蛇床子素對(duì)Aβ2535誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞NFκB活化機(jī)制的影響

1、蛇床子素對(duì)ab 2535誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞nf kb活化機(jī)制的影響作者：程淑意，陳云波，王奇，梁偉雄,溫澤淮【摘要】【目的】探討蛇床子素(osthole, ost)拮抗b 淀粉樣蛋白2535(a3 2535)毒性損傷、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用及其與核因子kb(nf訃)活化機(jī)制的關(guān)系?！痉椒ā恳栽囵B(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes, as)為靶 標(biāo)建立阿爾茨海默病(alzheimer sdise ase, ad)細(xì)胞模型。 采用cck 8(cellcounti ngkit8)法檢測(cè)細(xì)胞活力，進(jìn)行a3 2535造模濃度、時(shí)間以及ost預(yù)處理最適宜濃度的選擇。經(jīng)ab 25 35和os t干預(yù)后

2、，采用激光共聚焦顯 微鏡檢測(cè)分析異硫氤酸熒光素/碘化丙(fitc/pi)雙重標(biāo) 記的nf kb與其抑制蛋白(ikb a)在細(xì)胞內(nèi)的激活程度,結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察分析ost對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用。【結(jié)果】ost可拮抗a0 2 535的神經(jīng)毒性作用，尤其以低濃度(0011 11 mol/l)為佳，隨著濃度的升高，對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用呈減弱趨勢(shì)。40 u mol/l的ab 2535作用于as24 h可過(guò)度活化nf kb的表達(dá)(p【關(guān)鍵詞】蛇床子素/藥理學(xué)；阿爾茨海默病/中藥療法;星形膠質(zhì)細(xì)胞/病理學(xué)；細(xì)胞培蛇床子是傘形科一年生草本植物蛇床cnidiummonnier i (l) cusson 的成熟果實(shí)，蛇

3、床子素(osthole,ost）是從蛇床子中提取的一種天然香豆素。研究表明15, ost對(duì)機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)均具有較好的作用，尤其在中樞神經(jīng) 系統(tǒng)方面，如改善學(xué)習(xí)記憶、抗衰老、鎮(zhèn)靜抗炎等。ost防 治疾病的作用機(jī)制以及核因子k b（nuclearfac torkappab, nf kb）作為一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子在此機(jī)制中所起的作 用尚屬未知。本研究通過(guò)觀察ost保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞 （astrocyt es, as）的作用及其與nf k b信號(hào)傳導(dǎo)通路之 間的聯(lián)系，初步探討ost在細(xì)胞學(xué)領(lǐng)域防治阿爾茨海默病 （alzheimer sdisease, ad）的作用機(jī)制。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如 下。1材料與方法1

4、1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新生24h內(nèi)的spf級(jí)sd大鼠由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供合格證號(hào)：scxk（粵）xx 0001o12主要試劑和儀器蛇床子素（購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110822 xxo 5）, 0淀粉樣蛋白2 5 35 （a b 2535）凍干粉（購(gòu)自首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生化室）,cck 8（cellcoun tingkit 8）試劑盒（購(gòu)自株式會(huì) 社同仁化學(xué)研究所），高級(jí)dmem（高糖）培養(yǎng)基（gibco公司）, 特級(jí)胎牛血清（h yclone公司），胰蛋白酶粉末（amr esco公 司），nf k bp65 兔抗鼠抗體（calbioch em 公司），nf k b 抑制蛋白（

5、i kba ）兔抗鼠抗體仲山金橋公司），羊抗兔異硫 氧酸熒光素（fitc ） igg（invit rogen公司），碘化丙噪（pi）和 rn a酶a （sigma公司）。aeg 120型電子天平（日本島 津）,wtb150型c 02培養(yǎng)箱（德國(guó)bi nder）,多功能自動(dòng)酶標(biāo) 儀（瑞士 tec an）,德國(guó)leic a的倒置顯微鏡、激光共聚焦顯 微鏡以及圖像分析軟件。13星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)和ad細(xì)胞模型的建立6本實(shí)驗(yàn)室前期研究采用新生24h內(nèi)的s pf級(jí)sd大鼠已成功建 立了純化的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞（as）體外培養(yǎng)技術(shù)，經(jīng)鑒定其 細(xì)胞純度達(dá)到95%以上。同時(shí)采用四甲基偶氮呼鹽（mtt）法 檢測(cè)細(xì)

6、胞毒性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,40umol/l的ab 2535作用于純化培養(yǎng)的as,能較好地模擬ad細(xì)胞病理?yè)p傷。1 4蛇床子素對(duì)ad細(xì)胞模型活力的影響14 1ad細(xì)胞模型的建立將純化培養(yǎng)的as接種到96孔板上，培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)滿孔底80%左右，吸棄舊的培養(yǎng)液, 以終濃度為40 umol /l的a b 25 35作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞2 4h后,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)變化。xx年第27卷廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)程淑意，等蛇床子 素對(duì)a 3 25 3 5誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞nf kb活化機(jī)制的 影響1/2第1期1 4 2蛇床子素對(duì)ad細(xì)胞模型活力的 影響將純化培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞按2 5x 10 43x10

