浙江大學(xué)生物化學(xué)丙實(shí)驗(yàn)報(bào)告6

1、專業(yè)： 農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境 姓名： 李佳怡 學(xué)號(hào)： 3130100246 日期： 2015.6.9 地點(diǎn)： 生物實(shí)驗(yàn)中心310 裝 訂 線實(shí)驗(yàn)報(bào)告課程名稱： 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)（丙） 指導(dǎo)老師： 方祥年 成績(jī)：_實(shí)驗(yàn)名稱： 質(zhì)粒DNA的微量制備及電泳檢測(cè) 同組學(xué)生姓名： 金宇尊、鮑其琛 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅ū靥睿┒?、?shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理（必填）三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑（必填） 四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器（必填）五、操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟（必填） 六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析（必填） 八、討論、心得一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?、學(xué)習(xí)并掌握質(zhì)粒DNA的提取原理和方法；2、了解瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)核酸的原理和操作；3、學(xué)習(xí)并掌握對(duì)

2、電泳檢測(cè)結(jié)果的初步分析。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理1、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容質(zhì)粒DNA的提取DNA的瓊脂糖凝膠電泳鑒定2、 實(shí)驗(yàn)原理質(zhì)粒：質(zhì)粒是一種染色體（核質(zhì)體）外的寄生性的自主復(fù)制子，存在于細(xì)菌等細(xì)胞中，為雙鏈閉環(huán)的DNA分子，大小在1-200kb之間，具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄功能, 能表達(dá)例如抗性、菌毒素等細(xì)胞非必需的遺傳信息，但其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄必須要利用依賴宿主細(xì)胞（細(xì)菌）基因組DNA編碼的一些酶和蛋白質(zhì)。質(zhì)粒能夠自發(fā)的或人為的在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移，因此是基因工程技術(shù)中將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞的重要載體。從細(xì)菌細(xì)胞中抽提質(zhì)粒DNA的步驟：a細(xì)菌培養(yǎng)使質(zhì)粒大量擴(kuò)增；b收集和裂解細(xì)胞,并去掉細(xì)菌碎片和核質(zhì)體DNA ；c進(jìn)一步除去蛋

3、白、脂類、RNA等雜質(zhì)，分離和純化質(zhì)粒DNA。堿裂解法來(lái)分離純化質(zhì)粒DNA：在EDTA存在下，經(jīng)過(guò)SDS處理使細(xì)胞膜裂解，從而使菌體充分裂解，利用在堿性條件下（NaOH），使核質(zhì)體DNA與質(zhì)粒DNA的變性；加入乙酸鉀，在中性條件下，核質(zhì)體DNA與質(zhì)粒DNA又存在復(fù)性的差異，質(zhì)粒DNA很快得以復(fù)性，而細(xì)菌核質(zhì)體DNA分子難以復(fù)性，核質(zhì)體DNA會(huì)纏繞附著在細(xì)胞膜碎片上通過(guò)離心被沉淀下來(lái)，質(zhì)粒DNA則留在上清液內(nèi)；上清液中還含有可溶性蛋白質(zhì)、核糖核蛋白和少量核質(zhì)體DNA以及脂質(zhì)類雜質(zhì)等，可通過(guò)堿性酚-氯仿-異戊醇混合液的抽提去除；含有質(zhì)粒DNA的上清液用無(wú)水乙醇或異戊醇沉淀，這是由于當(dāng)加入無(wú)水乙醇時(shí)

4、，其會(huì)奪去核酸周圍的水分子，使其失水而易于聚合。一般用2倍體積的乙醇或1倍體積的異丙醇沉淀DNA和RNA。獲得較純的質(zhì)粒DNA。DNA的瓊脂糖凝膠電泳鑒定: DNA分子在瓊脂糖凝膠中有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在堿性溶液中（pH8.3緩沖液）帶負(fù)電荷，它在電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即具有不同的相對(duì)分子量的DNA片段泳動(dòng)速度不同，并能區(qū)分出不同的區(qū)帶。DNA片斷在凝膠中當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙錠（EB）染色后，在紫外光下可見(jiàn)橙紅色帶，并可確定DNA片斷在凝膠中的位置。影響DNA泳動(dòng)速率（遷移率）的因素有：DNA分子質(zhì)量的影響：雙鏈

