比較亞甲藍(lán)與維拉帕米對(duì)家兔腸道缺血再灌注損傷的保護(hù)作用實(shí)用教案

1、前言前言(qin yn)實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)結(jié)果及總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及總結(jié)比較亞甲藍(lán)與維拉帕米對(duì)家兔腸道缺血再灌注損傷的保護(hù)比較亞甲藍(lán)與維拉帕米對(duì)家兔腸道缺血再灌注損傷的保護(hù)(boh)作用作用實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康牡?頁/共20頁第一頁，共21頁。前言前言(qin yn)多數(shù)情況下，缺血后再灌注可使組織器官功能得到多數(shù)情況下，缺血后再灌注可使組織器官功能得到恢復(fù)，損傷的結(jié)構(gòu)得到修復(fù)，患者病情好轉(zhuǎn)康復(fù)；恢復(fù)，損傷的結(jié)構(gòu)得到修復(fù)，患者病情好轉(zhuǎn)康復(fù)；但有時(shí)缺血后再灌注不僅不能使組織、器官功能但有時(shí)缺血后再灌注不僅不能使組織、器官功能恢復(fù)，反而加重組織、器官的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷?；謴?fù)，反而加重組織

2、、器官的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷。缺血再灌注的損傷主要通過活性氧的作用與鈣超載缺血再灌注的損傷主要通過活性氧的作用與鈣超載兩種途徑，而亞甲藍(lán)與維拉帕米的作用機(jī)制分別是兩種途徑，而亞甲藍(lán)與維拉帕米的作用機(jī)制分別是抑制自由基的細(xì)胞毒性作用與拮抗鈣離子進(jìn)入細(xì)胞，抑制自由基的細(xì)胞毒性作用與拮抗鈣離子進(jìn)入細(xì)胞，因此通過這兩種藥物，可以有效地減小缺血再灌注因此通過這兩種藥物，可以有效地減小缺血再灌注損傷，本實(shí)驗(yàn)旨在損傷，本實(shí)驗(yàn)旨在(zh zi)以這兩種機(jī)制為切入點(diǎn)，以這兩種機(jī)制為切入點(diǎn)，探究以及比較亞甲藍(lán)與維拉帕米這兩種藥物的保護(hù)探究以及比較亞甲藍(lán)與維拉帕米這兩種藥物的保護(hù)作用。作用。第2頁/共20頁第二頁，共

3、21頁。前言前言(qin yn)實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)結(jié)果及總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及總結(jié)比較亞甲藍(lán)與維拉帕米對(duì)家兔比較亞甲藍(lán)與維拉帕米對(duì)家兔( ji t)腸道缺血再灌注損傷的保護(hù)作用腸道缺血再灌注損傷的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康牡?頁/共20頁第三頁，共21頁。實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shyn)目的目的3.3.比較比較(bjio)(bjio)亞甲藍(lán)、維拉帕米這兩種藥亞甲藍(lán)、維拉帕米這兩種藥物對(duì)于小腸缺血物對(duì)于小腸缺血- -再灌注損傷的保護(hù)作用再灌注損傷的保護(hù)作用第4頁/共20頁第四頁，共21頁。前言前言(qin yn)實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)結(jié)果及總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及總結(jié)比較亞甲藍(lán)與維拉帕米對(duì)家兔比

4、較亞甲藍(lán)與維拉帕米對(duì)家兔( ji t)腸道缺血再灌注損傷的保護(hù)作用腸道缺血再灌注損傷的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康牡?頁/共20頁第五頁，共21頁?；钚匝鯔C(jī)制：再灌注后，腸組織產(chǎn)生大量活性氧機(jī)制：再灌注后，腸組織產(chǎn)生大量(dling)活性氧，活性氧攻擊細(xì)胞膜，攻擊蛋白質(zhì)分子使蛋活性氧，活性氧攻擊細(xì)胞膜，攻擊蛋白質(zhì)分子使蛋白質(zhì)分子氧化而發(fā)生變性，還可以攻擊核酸，造成白質(zhì)分子氧化而發(fā)生變性，還可以攻擊核酸，造成細(xì)胞功能障礙。細(xì)胞功能障礙。鈣超載機(jī)制：鈣超載機(jī)制：1.損傷線粒體損傷線粒體2.激活鈣離子依賴性磷脂酶，損傷生物膜激活鈣離子依賴性磷脂酶，損傷生物膜3.促進(jìn)氧自由基生成促進(jìn)氧自由基生成實(shí)驗(yàn)原理實(shí)

5、驗(yàn)原理(yunl)-缺血再缺血再灌注損傷的原理灌注損傷的原理(yunl)第6頁/共20頁第六頁，共21頁。實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shyn)原理原理缺血缺血-再灌注再灌注(gunzh)損傷的損傷的保護(hù)保護(hù)維拉帕米為鈣維拉帕米為鈣離子阻滯劑，離子阻滯劑，可減少鈣內(nèi)流可減少鈣內(nèi)流對(duì)細(xì)胞造成對(duì)細(xì)胞造成(zo chn)的的損傷損傷亞甲藍(lán)具有亞甲藍(lán)具有還原作用，還原作用，可減少氧自可減少氧自由基的細(xì)胞由基的細(xì)胞毒性作用毒性作用產(chǎn)生產(chǎn)生MDAMDA比較兩者作用后產(chǎn)生比較兩者作用后產(chǎn)生的的MDAMDA的量的量第7頁/共20頁第七頁，共21頁。操作操作(cozu)(cozu)原理原理 腸缺血腸缺血-再灌注后，自由基的大量產(chǎn)