7、4/ 孔的密度接種到96孔板中，并隨機(jī)分為7組：正常組，模型 組，00 1 u mol/lost 組，01 li mol/lost 組，1 u mo1/lost 組，10 u mol/lost 組，100 p mol/l ost 組，6 孑l/組。24h后倒置顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞長(zhǎng)出突觸并呈相互融合狀態(tài)后， 給os t各濃度組加藥，分別于加藥后12、24、48h時(shí)，除正 常組外，其他各組均加入終濃度為40 p mol/l的a b 2535繼續(xù)培養(yǎng)24ho在所有實(shí)驗(yàn)孔中加入cck 8液10 ul,置 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)lh,可見(jiàn)橙黃色結(jié)晶物(即甲月賛)形成，采 用酶標(biāo)儀測(cè)各孔吸光度(d)值，檢測(cè)波長(zhǎng)為4

8、50nm。1 5nf k b和i k b a活性的檢測(cè)151實(shí)驗(yàn)分組將純化培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞按ix105/m l的密度接種于6孔板(內(nèi)置已用多聚賴氨酸包被的 蓋玻片)，按1 ml/孔、2孑l/組分為7組：正常組,0 1p mol/lost 組，0 5 u mol/lost 組，2 5 u mol/lost 組，125 u mol/l ost 組，ost 對(duì)照組(05 p mol/lost),模型組。每孔補(bǔ)充完全培養(yǎng)液至25ml,置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞爬片至合適的時(shí)間后，除正常組和模型組外其他各組分 別加入相應(yīng)濃度的ost,作用于細(xì)胞2 4h之后，除正常組和 ost對(duì)照組外其他各組均加入終濃度

9、為40 umol/lab25 35,繼續(xù)培養(yǎng)。152細(xì)胞固定細(xì)胞爬片以甲醛固定，磷酸鹽緩沖液(pbs )沖洗，體積分?jǐn)?shù)70 %冷乙醇浸泡,-20 °c固定24ho 檢測(cè)i kba時(shí)參照文獻(xiàn)7 方法，于ab作用3 omin后進(jìn)行 細(xì)胞固定。檢測(cè)nf kbp 65時(shí)參照文獻(xiàn)6方法，于ab253 5作用24h后進(jìn)行細(xì)胞固定。153免疫熒光染色及激光共聚焦顯微鏡觀察將細(xì)胞爬片以冷pbs沖洗,用含羊血清、tri tonx 100的p bs 室溫作用30mi n0吸棄上清液后，不洗，加入一抗,4°c過(guò)夜。 用冷pbs充分沖洗，用pbs nan 31 : 200稀釋的二抗,37°

10、;c 作用lh,pi染液避光室溫下復(fù)染20mino用冷p bs充分沖 洗。每張切片任選20個(gè)細(xì)胞，以leicaconfo cal圖像分析 軟件檢測(cè)核區(qū)與胞漿區(qū)的熒光值(fn/fc)。1 6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用spss 110軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。2結(jié)果2 1 ad細(xì)胞模型的建立鏡下觀察見(jiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞出 現(xiàn)明顯的毒性損傷,表現(xiàn)為細(xì)胞突觸減少或回縮，細(xì)胞變圓， 其表面斑點(diǎn)和沉積物增多，生長(zhǎng)遲滯。22蛇床子素對(duì)a b 2535誘導(dǎo)的ad細(xì)胞模型活力的影響表1結(jié)果顯示,低濃度(00 1lpmol/l)0st各組與模型組在不同時(shí)點(diǎn)比較差異均有顯著性意義(p2 3各組 對(duì)ad細(xì)胞模型nf kb和ikba活性

11、的影響表2結(jié)果顯 示,模型組nf k b及i k b a的fn/fc值與正常組比較差異 均有顯著性意義(p005) o ost各濃度組fn/fc與模型組比較差異均有顯著性意義(p3討論ad是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行性、退行性疾病，其病理表 現(xiàn)雖以神經(jīng)元的退變喪失、纖維纏結(jié)、空泡變性為主，但近 年來(lái)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞(a s)的研究發(fā)現(xiàn)，其在ad發(fā)病過(guò)程中 起著越來(lái)越重要的作用。眾所周知,ab是ad老年斑的核心 組成部分,生理?xiàng)l件下的ab主要是由as生成，并能適度活 化as內(nèi)的nf k b,對(duì)a b周?chē)纳窠?jīng)元起到保護(hù)作用。而 在病理?xiàng)l件下，大量沉積的ab不僅能誘導(dǎo)as內(nèi)nf kb 過(guò)度活化，釋放炎癥因