5、DNA分子遷移的速率與DNA分子量對(duì)數(shù)成反比。分子量越大，遷移率越小。 DNA構(gòu)型的影響：超螺旋DNA線狀DNA開環(huán)DNA。膠濃度的影響： 濃度越低，相同核酸分子遷移越快，一般常用的凝膠濃度為12；電場(chǎng)強(qiáng)度的影響：電場(chǎng)強(qiáng)度愈大，帶點(diǎn)顆粒的泳動(dòng)越快。但凝膠的有效分離范圍隨著電壓增大而減小，所以電泳時(shí)一般采用低電壓，（一般5V/cm）（電場(chǎng)強(qiáng)度） 。而對(duì)于大片段電泳，甚至用0.51.0V/cm電泳過(guò)夜。進(jìn)行高壓電泳時(shí)，只能使用聚丙烯酰胺凝膠。EB的影響：溴化乙錠（EB）插入雙鏈DNA造成其負(fù)電荷減少、剛性和長(zhǎng)度增加。電泳緩沖液的影響:核酸電泳常采用TAE、TBE、TPE三種緩沖系統(tǒng)，但它們各有利弊

6、。TAE價(jià)格低廉，但緩沖能力低，必須進(jìn)行兩極緩沖液的循環(huán)。TPE在進(jìn)行DNA回收時(shí)，會(huì)使DNA污染磷酸鹽，影響后續(xù)反應(yīng)。所以多采用TBE緩沖液。在緩沖液中加入EDTA，可以鰲合二價(jià)離子，抑制DNase，保護(hù)DNA。緩沖液pH常偏堿性或中性，此時(shí)核酸分子帶負(fù)電，向正極移動(dòng)。堿基組成與電泳溫度的影響: 一般影響不大。質(zhì)粒DNA不同構(gòu)型在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移速度：環(huán)形雙鏈DNA分子有三種構(gòu)型。 第一種是共價(jià)閉合環(huán)狀DNA，它的兩條鏈都保持完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，通常呈超螺旋構(gòu)型，遷移速度最快； 第二種是開環(huán)DNA，它的雙鏈中的一條保持完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，另一條單鏈上有一到幾個(gè)切口兩條核苷酸鏈中只有一條保持完整

7、的環(huán)形結(jié)構(gòu)，即OC構(gòu)型，遷移速度最慢； 第三種是線狀DNA，這種質(zhì)粒的雙鏈斷裂呈線狀,通稱L構(gòu)型。這三種構(gòu)型的同一種質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠中電泳時(shí)，出現(xiàn)不同的遷移速率，走得最快的是超螺旋構(gòu)型，其次是線性構(gòu)型，最慢的是開環(huán)構(gòu)型。實(shí)驗(yàn)有關(guān)試劑的作用： 溶液：葡萄糖：增加溶液的黏度，減少抽提過(guò)程中的機(jī)械剪切作用，防止破壞質(zhì)粒DNA。EDTA：絡(luò)合掉Mg等二價(jià)離子，防止DNA酶對(duì)質(zhì)粒分子的降解作用。Tris·HCl：使溶菌液維持溶菌作用的最適pH范圍。溶液：SDS：解聚核蛋白并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之變性。NaOH：破壞氫鍵，使DNA分子變性。溶液：中和溶液的堿性，使染色體DNA復(fù)性而發(fā)生纏繞，并使質(zhì)