6、再灌注后，自由基的大量產(chǎn)生使脂質(zhì)發(fā)生過氧化生使脂質(zhì)發(fā)生過氧化(ynghu)反應(yīng)，反應(yīng)，氧化氧化(ynghu)終產(chǎn)物為丙二醛，會(huì)終產(chǎn)物為丙二醛，會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性，丙二醛數(shù)聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性，丙二醛數(shù)值的增加反應(yīng)細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)破壞的程值的增加反應(yīng)細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)破壞的程度度,因此，以丙二醛的數(shù)值變化來反映因此，以丙二醛的數(shù)值變化來反映家兔腸缺血家兔腸缺血-再灌注損傷程度。再灌注損傷程度。 第8頁/共20頁第八頁，共21頁。前言前言(qin yn)實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)結(jié)果及總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及總結(jié)比較亞甲藍(lán)與維拉帕米對(duì)家

7、兔腸道缺血再灌注比較亞甲藍(lán)與維拉帕米對(duì)家兔腸道缺血再灌注(gunzh)損傷的保護(hù)作用損傷的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康牡?頁/共20頁第九頁，共21頁。實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shyn)(shyn)操作操作123兔急性腸道缺兔急性腸道缺血再灌注損傷血再灌注損傷模型的建立及模型的建立及正常家兔血液正常家兔血液標(biāo)本標(biāo)本(biobn)采集采集實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shyn)動(dòng)物的處理動(dòng)物的處理 標(biāo)本采集及指標(biāo)本采集及指標(biāo)觀察標(biāo)觀察 第10頁/共20頁第十頁，共21頁。實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作(cozu)(cozu)材料材料設(shè)備：光學(xué)顯微鏡、石蠟切片機(jī)、低速離心設(shè)備：光學(xué)顯微鏡、石蠟切片機(jī)、低速離心機(jī)、試管（機(jī)、試管（1212）、一次性醫(yī)

8、用注射器）、一次性醫(yī)用注射器（1515）、分光光度計(jì)、常用手術(shù)）、分光光度計(jì)、常用手術(shù)(shush)(shush)器材、小血管夾器材、小血管夾材料與試劑：材料與試劑：材料：實(shí)驗(yàn)家兔（材料：實(shí)驗(yàn)家兔（6 6）試劑：生理鹽水、水合氯醛溶液、葡萄糖氯試劑：生理鹽水、水合氯醛溶液、葡萄糖氯化鈉注射液、維拉帕米、亞甲藍(lán)溶液、蘇木化鈉注射液、維拉帕米、亞甲藍(lán)溶液、蘇木精染液、伊紅染液、固體石蠟、甲醛溶液、精染液、伊紅染液、固體石蠟、甲醛溶液、LpH7.4 LpH7.4 的的 PBS PBS 、梯度乙醇、二甲苯、梯度乙醇、二甲苯、MDAMDA檢檢測(cè)試劑盒測(cè)試劑盒第11頁/共20頁第十一頁，共21頁。兔急性腸

9、道缺血再灌注損傷模型兔急性腸道缺血再灌注損傷模型(mxng)的建立及正常家兔血液標(biāo)本采的建立及正常家兔血液標(biāo)本采集集 分組：選用健康家兔分組：選用健康家兔(ji t)6(ji t)6只只, ,雌雄雌雄不限，分為甲乙丙三組，每組不限，分為甲乙丙三組，每組2 2只分別編號(hào)只分別編號(hào)為甲為甲A A、B B，乙，乙A A、B B，丙，丙A A、B B。所有家兔。所有家兔(ji t)(ji t)術(shù)前術(shù)前 12 h 12 h 禁食禁食 , ,自由進(jìn)水。自由進(jìn)水。 處理：處理：100 g/ L 水合氯醛水合氯醛(3 mL/ kg)腹腔腹腔(fqing)內(nèi)注射麻醉內(nèi)注射麻醉 耳緣靜脈補(bǔ)充耳緣靜脈補(bǔ)充 50 g

10、/ L葡萄糖氯化葡萄糖氯化鈉注射液鈉注射液(50 mL/ kg) 下腔靜脈穿刺取血下腔靜脈穿刺取血5 mL于于6支試管中支試管中 靜置靜置30 min , 3 000 r/ min 離心離心 15 min后后 - 20 保存保存阻斷腸系膜阻斷腸系膜上動(dòng)脈上動(dòng)脈第12頁/共20頁第十二頁，共21頁。實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shyn)(shyn)動(dòng)物的處理動(dòng)物的處理甲組家兔缺血甲組家兔缺血30min，于，于家兔耳緣靜脈注射生理鹽家兔耳緣靜脈注射生理鹽水水(shnglynshu)5mL，30min后恢復(fù)血流。后恢復(fù)血流。 對(duì)照組家兔對(duì)照組家兔(ji (ji t)t)的實(shí)驗(yàn)處理的實(shí)驗(yàn)處理維拉帕米對(duì)兔小腸缺維拉帕米對(duì)

