常用飼用酶制劑檢測方法介紹實用教案

1、飼料(slio)酶制劑 現(xiàn)市場上常見(chn jin)的飼料酶制劑多為復合酶，其成分木聚糖酶、-淀粉酶、（酸性或中性）蛋白酶、甘露聚糖酶、纖維素酶、-葡聚糖酶中的幾種。 如何準確檢測其中的一種酶制劑的活性？第1頁/共37頁第一頁，共38頁。酶制劑檢測(jin c)原理 酶與一般催化劑最主要的區(qū)別之一是它具有(jyu)高度的專一性。第2頁/共37頁第二頁，共38頁。酶制劑檢測(jin c)原理 樣品檢測： 酶制劑檢測應(yīng)用酶對底物專一性的特點，采用高純度底物，專一檢測某種酶制劑對底物的降解，然后測定產(chǎn)物(chnw)含量（分光光度計）。 標準曲線： 通過用其高純度的產(chǎn)物(chnw)制作標準曲線，通過

2、分光光度計的讀數(shù)查出對應(yīng)的產(chǎn)物(chnw)含量，然后計算酶活。第3頁/共37頁第三頁，共38頁。酶制劑檢測(jin c)原理第4頁/共37頁第四頁，共38頁。A. -淀粉酶 1.碘淀粉顯色法 利用淀粉遇碘變藍的反應(yīng)，檢測出未被淀粉酶分解的淀粉，運用(ynyng)分光光度計測定碘反應(yīng)藍值的變化，然后查表讀取酶活。 特點：測定-淀粉酶的碘淀粉顯色法是專一性較高、操作較簡便、準確性也較高的方法。第5頁/共37頁第五頁，共38頁。A. -淀粉酶 2. DNS顯色法 原理：淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖，將3，5二硝基水楊酸試劑還原(hun yun)生成3氨基5硝基水楊酸的顯色基團，在一定范圍內(nèi)其顏色的深淺

3、與糖的濃度成正比，故可求出麥芽糖的含量。 特點：專一性不高，易受其他淀粉酶（主要是-淀粉酶）的干擾，因此，碘淀粉顯色法應(yīng)用較多。第6頁/共37頁第六頁，共38頁。B. 蛋白酶 1. Folin法 原理：蛋白酶水解酪蛋白，產(chǎn)生酪氨酸等酚基氨基酸，在堿性條件下，酚基氨基酸與Folin試劑反應(yīng)生產(chǎn)藍色物質(zhì)(wzh)，于680nm比色測定光吸收值，計算酶活力。 該法的準確性及靈敏度都較高，在國內(nèi)已得到公認，是應(yīng)用最廣的方法，我國的部頒標準及各大酶制劑生產(chǎn)企業(yè)都采用該法。第7頁/共37頁第七頁，共38頁。B. 蛋白酶 2. 紫外分光(fn un)光度法 原理：蛋白酶水解酪蛋白，產(chǎn)生酪氨酸等酚基氨基酸，利

4、用酪氨酸在280nm處有特征性吸收峰,測定計算酶活。 特點：紫外線操作比Folin法簡便，但靈敏度僅為Folin法的1/10。第8頁/共37頁第八頁，共38頁。C. 產(chǎn)還原(hun yun)糖酶制劑 現(xiàn)今采用的還原糖法通常是比色法，黃色的3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑與還原糖在堿性條件下共熱后，自身被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。顯色反應(yīng)與不同聚合度同源(tn yun)寡糖還原性末端的含量成正比。 特點：易于操作，價格低廉，方便快速，重復性好 第9頁/共37頁第九頁，共38頁。C. 產(chǎn)還原(hun yun)糖酶制劑 能產(chǎn)生還原糖的酶有：包括纖維素酶、半纖維素酶和淀粉酶等。 半纖維

5、素酶是分解半纖維素(包括各種( zhn)降戊糖與聚己糖)的一類酶的總稱,主要包括-葡聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶。第10頁/共37頁第十頁，共38頁。C. 產(chǎn)還原(hun yun)糖酶制劑 1. 還原糖法 2. 粘度(zhn d)法 3. 瓊脂平板擴散法 4. 可溶性的染色底物第11頁/共37頁第十一頁，共38頁。1. 還原(hun yun)糖法 還原(hun yun)糖是指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都是還原(hun yun)糖，雙糖和多糖不一定是還原(hun yun)糖，其中乳糖和麥芽糖是還原(hun yun)糖，蔗糖和淀粉是非還原(hun yun)糖。第12頁/共37頁第十