8、粒DNA復(fù)性。高鹽的3mol/L NaAc/KAc有利于變性的大分子核質(zhì)體DNA以及K/Na離子會(huì)與SDS形成溶解度很低的鹽并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去。酚：一種強(qiáng)烈的蛋白質(zhì)變性劑，能非常有效地去除蛋白質(zhì)，同時(shí)抑制了核酸酶的降解作用。氯仿：有強(qiáng)烈的溶脂傾向，可以溶解細(xì)胞膜，同時(shí)溶解去除脂質(zhì)類雜質(zhì)，此外具有使蛋白質(zhì)變性并分相的作用。異戊醇：減少蛋白質(zhì)變性操作過(guò)程中產(chǎn)生的氣泡。乙醇或異丙醇可以沉淀核酸，當(dāng)加入乙醇時(shí)，其會(huì)奪去核酸周圍的水分子，使其失水而易于聚合。一般用2倍體積的乙醇或1倍體積的異丙醇沉淀DNA和RNA。70的乙醇用于洗滌核酸沉淀，其目的是去除鹽及揮發(fā)性較小的異丙醇。RNaseA用于消化

9、質(zhì)粒DNA溶液中的殘余RNA。3、 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 1、實(shí)驗(yàn)材料 含重組質(zhì)粒菌種 2、實(shí)驗(yàn)試劑 LB液體培養(yǎng)基 氨芐青霉素：100mg/ml 溶液 溶液 溶液 酚：氯仿：異戊醇（25：24：1） 無(wú)水乙醇 70%乙醇 TE緩沖液（pH 8.0） RNaseA（1mg/ml） 0.5×TBE緩沖液（pH8.0） 瓊脂糖 6×加樣緩沖液 1mg/ml溴化乙錠（EB）4、 實(shí)驗(yàn)器材與儀器1、恒溫培養(yǎng)箱 37； 2、恒溫?fù)u床 37； 3、高壓滅菌鍋； 4、超凈工作臺(tái)； 5、臺(tái)式離心機(jī)； 6、振蕩器；7、微量移液槍(10，20，200，1000ul)； 8、槍頭（10，20，1000

10、ul）及槍頭盒；9、離心管 1.5ml及離心管架； 10、制冰機(jī)； 11、冰箱； 12、干式恒溫器 37、50 ； 13、微波爐； 14、電泳儀及；15、電泳槽； 16、紫外檢測(cè)儀。五、實(shí)驗(yàn)操作方法和步驟1、收集細(xì)菌,堿裂解液提取質(zhì)粒DNA，純化質(zhì)粒DNA去除核DNA，粗提取質(zhì)粒DNA離心：取1.2ml的過(guò)夜培養(yǎng)菌液加入1.5ml離心管中，8000r/min離心1min；棄上清液， 將管倒置于吸水紙上，使液體盡可能流盡。冰?。簩⒕w沉淀加100ul溶液，振蕩懸浮菌體，冰浴放置510min。再離心：加200ul溶液，蓋緊管蓋，快速溫和顛倒離心管數(shù)次，確保離心管內(nèi)溶液混勻 使之變清，冰浴10min

11、。加150ul溶液，蓋緊管口，顛倒數(shù)次使之混勻，冰浴 放置5min。（說(shuō)明：以上步驟目的）去除可溶性雜蛋白等雜質(zhì)，純化質(zhì)粒DNA離心：12000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)至另一干凈離心管，加入等體積的酚：氯仿： 異戊醇（25：24：1），振蕩混勻，12000r/min離心 10min 。冰浴：上清液移入另一干凈離心管中，加入2倍體積無(wú)水乙醇，混勻后置-20冰箱中20min。離心：12000r/min離心10min，棄上清液，將溶液管口倒置吸水紙上，使液體盡可能流盡。去除核RNA加樣：加入1ml 70乙醇洗沉淀一次（動(dòng)作要輕），棄70乙醇溶液，將管口倒置于吸水 紙上，使液體盡可能流盡，

