酵母蔗糖酶的提取及其性質(zhì)的研究.doc

1、酵母蔗糖酶的提取及其性質(zhì)的研究袁某某（西北農(nóng)林科技大學(xué) 陜西楊凌)摘要采用自溶法從酵母中提取蔗糖酶，即在一定PH和適當(dāng)?shù)臏囟认?，利用組織細(xì)胞內(nèi)自身的酶系統(tǒng)將細(xì)胞破碎再通過(guò)乙醇的分級(jí)與透析,得到純化的酵母蔗糖酶。本實(shí)驗(yàn)也通過(guò)考馬斯亮藍(lán)G250染色法,測(cè)定蔗糖酶的活力和蛋白質(zhì)濃度,對(duì)蔗糖酶的性質(zhì)進(jìn)行了研究。關(guān)鍵詞蔗糖酶，分離提取，酶活力，蛋白質(zhì)含量1 引言自1860年Bertholet從啤酒酵母(Sacchacomyces Cerevisiae）中發(fā)現(xiàn)了蔗糖酶以來(lái),它已被廣泛地進(jìn)行了研究。蔗糖酶(invertase）（D-呋喃果糖苷果糖水解酶）（EC.3。2.1。26）特異地催化非還原糖中的呋喃果

2、糖苷鍵水解，具有相對(duì)專一性。不僅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖,也能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖.2 材料與方法2.1 實(shí)驗(yàn)材料高活性干酵母粉、DEAE纖維束DE23、0。2mol/L TrisHCL緩沖液、牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、葡萄糖、水楊酸、0。4mol/L NaOH溶液2。2 實(shí)驗(yàn)方法2.2.1 蔗糖酶的提取與部分純化 將15g高活性干酵母粉倒入250ml燒杯中，少量多次地加入50ml蒸餾水，攪拌均勻，成糊狀后加入1.5g乙酸鈉、25ml乙酸乙酯，攪勻，再于35恒溫水浴中攪拌30min。抽提補(bǔ)加蒸餾水30ml，攪勻，蓋好,于35恒溫過(guò)夜，8000r/min離心10min，

3、棄沉淀及脂層，的粗級(jí)分。預(yù)先將恒溫水浴調(diào)到50，將盛有粗體級(jí)分的離心管穩(wěn)妥地放入水浴中，不斷輕搖離心管保存30min。取出離心管，于并于中迅速冷卻，4，10000r/min， 離心10min.取上清液，量出體積，留出1.5ml測(cè)定酶活力及蛋白質(zhì)含量（稱為熱級(jí)分）.將熱級(jí)分轉(zhuǎn)入小燒杯中，放入冰鹽浴，逐滴加入等體積預(yù)冷至20的95乙醇,同時(shí)輕輕攪拌30min，再冰鹽浴10min，以沉淀完全。4,10000r/min, 離心10min,棄去上清液，并滴干，沉淀保存于離心管中,蓋上蓋子，然后將其放入冰箱中冷凍保存，即醇級(jí)分。2。2.2 酶活性及酶活力影響因素的研究 采用水楊酸試劑顯色法，通過(guò)測(cè)定反應(yīng)后

4、樣品中還原糖的量來(lái)確定酶活力。（1） 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取做好編號(hào)的試管，按下表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。管號(hào)01234567891020mmol/L葡萄糖/ml0.00.10.20。30.40。50。60。70.80.91.0葡萄糖/mol02468101214161820/ml1.00.90。80.70。60.50.40.30.20.10。0水楊酸試劑/ml22222222222沸水浴5min，流水冷卻，定容至15ml00.1020。1610.2150。2620.3330.3530。3850.4120.4400。479(2) 反應(yīng)時(shí)間的影響 取做好編號(hào)的試管，按下表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。管號(hào)123456789100.2

5、mol/L蔗糖/ml0.20。20。20.20。20。20.20.20.20。2乙酸緩沖液pH5。0/ml0。20。20.20。20。20.20。20.20。20。2/ml0.20.20.20.20。20。20。20.20.20。60.4mol/L NaOH/ml1。0由加酶開(kāi)始計(jì)時(shí)蔗糖酶/ml0。40.40.40。40.40.40。40。40.4反應(yīng)時(shí)間/min0136101520304050反應(yīng)時(shí)間到后立即向210管加入1ml 0。4mol/L NaOH終止反應(yīng).并向各管加入2ml 3，5-二硝基水楊酸,沸水浴準(zhǔn)確煮5min后，迅速流水冷卻，用水定容至15ml0。1160.1870。314