6、二頁，共38頁。2. 粘度(zhn d)法 原理：酶作用于具粘性的非淀粉多糖底物，使粘度下降，通過粘度計測定流速改變來計算酶活力。該法靈敏度較高，可形象反映外切酶在動物體內(nèi)的作用方式，較適宜于飼用酶活性的測定。 特點：重復性差 ，費時、操作(cozu)復雜、單位難以換算成國際單位 。第13頁/共37頁第十三頁，共38頁。3. 瓊脂(qingzh)平板擴散法 原理：將NSPS 底物與瓊脂混融制成瓊脂平板，將酶樣點于瓊脂板上的小孔中，培養(yǎng)一定時間，選用能與底物發(fā)生顯色反應(yīng)的顯色劑染色，顯示出染色背景區(qū)和無色透明的水解區(qū)，水解區(qū)直徑與酶量的對數(shù)呈正相關(guān)，由水解區(qū)直徑計算酶活力。 特點：靈敏度高，是還

7、原糖法的100倍，測定(cdng)所需樣品量微，無需特殊設(shè)備。第14頁/共37頁第十四頁，共38頁。4. 可溶性的染色(rns)底物 原理：人工合成的含色原基團的底物在酶的作用下釋放出有色物質(zhì)，利用分光(fn un)光度計比色測定有色物質(zhì)含量，計算酶活力。 特點：重復性好，操作簡便，靈敏度較高 ，但合成底物與天然底物有區(qū)別，對結(jié)果的準確性可能有影響 ，并且底物昂貴。第15頁/共37頁第十五頁，共38頁。D. 脂肪酶 原理：脂肪酶在一定條件下 ，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯和甘油，所釋放(shfng)的脂肪酸，可用標準堿溶液進行中和滴定，用pH或酚酞指示反應(yīng)終點，根據(jù)消耗的堿量，計算其酶活

8、。 反應(yīng)式為： RCOOH + NaOH RCOONa + H2O第16頁/共37頁第十六頁，共38頁。E. 植酸酶 1.國標法（釩鉬酸銨法） 原理：利用植酸酶水解植酸鈉產(chǎn)生無機磷，再加入酸性鉬釩試劑終止(zhngzh)反應(yīng)，同時與無機磷反應(yīng)生成黃色釩鉬磷絡(luò)和物，在415nm比色測定含磷量，再以標準植酸酶為參照物，間接計算被測樣品中植酸酶的含量。第17頁/共37頁第十七頁，共38頁。E. 植酸酶 2.硫酸亞鐵鉬藍法 原理：利用植酸酶可以水解植酸酶釋放無機磷的原理，通過加入鹽酸使水解反應(yīng)停止(tngzh)，然后加入鉬酸銨及FeSO47H2O的混合液使溶液顯色，在720nm波長下測定其吸收值，以標

9、準酶為參照物，間接計算被測樣品中植酸酶的含量。 第18頁/共37頁第十八頁，共38頁。E. 植酸酶 3.丙酮磷鉬酸銨法 原理：磷酸鹽與過量(guling)的鉬酸銨在酸性條件下混合后，可慢慢生成黃色磷鉬酸銨，加入丙酮后使黃色物質(zhì)提出來，在355nm波長處測吸光度，靈敏度增加10倍。 特點：釩鉬酸銨法靈敏度最高，丙酮法穩(wěn)定性最好，抗干擾能力較強。第19頁/共37頁第十九頁，共38頁。E. 植酸酶 4. VC鉬藍法 原理：該方法是利用植酸酶可以水解植酸磷釋放無機磷的原理，通過加入三氯乙酸使反應(yīng)停止，然后加人鉬酸銨與VC的混合液，使溶液(rngy)顯色，在820nm波長下測定吸光度，再以標準磷溶液(r

10、ngy)的吸光度及磷溶液(rngy)濃度對應(yīng)的酶活單位建立直線回歸方程，最后以待測樣品吸光度代人方程，計算出酶活性。 第20頁/共37頁第二十頁，共38頁。影響酶活力(hul)的主要因素A.底物種類(zhngli)和濃度B.酶活力單位定義C.酶反應(yīng)pH值D.酶反應(yīng)溫度E.酶反應(yīng)時間第21頁/共37頁第二十一頁，共38頁。A.A.底物(d w)(d w)種類和濃度 同種方法采用不同底物測定，結(jié)果相差很大。 例如木聚糖酶的檢測(jin c)，燕麥木聚糖與樺木木聚糖的測定結(jié)果就有明顯差距。 第22頁/共37頁第二十二頁，共38頁。底物濃度對酶反應(yīng)速度(fn yng s d)的影響圖第23頁/共37頁

11、第二十三頁，共38頁。B. 酶活力(hul)單位定義 國際酶學會標準單位：在特定條件下，1分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化(zhunhu)1umol底物的酶量，稱一個國際單位（IU）。 酶活計算公式： 酶活性 (U/g) = A D 1000 0.210150.13 W其中:A 比色測定的木糖量，mg/ml；D 稀釋倍數(shù)；1000 當量換算因數(shù)，mmol- umol ；W 酶樣品重量，g；150.13 木糖的分子量，mg/mmol；10 反應(yīng)時間，分鐘。第24頁/共37頁第二十四頁，共38頁。B. 酶活力(hul)單位定義 木聚糖酶的活性定義A：在測定(cdng)條件下，1秒鐘從燕麥木聚糖中產(chǎn)生1nmol木糖所需