12、自然干燥或50干燥。保存：將沉淀溶于50ul TE緩沖液（pH8.0，含20mg/L RNaseA）中，置37恒溫器中保溫 30min后，取質(zhì)粒DNA樣液做瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其余純化的質(zhì)粒DNA樣品置于 -20保存?zhèn)溆谩?、DNA的瓊脂糖凝膠電泳鑒定加樣：取5ul純化的質(zhì)粒DNA樣品，與1ul 6×電泳加樣緩沖液混勻，用微量移液槍小心 加入樣品槽中。若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過(guò) 樣品槽容量。（注：a勿劃破或戳穿加樣孔，勿帶入氣泡；b上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)?品槽底部凝膠刺穿；c每加完一個(gè)樣品要換槍頭以防互相污染。）電泳：加完樣后，蓋上電泳

13、槽蓋，立即接通電源，使電壓調(diào)到100V，恒壓電泳。當(dāng)溴酚藍(lán) 條帶移動(dòng)到距凝膠前緣約2cm時(shí)，停止電泳（約需3060min）。觀察和拍照：取出膠塊置于紫外燈下觀察，DNA存在處可顯示出肉眼可辨的橘紅色熒光帶， 再用成像儀進(jìn)行拍照，以便于分析。注：紫外光對(duì)眼睛有害，觀察時(shí)戴上防護(hù)鏡或眼鏡，或隔著玻璃或有機(jī)玻璃觀察。6、 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理1、樣品離心后：上層淡黃色，下層有乳黃色沉淀；2、加入溶液后：沉淀溶解，溶液呈淡黃色；3、加入溶液后：溶液無(wú)色澄清；4、冰浴后：部分凝固，呈現(xiàn)無(wú)色；5、加入溶液后：有白色絮狀沉淀出現(xiàn)；6、離心后：溶液分層，沉淀白色，有部分粉末懸?。?、加 酚：氯仿：異戊醇（25：

14、24：1）后：分層，下層顏色土黃色，上層淡黃色；8、離心后：分層，上層無(wú)色透明，下層淡黃色，中層雜蛋白油狀。七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析電泳圖譜：1、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：第一條帶對(duì)應(yīng)的DNA為超螺旋構(gòu)型DNA，條帶最亮，表明此結(jié)構(gòu)的DNA含量最高，同時(shí)其遷移距離最遠(yuǎn)，在同樣時(shí)間內(nèi)，超螺旋構(gòu)型DNA遷移速度最快，結(jié)果正常。第二條帶對(duì)應(yīng)的DNA為線狀DNA，在三條帶中顏色最淺，含量最少。第三條帶對(duì)應(yīng)的DNA，為開環(huán)DNA，遷移速度最慢，含量較線狀DNA微多一些。點(diǎn)樣孔處有較多DNA殘留，表明加樣時(shí)有較多溢出，操作不夠規(guī)范，仍需改進(jìn)。在第一條帶之前無(wú)其它可辨的條帶，可推測(cè)無(wú)RNA殘留。2、 結(jié)果分析：根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出

15、如下分析：在加樣時(shí)，未控制好位置和高度，導(dǎo)致殘留在點(diǎn)樣孔中的樣品較多，因此也影響了各個(gè)條帶中的樣品量，若在加樣時(shí)操作規(guī)范，則可增大條帶中DNA的量。各個(gè)條帶之間距離較大，表明超螺旋構(gòu)型DNA、線狀DNA、開環(huán)DNA三種不同類型的DNA之間分離較好，且超螺旋型DNA亮度最亮，表明其含量最多。但仍存在較多開環(huán)和線狀DNA含量也較多，表明提取到的DNA雜質(zhì)較多，原因可能為沒(méi)有在洗滌沉淀時(shí)進(jìn)行充分洗滌，只是稍微放置一會(huì)后就將乙醇倒掉了，應(yīng)多放置一段時(shí)間，并微微搖動(dòng)，以除去雜質(zhì)。由于在第一條帶之上不再有其它可辨的條帶，可推測(cè)無(wú)RNA殘留。說(shuō)明DNA純度高，提取過(guò)程對(duì)RNA的去除完全。八、討論、心得思考題