6、0.3940.3230.7170。8321.0041.3290.016生成還原糖mol/ml0.1620。3730。7510。9890.7781。9502。2922.8033.770（3） pH值的影響 取做好編號(hào)的試管,按下表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。管號(hào)123456780.2mol/L蔗糖/ml0.20。20。20。20.20.20.20。2乙酸緩沖液pH3。54。04.55.05.56。0pH梯度/ml0.20。20。20.20.20。2/ml0.80。20.4mol/L NaOH/ml1。0蔗糖酶/ml0。60.60.60.60.60.60。660準(zhǔn)確反應(yīng)10min0.4mol/L NaOH/ml1.

7、01.01。01。01.01.01.0水楊酸試劑/ml2.02。02.02.02。02。02.02。0沸水浴5min后，迅速流水冷卻，用水定容至15ml0。0211.0331。0221.0691。3031。2621。2140。837生成還原糖mol/ml2。8902。8572。9973。6933.5713.4282。307（4） 溫度的影響 取做好編號(hào)的試管，按下表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。管號(hào)123456789100.2mol/L蔗糖/ml0。20。20。20。20。20。20.20。20.20。2乙酸緩沖液pH5。0/ml0。20.20。20。20.20。20。20.20.20.2/ml0。60.60.6

8、0。60.6蔗糖酶/ml0.60。60.60.60。6溫度/40405050606070708080反應(yīng)時(shí)間/min0136101520304050各溫度反應(yīng)10min后，每管加入1ml 0。4mol/L NaOH終止反應(yīng).并向各管加入2ml 3，5二硝基水楊酸,沸水浴準(zhǔn)確煮5min后,迅速流水冷卻，用水定容至15ml0.963-0.0170.702-0.0201。194-0。0150.536-0.0030.5420。013生成還原糖mol/ml2。68141。9053。3681.4111。429（5） 底物濃度的影響 取做好編號(hào)的試管，按下表進(jìn)行實(shí)驗(yàn).管號(hào)123456780。5mol/L蔗糖

9、/l02030406080100200/l600580570560540520500400乙酸緩沖液pH5。0/l200200200200200200200200蔗糖酶/ml20020020020020020020020060準(zhǔn)確反應(yīng)10min0.4mol/L NaOH/ml1.01。01。01。01.01.01.01。0水楊酸試劑/ml2。02。02.02。02。02.02。02。0沸水浴5min后，迅速流水冷卻，用水定容至15ml0.0500。1690。2040.2690。3540。3720。3900。545生成還原糖mol/ml0.3200。4240.6170.8700.9240.977

10、1。438（6） 脲對(duì)蔗糖酶的抑制作用 取做好編號(hào)的試管，按下表進(jìn)行實(shí)驗(yàn).管號(hào)123456789100。5mol/L蔗糖/l0000202020203030蔗糖酶/l200200200200200200200200200200乙酸緩沖液pH5。0/l2002002002002002002002002002004mol/L脲/l010020030001002003000100/l60050040030058048038028057047060準(zhǔn)確反應(yīng)10min0.4mol/L NaOH/ml1。01。01.01.01.01.01.01.01。01.0水楊酸試劑/ml2.02.02。02。02。0

11、2。02。02.02.02.0沸水浴5min后，迅速流水冷卻,用水定容至15ml0。0460。0600.0550。0540.3160.3140。2650。1820。3870。306生成還原糖mol/ml0。7570.7510。6050.3580。9680。727管號(hào)1112131415161718192021220.5mol/L蔗糖/l303040404040606060608080蔗糖酶/l200200200200200200200200200200200200乙酸緩沖液pH5.0/l2002002002002002002002002002002002004mol/L脲/l200200010

12、020030001002003000100/l37027056046036026054044034024052042060準(zhǔn)確反應(yīng)10min0.4mol/L NaOH/ml1。01。01。01。01。01。01。01。01.01。01.01。0水楊酸試劑/ml2.02.02。02。02。02。02。02.02。02.02。02。0沸水浴5min后，迅速流水冷卻，用水定容至15ml0.2280.2050.4600。3760。3610.3020.6640.5620.4680.4331.0880.916生成還原糖mol/ml0.4950。4271。1850。9350.8920。7151.7921.4