12、的酶量。 酶活計算公式： 酶活（IU）= A D 1,000,000 0.2 600 150.13 W 其中: A 比色測定(cdng)的木糖量，mg/ml； D 稀釋倍數(shù)； 1,000,000 當量換算因數(shù)，mmol- nmol； W 酶樣品重量，g； 150.13 - 木糖的分子量，mg/mmol。 600 反應(yīng)時間，秒。第25頁/共37頁第二十五頁，共38頁。C. 酶反應(yīng)(fnyng)pH值 pH影響酶活力的因素: 影響酶蛋白構(gòu)象，過酸或過堿會使酶變性(binxng)。影響酶和底物分子解離狀態(tài)，尤其是酶活性中心的解離狀態(tài)，最終影響ES形成。影響酶和底物分子中另一些基團解離，這些基團的離子

13、化狀態(tài)影響酶的專一性及活性中心構(gòu)象。影響酶與底物的結(jié)合，極度pH的條件引起酶蛋白的變性(binxng)。第26頁/共37頁第二十六頁，共38頁。C. 酶反應(yīng)(fnyng)pH值最適pH：使酶促反應(yīng)速度達到最大時的介質(zhì)(jizh)pH。 最適pH一般接近在48 之間.第27頁/共37頁第二十七頁，共38頁。D. 酶反應(yīng)(fnyng)溫度 溫度對酶促反應(yīng)速度的影響(yngxing)有兩個方面： 提高溫度，加快反應(yīng)速度。 提高溫度，酶變性失活。 這兩種因素共同作用，在小于最適溫度時，前一種因素為主；在大于最適溫度時，后一種因素為主。 最適溫度就是這兩種因素綜合作用的結(jié)果。 第28頁/共37頁第二十八

14、頁，共38頁。D. 酶反應(yīng)(fnyng)溫度第29頁/共37頁第二十九頁，共38頁。E. 酶反應(yīng)時間 酶反應(yīng)方程式： 隨著生成物濃度的增加，酶反應(yīng)速度減慢( jin mn)，當生成物達到某一濃度，酶反應(yīng)即停止。E + S ES E + PK3K4K1K2第30頁/共37頁第三十頁，共38頁。E. 酶反應(yīng)時間 從圖中可以看到，反應(yīng)速度只在最初一段時間內(nèi)保持恒定，隨著反應(yīng)時間的延長，由于底物濃度降低，產(chǎn)物反饋抑制，逆反應(yīng)速度加快，酶本身失活等因素，使酶促反應(yīng)速度逐漸(zhjin)下降，最后完全停止。第31頁/共37頁第三十一頁，共38頁。E. 酶反應(yīng)時間 在測定酶促反應(yīng)速度(fn yng s d)

15、時，要避免以上干擾因素，必須在酶促反應(yīng)初期進行，在最初這段時間內(nèi)的反應(yīng)速度(fn yng s d)稱之為反應(yīng)初速度，在過量的底物存在下，反應(yīng)初速度與酶濃度成正比。第32頁/共37頁第三十二頁，共38頁。F.激活劑、抑制劑 凡是能提高酶活性的物質(zhì)，都稱為激活劑。 激活劑作用包括兩種情況：一種是由于激活劑的存在，使一些本來有活性的酶活性進一步提高，這一類激活劑主要是離子或簡單有機(yuj)化合物。另一種是激活酶原，無活性有活性，這一類激活劑可能是離子或蛋白質(zhì)。第33頁/共37頁第三十三頁，共38頁。G.舉例(j l) 2種木聚糖酶測定方法的比較(bjio)測定條件測定條件 方法1 方法方法2 溫度

16、溫度 55 50 pH 5.3 5.5緩沖液緩沖液 0.05M醋酸鈉緩沖液 0.1M 醋酸鈉緩沖液 反應(yīng)時間反應(yīng)時間 10min 30min 底物濃度底物濃度 1木聚糖 1.2%木聚糖 加酶量加酶量 0.2ml 1ml 底物量底物量 1.8ml 1ml 反應(yīng)終止液反應(yīng)終止液 DNS 2ml DNS 3ml 顯色時間顯色時間 10min 10min 加水量加水量 10ml 第34頁/共37頁第三十四頁，共38頁。G.舉例(j l)木聚糖酶測定(cdng)結(jié)果標識值(U/g)方法1 (U/g)方法2(U/g)樣本129,00025,868 11,189 樣本250,00039,918 30,583 第35頁/共37頁第三十五頁，共38頁。THE ENDTHANK YOU!第36頁/共37頁第三十六頁，共38頁。謝謝您的觀看