16、：1、在提取質(zhì)粒DNA的過(guò)程中， EDTA、 SDS、 NaOH、乙酸鉀、酚-氯仿-異戊醇等試劑的作用是什么？ EDTA：絡(luò)合掉Mg等二價(jià)離子，防止DNA酶對(duì)質(zhì)粒分子的降解作用。 SDS：解聚核蛋白并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之變性。 NaOH：破壞氫鍵，使DNA分子變性。 乙酸鉀：質(zhì)粒DNA復(fù)性。 酚-氯仿-異戊醇：酚：一種強(qiáng)烈的蛋白質(zhì)變性劑，能非常有效地去除蛋白質(zhì)，同時(shí)抑制了核酸酶的降解作用。氯仿：有強(qiáng)烈的溶脂傾向，可以溶解細(xì)胞膜，同時(shí)溶解去除脂質(zhì)類雜質(zhì)，此外具有使蛋白質(zhì)變性并分相的作用。異戊醇：減少蛋白質(zhì)變性操作過(guò)程中產(chǎn)生的氣泡（泡沫）。 其余試劑見(jiàn)實(shí)驗(yàn)原理部分。2、在質(zhì)粒DNA的提取過(guò)程中，應(yīng)

17、注意哪些操作，為什么？（1）各步驟中的混勻過(guò)程要溫和，因?yàn)橘|(zhì)粒DNA是環(huán)狀生物大分子，若是過(guò)于劇烈，極易收集到破碎、斷裂的片段而不是完整的超螺旋DNA；（2）各步驟中的試劑的量要適當(dāng)，過(guò)量和不足都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（3） 提取過(guò)程中應(yīng)盡量保持較低溫度。 （4） 加入溶液II和溶液III后操作應(yīng)混和,切忌劇烈振蕩。3、瓊脂糖凝膠電泳操作應(yīng)注意哪些環(huán)節(jié)？ （1）倒膠時(shí)把握好膠的溫度，不要高于60ºC，否則溫度太高會(huì)使制膠板變形。（2）膠一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要垂直向上，不要弄壞點(diǎn)樣孔。（3）配膠和灌電泳槽需使用同一緩沖液。pH或離子強(qiáng)度很小的差別也會(huì)在凝膠前部造成紊亂，影響DNA

18、片段的泳動(dòng)。（4）加樣時(shí)需將槍頭深入加樣孔內(nèi)再吹出樣品，以免樣品從凝膠表面擴(kuò)散；加樣時(shí)槍頭不要刺穿或碰壞凝膠孔壁，否則將導(dǎo)致樣品將從凝膠底部擴(kuò)散或DNA帶型不整齊。此外點(diǎn)樣孔內(nèi)不能有氣泡。（5）樣品應(yīng)加在陰極端，沒(méi)加完一個(gè)樣品要更換槍頭，防止相互污染。（6）觀察時(shí)在透射儀的樣品臺(tái)上鋪一張保鮮膜，趕去氣泡。（7）要選擇合適的電壓、pH等條件。討論心得：1、 質(zhì)粒在正常情況下以超螺旋構(gòu)型存在，在提取過(guò)程中由于機(jī)械力、酸堿度、試劑等的原因，可能會(huì)使DNA鏈發(fā)生斷裂。2、 DNA泳動(dòng)速率受到多方面因素的影響。3、 溴化乙錠（EB）為致癌劑，操作時(shí)應(yīng)戴手套，盡量減少臺(tái)面污染。4、 用無(wú)水乙醇沉淀DNA：乙醇可以任意比和水相溶，乙醇與核酸不會(huì)起化學(xué)反應(yīng)，不會(huì)破壞DNA。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪取DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。本次實(shí)驗(yàn)中，是加2倍體積的無(wú)水乙醇與DNA相混，其含量約為67%，因此可以考慮用95%乙醇，但是DNA回收率可能會(huì)下降。5、 提取過(guò)程中應(yīng)盡量保持較低溫度。 6、 加入溶液II和溶液III后操作應(yīng)混和,切忌劇烈振蕩。7、 要盡可能充分利用提取物，可增加產(chǎn)率；但是在不同情況和實(shí)驗(yàn)要求下應(yīng)在產(chǎn)率和質(zhì)量之