13、891.2091.1053。0532。542管號(hào)232425262728293031320.5mol/L蔗糖/l8080100100100100200200200200蔗糖酶/l200200200200200200200200200200乙酸緩沖液pH5.0/l2002002002002002002002002002004mol/L脲/l20030001002003000100200300/l32022050040030020040030020010060準(zhǔn)確反應(yīng)10min0.4mol/L NaOH/ml1。01。01。01.01。01。01。01.01。01。0水楊酸試劑/ml2。02.02

14、.02.02。02.02.02。02。02.0沸水浴5min后,迅速流水冷卻，用水定容至15ml0.6880.4951.0670。8910.6850.6021。0290.9800。7370。676生成還原糖mol/ml1.8631。2892.9912。4671.8551.6082。8782。7322。0091。8282。2.3離子交換柱層析純化蔗糖酶(1）以DEAE纖維素DE23為吸附劑，處理好后加少量水邊攪拌邊倒入層析管中，緩慢沉降，并以100ml 0。02mol/LpH7.0Tis-HCL緩沖液過(guò)柱,調(diào)整流速為5ml/2min.平衡后,采用100ml 0。02mol/LpH7.0Tis-H

15、CL緩沖液和100ml（含0。2ml/LNaCL）0。02mol/LpH7.0TisHCL緩沖液，進(jìn)行線性梯度洗脫.（2)用3ml緩沖液醇級(jí)分,留取1ml用于測(cè)酶活力及蛋白含量.剩余的4000r/min離心1min,除去不溶物，取上清液小心地加到層析柱上（上樣前在柱床表面加一張同一大小的檸檬紙)。開(kāi)始洗脫后，連續(xù)收集洗脫液,每試管收集10ml。每試管分別取0。6ml洗脫液，置于不同的試管中,分別加入0。2ml 0。2mol/L蔗糖，0.2ml 0。2mol/L pH為5。0的乙酸緩沖液及2ml水楊酸，沸水浴5min后觀察各試管中溶液顏色，將顏色最深的四個(gè)試管對(duì)應(yīng)的洗脫液試管中的溶液合并。(3）

16、將合并的洗脫液濃縮后取1ml用于測(cè)酶活力及蛋白含量(柱級(jí)分），剩余的使用PEG2000透析濃縮液用于進(jìn)一步離子交換柱層析純化.按步驟（1）（2）重復(fù)實(shí)驗(yàn)（注意上樣之后立即收集洗脫液）,得柱級(jí)分.2.2.4蔗糖酶各級(jí)分活性及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定各級(jí)分蛋白質(zhì)含量的測(cè)定（1） 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取做好編號(hào)的試管，按下表進(jìn)行實(shí)驗(yàn).管號(hào)012345678910牛血清蛋白/ml0。00.10.20.30.40。50。60。70。80。91。0牛血清蛋白/g0.020406080100120140160180200/ml1。00。90.80.70.60。50.40。30.20.10。0考馬斯亮藍(lán)G-250/ml55

17、5555555550.000.1110.2640。3400.5260.7080。8600。9601。1461.2081。297（2） 各級(jí)分蛋白質(zhì)含量的測(cè)定各級(jí)分按以下稀釋倍數(shù)稀釋：粗級(jí)分-5倍；熱級(jí)分-5倍；醇級(jí)分-10倍;柱級(jí)分-10倍。 取做好編號(hào)的試管，按下表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。管號(hào)0級(jí)分級(jí)分級(jí)分級(jí)分12345678酶液/ml011111111/ml100000000加入考馬斯亮藍(lán)G-250各5m，混勻后靜置2min后在595nm測(cè)吸光度1.2041。2000。8630。8530.4170.3210。1420。147平均值1。2.20.8580.3690。1445蛋白質(zhì)濃度g/ml29。7462