12、子、增加載脂蛋白e(apoe )的表達(dá)、 產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，而且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，還導(dǎo)致ab附近 as數(shù)量明顯減少，沉積的ab明顯下調(diào)神經(jīng)元內(nèi)nf k b的 活性表達(dá),致使神經(jīng)元對(duì)a b的毒性變得異常敏感，兩種途徑 共同作用,促使神經(jīng)元出現(xiàn)死亡，從而加速ad的發(fā)生、發(fā)展 及惡化。ikba是nf kb的抑制蛋白，正常狀態(tài)時(shí)與 nf kb結(jié)合成非活性的復(fù)合物穿梭于胞漿與胞核之間。當(dāng)細(xì)胞受到外界因素刺激時(shí)，則引起一系列連鎖的酶促反應(yīng), 使i k b a發(fā)生磷酸化并與nf kb解離,nf k b隨之活 化并轉(zhuǎn)入核內(nèi)，發(fā)揮調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的功能。雖然不同的 外界刺激通過(guò)作用于不同的ikbcl,引起nf k

13、b有差別 的活化，但幾乎所有已知nf k b誘導(dǎo)物均能通過(guò)i k b a 的降解迅速而短暫地活化nf k bo而活化的nfk b又能夠上調(diào)i k b a的m rna水平,促使合成新的i k b a進(jìn)入細(xì) 胞核與nf k b結(jié)合返回細(xì)胞質(zhì)中，從而保證nf kb活化 過(guò)程的適時(shí)終止9。本研究結(jié)果顯示,40 pmol/l的ab 2 535作用于as3 omin后，標(biāo)記i k b a的綠色熒光抗體大量出現(xiàn)在胞漿區(qū), 說(shuō)明a b 2535能誘導(dǎo)as內(nèi)的i k b a迅速磷酸化并與nfkb 解離。而 40 p mol /l 的 a 3 2535 作用于 as24h后，標(biāo)記nf kbp65的綠色熒光抗體由胞

14、漿區(qū)大量進(jìn)入紅 色的胞核區(qū)。形態(tài)學(xué)方面,此時(shí)的as在細(xì)胞數(shù)量和軸突數(shù) 目上都有明顯減少，毒性損傷較大。本研究結(jié)果初步表明：在ad病理?yè)p傷中,0 st通過(guò)上 調(diào)as中i k b a的表達(dá)，抑制n fkb的過(guò)度表達(dá),起到保護(hù)細(xì)胞的作用。既往研究表明，低劑量的ab可激活神經(jīng)元 內(nèi)的nfkb,作為重要的抗凋亡因子對(duì)神經(jīng)元起保護(hù)作用,而高劑量時(shí)則下調(diào)nf 訃活性,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡10。低濃 度的人參皂昔rgl可上調(diào)ad海馬神經(jīng)元細(xì)胞模型中nfkb的表達(dá)，延長(zhǎng)其存活時(shí)間，減低死亡率11。本研究也發(fā)現(xiàn) ost對(duì)as的保護(hù)作用與其濃度有關(guān),低濃度(01 u mol/l和0 5um ol/l)的ost對(duì)as的保護(hù)作

15、用更好，其機(jī)制可能 是ost通過(guò)抑制a b誘導(dǎo)的i k b a過(guò)度磷酸化，減弱nfkb在as內(nèi)的過(guò)度活化表達(dá)而保護(hù)a s,提高神經(jīng)元細(xì)胞抵抗 ab的能力，為0s t治療ad提供了新證據(jù)，確切機(jī)制有待進(jìn) 一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1沈麗霞，張丹參，張力，等蛇床子素對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響及其機(jī)制分析j 藥學(xué)學(xué)報(bào),1999, 34(6): 405.2 張均田 老化、老年癡呆與鈣代謝失衡及其治療新 途徑j(luò) 藥學(xué)學(xué)報(bào)，19 93, 28:641.3 沈麗霞，金樂(lè)群,張丹參，等 蛇床子素對(duì)a1c13致 急性衰老模型小鼠記憶障礙的保護(hù)作用j1.藥學(xué)學(xué)報(bào),xx, 3 7(3)： 178.4 王書(shū)華，安芳，張丹參，等 蛇

16、床子素抗氧化作用的 實(shí)驗(yàn)研究j.中成藥,xx, 27(4)： 48 8.5 王書(shū)華，安芳，張丹參，等 蛇床子素抗氧自由基清 除作用的研究j.中成藥,xx, 26 (12)： 1062.6 馮梅，陳云波，王奇，等 人參皂昔rgl對(duì)ab25 3 5誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞核因子 kb活化及炎癥反應(yīng)的影響 j.中國(guó)老年學(xué)雜志,xx, 26 (10)： 13 82.7 金曉琨，李衛(wèi)東,騰慧玲，等 青藤堿對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子 kb及其抑制因子的影響j.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),xx, 20 (7)：8qinlp, s hihp, wanghb, etaleff ectofosthlecoumarinsonlearningandmemoryandneverpeptideinkidneydebilityofyangratmodelj. academicjournalofsecondmilitarymedicaluniversity, 19 97, 18(2) :1 47.9 ho ffmanna, le vchenkoa,s cottlm, eta 1thelkapp ab nf kapp absignalin gmodule:te mporalcontrolandselectivegeneactivation