施前，研究人員應(yīng)從流行病學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、臨 床醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)等多方面考慮，設(shè)計(jì)科學(xué)合理的臨床研究 方案。各臨床研究機(jī)構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整 個(gè)臨床試驗(yàn)過(guò)程中遵循預(yù)定的方案實(shí)施，不可隨意改動(dòng)。整 個(gè)試驗(yàn)過(guò)程應(yīng)在臨床研究機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)并由本實(shí)驗(yàn)室的 技術(shù)人員操作完成，申報(bào)單位的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù) 指導(dǎo)外，不得隨意干涉實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，尤其

41、是數(shù)據(jù)收集過(guò)程。試驗(yàn)方案中應(yīng)確定嚴(yán)格的病例納入/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已 經(jīng)入選的病例再被排除出臨床研究都應(yīng)記錄在案并明確說(shuō) 明原因。在試驗(yàn)操作過(guò)程中和判定試驗(yàn)結(jié)果時(shí)應(yīng)采用盲法以 保證試驗(yàn)結(jié)果的客觀性。各研究單位選用的參比試劑應(yīng)完全 一致，以便進(jìn)行合理的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。臨床方案中還應(yīng)明確確 證試劑及方法。另外，考核試劑適用的樣本類型、可檢測(cè)的 基因突變類型不應(yīng)超越參比試劑的相應(yīng)檢測(cè)要求，若此種情 況發(fā)生，則應(yīng)選擇其他合理方法對(duì)額外的樣本類型和基因突 變類型進(jìn)行驗(yàn)證。4. 病例選擇及陽(yáng)性病例比例臨床試驗(yàn)應(yīng)以腫瘤患者為研究對(duì)象，其中試劑盒規(guī)定范 圍的每種突變類型均應(yīng)有一定量的陽(yáng)性病例。對(duì)于陰性病例 的選擇，也

42、應(yīng)考慮到交叉反應(yīng)的需要，以從臨床角度考察其 分析特異性。陰/陽(yáng)性病例均應(yīng)覆蓋所有適用的腫瘤類型。 若產(chǎn)品適用于多種樣本類型，則應(yīng)對(duì)所有樣本類型均進(jìn)行臨 床驗(yàn)證。5. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對(duì)臨床試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法，如檢測(cè) 結(jié)果一致性分析、受試者工作特征（roc）曲線分析、陰性/ 陽(yáng)性符合率等。對(duì)于本類產(chǎn)品對(duì)比實(shí)驗(yàn)的等效性研究，常選 擇交叉四格表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測(cè)結(jié)果，對(duì)定性 結(jié)果進(jìn)行四格表/檢驗(yàn)或kappa檢驗(yàn)以驗(yàn)證兩種試劑定性結(jié) 果的一致性，統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)可以證明兩種方法的檢測(cè)結(jié)果有無(wú) 明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在臨床研究方案中應(yīng)明確統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)假設(shè), 即評(píng)價(jià)考核試劑與參比試劑是否等效的標(biāo)準(zhǔn)。6

43、. 結(jié)果差異樣本的驗(yàn)證在數(shù)據(jù)收集過(guò)程中，對(duì)于兩種方法檢測(cè)結(jié)果不一致的樣 本，應(yīng)采用“金標(biāo)準(zhǔn)”方法或臨床上普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的第 三種同類試劑進(jìn)行復(fù)核，同時(shí)結(jié)合患者的臨床病情對(duì)差異原 因及可能結(jié)果進(jìn)行分析。7. 臨床試驗(yàn)總結(jié)報(bào)告撰寫根據(jù)體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則的要求, 臨床試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)該對(duì)試驗(yàn)的整體設(shè)計(jì)及各個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)給予清 晰、完整的闡述，應(yīng)該對(duì)整個(gè)臨床試驗(yàn)實(shí)施過(guò)程、結(jié)果分析、 結(jié)論等進(jìn)行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng) 計(jì)分析方法。建議在臨床總結(jié)報(bào)告中對(duì)以下內(nèi)容進(jìn)行詳述。(1 )臨床試驗(yàn)總體設(shè)計(jì)及方案描述%1 臨床試驗(yàn)的整體管理情況、臨床研究單位選擇、臨床 主要研究人員簡(jiǎn)介等基本情

44、況介紹。%1 病例納入/排除標(biāo)準(zhǔn)、不同年齡段人群的預(yù)期選擇例 數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)。%1 樣本類型，樣本的收集、處理及保存等。%1 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法、統(tǒng)計(jì)軟件、評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)。(2 )具體的臨床試驗(yàn)情況%1 臨床研究所用產(chǎn)品的名稱、批號(hào)、有效期及所用機(jī)型等信息，以及對(duì)比試驗(yàn)產(chǎn)品的注冊(cè)情況。%1 對(duì)各研究單位的病例數(shù)、年齡分布情況進(jìn)行綜合分析, 建議以列表或圖示方式給出具體例數(shù)及百分比。%1 質(zhì)量控制，試驗(yàn)人員培訓(xùn)、儀器日常維護(hù)、質(zhì)控品運(yùn) 行情況，對(duì)檢測(cè)精密度、質(zhì)控品測(cè)量值的抽查結(jié)果評(píng)估。%1 具體試驗(yàn)過(guò)程，樣本檢測(cè)、數(shù)據(jù)收集、樣本長(zhǎng)期保存、 結(jié)果不一致樣本的校驗(yàn)等。(3)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析%1 數(shù)據(jù)預(yù)處理、差異數(shù)據(jù)

45、的重新檢測(cè)或第三方驗(yàn)證以及 是否納入最終數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、對(duì)異常值或缺失值的處理、研究過(guò) 程中是否涉及對(duì)方案的修改。%1 陽(yáng)性符合率、陰性符合率、總體符合率。%1 以交叉四格表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測(cè)結(jié)果， 對(duì)定性結(jié)果進(jìn)行四格表忙檢驗(yàn)或kappa檢驗(yàn)以驗(yàn)證兩種試劑 定性結(jié)果的一致性。另外考慮到對(duì)不同樣本類型以及不同年齡段人群的檢 測(cè)結(jié)果可能存在一定差異，故建議對(duì)不同樣本類型及不同年 齡段人群分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以對(duì)考核試劑的臨床性能進(jìn)行 綜合分析。(4 ) 討論和結(jié)論對(duì)總體結(jié)果進(jìn)行總結(jié)性描述并簡(jiǎn)要分析試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)本次臨床研究有無(wú)特別說(shuō)明，最后得出臨床試驗(yàn)結(jié)論。、名詞解釋1. 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) poly

46、merase chain reaction, pcr：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種對(duì)特定的dna或rna片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的方法。由變性-退火-延伸 三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。2. 雜交 hybridization具有一定同源序列的兩條核酸單鏈（dna或rna）可以通過(guò)氫鍵的方式，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則相結(jié)合。3熒光探針pcr在pcr過(guò)程中利用熒光染料釋放的熒光能量的變化直接反映出pcr擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，并通過(guò)對(duì)熒光的采集和分 析以達(dá)到對(duì)原始模板量進(jìn)行分析的pcro4. 分析特異性 analytical specificity測(cè)量程序只測(cè)量被測(cè)量物的能力。分析特異性用于描述檢測(cè)程序在樣本中有其他物質(zhì)存在時(shí)只測(cè)量被測(cè)量物的能 力。通常以一個(gè)被評(píng)估的潛在干擾物清單來(lái)描述，并給出在 特定醫(yī)學(xué)相關(guān)濃度值水平的分析干擾程度。注：潛在干擾物包括干擾物和交叉反應(yīng)物。5. 精密度 pre