11、兔小腸缺血再灌注損傷的保護(hù)血再灌注損傷的保護(hù)作用作用亞甲藍(lán)對(duì)兔小腸缺血再亞甲藍(lán)對(duì)兔小腸缺血再灌注損傷的保護(hù)作用灌注損傷的保護(hù)作用乙組家兔缺血30min，以2mg/kg劑量的維拉帕米配制成5mL注射液于家兔耳緣靜脈注射，30min后恢復(fù)血流。丙組家兔缺血30min，以5mg/kg劑量的亞甲藍(lán)配制成5mL注射液于家兔耳緣靜脈注射，30min后恢復(fù)血流。第13頁/共20頁第十三頁，共21頁。標(biāo)本采集及指標(biāo)標(biāo)本采集及指標(biāo)(zhbio)(zhbio)觀察觀察 100 g/ L 100 g/ L 水合氯醛水合氯醛(3 mL/ (3 mL/ kg)kg)腹腔腹腔(fqing)(fqing)內(nèi)注射麻內(nèi)注射麻醉

12、醉 耳緣靜脈耳緣靜脈(jngmi)(jngmi)補(bǔ)充補(bǔ)充 50 g/ L 50 g/ L葡萄葡萄糖氯化鈉注射液糖氯化鈉注射液(50 mL/ kg) (50 mL/ kg) 下腔靜脈穿刺取血下腔靜脈穿刺取血5 5 mLmL于于6 6支試管中支試管中 靜置靜置30 min , 3 000 r/ 30 min , 3 000 r/ min min 離心離心 15 min15 min后后 - 20 - 20 保存保存采用采用 MDA MDA 測(cè)定試劑盒檢測(cè)血測(cè)定試劑盒檢測(cè)血清中清中 MDA MDA 含量的變化含量的變化 各組實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，動(dòng)物處死前，每組家兔于再灌注各組實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，動(dòng)物處死前，每組家兔于再灌

13、注2 h2 h后沿原切口入腹后沿原切口入腹 第14頁/共20頁第十四頁，共21頁。前言前言(qin yn)實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)結(jié)果及總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及總結(jié)比較亞甲藍(lán)與維拉帕米對(duì)家兔腸道缺血再灌注損傷比較亞甲藍(lán)與維拉帕米對(duì)家兔腸道缺血再灌注損傷(snshng)的保護(hù)作用的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康牡?5頁/共20頁第十五頁，共21頁。實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果(ji gu)(ji gu)及總結(jié)及總結(jié)一、家兔實(shí)驗(yàn)前后血標(biāo)本一、家兔實(shí)驗(yàn)前后血標(biāo)本MDAMDA測(cè)量值測(cè)量值 1. 1.儀器值：于波長(zhǎng)儀器值：于波長(zhǎng)450nm450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的酶標(biāo)儀上讀取各孔的的ODOD值值 2. 2.以吸光度

14、以吸光度(gungd)OD(gungd)OD值為縱坐標(biāo)值為縱坐標(biāo)(Y)(Y)，相應(yīng)的相應(yīng)的MDAMDA標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X)(X)，做得相，做得相應(yīng)的曲線，樣品的應(yīng)的曲線，樣品的MDAMDA含量可根據(jù)其含量可根據(jù)其ODOD值由標(biāo)值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。 3. 3.檢測(cè)值范圍：檢測(cè)值范圍：0-80umol/L0-80umol/L 4. 4.敏感度：敏感度： 0.1 umol/L 0.1 umol/L第16頁/共20頁第十六頁，共21頁。實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shyn)(shyn)結(jié)果及總結(jié)結(jié)果及總結(jié)實(shí)驗(yàn)前后血標(biāo)本實(shí)驗(yàn)前后血標(biāo)本(biobn)MDA(biobn)MDA測(cè)量值（單位：測(cè)量值（單位：nmol/Lnmol/L）甲組甲組 乙組乙組 丙組丙組1234第17頁/共20頁第十七頁，共21頁。實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shyn)(shyn)結(jié)果及總結(jié)結(jié)果及總結(jié)二、家兔實(shí)驗(yàn)后小腸黏膜組織病理檢查二、家兔實(shí)驗(yàn)后小腸黏膜組織病理檢查(jinch)評(píng)分評(píng)分實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shyn)后小腸黏膜組織病理檢查評(píng)分后小腸黏膜組織病理檢查評(píng)分甲組甲組 乙組乙組 丙組丙組AB第18頁/共20頁第十八頁，共21頁。薛曉東（組長(zhǎng)）薛曉東（組長(zhǎng)） 汪文龍汪文龍賴雪瑩賴雪瑩 劉云鷺劉云鷺石敏石敏 李睿李睿第19頁/共20頁第十九頁，共21頁。感