18、1.0029。1913.768酶活力的測(cè)定 采用水楊酸試劑顯色法,通過(guò)測(cè)定反應(yīng)后樣品中還原糖的量來(lái)確定酶活力.（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作管號(hào)01234567891020mmol/葡萄糖/ml0.00。10。20。30。40。50。60.70.80.91。0葡萄糖/mol02468101214161820/ml1.00。90。80。70.60.50。40.30.20.10.0水楊酸試劑/ml22222222222沸水浴5min，流水冷卻,定容至15ml00。1020.1610。2150.2620.3330。3530.3850.4120.4400.479（2） 各級(jí)分酶活力大小的測(cè)定取做好編號(hào)的試管，按

19、下表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。管號(hào)對(duì)照級(jí)分級(jí)分級(jí)分級(jí)分級(jí)分123456789101112酶液/ml0.00。60。60。60.60.60.60.60。60.60.6/ml0.6乙酸緩沖液pH5。0/ml0。20.20。20。20.20.20。20。20。20.20.20.4mol/L NaOH/ml10。2mol/L蔗糖/ml0.20。20。20。20。20。20。20。20.20.20.2加入蔗糖，立即搖勻開(kāi)始計(jì)時(shí),室溫反應(yīng)10min,反應(yīng)后向312試管中加入NaOH終止反應(yīng)水楊酸試劑/ml2。02.02。02.02.02。02.02。02.02.02。02。0沸水浴5min后，迅速流水冷卻，用水定容至15

20、ml0.7200.6810.5560.6250。2400。2230.1270.1500.1380.135生成還原糖mol/ml1.9581。8431。4711.6760。5310.4800.1950.2630.2280。2192。2。5 分離產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳檢測(cè)分離膠（ml）濃縮膠（ml）H2O8。27。35Acr-Bis6.681。3分離膠緩沖液pH8.85.0濃縮膠緩沖液pH6.81。2510%SDS0.10。110%APS0.070.06TEMED(最后加)0。040。1將玻璃板洗凈、晾干、固定。按照實(shí)驗(yàn)要求,配制12%的分離膠,迅速注入玻璃板夾層中，上部用乙醇封面，保持膠面平

21、整。待分離膠聚合后，配制5%的濃縮膠，倒去分離膠表面的乙醇，然后灌入濃縮膠，插入點(diǎn)樣梳.拔出樣品梳后加入緩沖液，點(diǎn)樣取10l標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶解液于EP管內(nèi)，加入10l2倍樣品緩沖液，上樣量為20l；取10l樣品（五個(gè)級(jí)分），再加入10l2倍樣品緩沖液，上樣量為20l。接通電源進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，輕輕撬開(kāi)兩層玻璃，取出凝膠,并切角以作記號(hào)(戴手套，防止污染膠面）。加入染色液,染色過(guò)夜。將染好色的凝膠板直接放入脫色液中脫色，并拍照.3 數(shù)據(jù)分析與結(jié)果3.1 吸光度對(duì)葡萄糖濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線：3.1。1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)物濃度的影響分析由圖可知，在一定范圍內(nèi)反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，產(chǎn)物濃度越高.反應(yīng)初速度V（還原糖）=0

22、。3305mol/ml3.1。3 pH值對(duì)酶促反應(yīng)影響分析 由圖可計(jì)算出當(dāng)pH值為3.6477時(shí)，生成還原糖量最多，即酵母蔗糖酶最適反應(yīng)pH值為3。64777。3。1.4 溫度對(duì)酶促反應(yīng)影響分析由圖可計(jì)算出,當(dāng)溫度為49時(shí)，生成還原糖量最多，即酵母蔗糖酶最適反應(yīng)溫度為49.3.1。5 底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)的影響分析由圖可計(jì)算出=2。733.1.6 脲對(duì)蔗糖酶酶促反應(yīng)的影響分析當(dāng)脲素濃度為0時(shí)1/Vmax=1。1083 Km/ Vmax =8。5677故Km=7。911 Vmax=0.902當(dāng)脲素濃度為26.67（umol/ml)時(shí)1/Vmax=1.399 Km/ Vmax =15。494故Km=-11.075 Vmax=0。715當(dāng)脲素濃度為53。33（umol/ml)時(shí)1/Vmax=3.4956 Km/ Vmax =22。474故Km=6。429 Vmax=-0.286當(dāng)脲素濃度為80(umol/ml）時(shí)1/Vmax=1。046 Km/ Vmax=18.