微生物學實驗教學大綱18頁

1、課程編號：微生物學實驗教學大綱學時數(shù)：108 講課：108 學制：四年制本科適合專業(yè)：生物科學相關專業(yè)一、本課程的性質(zhì)和任務（一）課程的性質(zhì)：微生物學實驗主要任務是使學生掌握研究與應用微生物的主要方法與技術，包括經(jīng)典的、常規(guī)的、以及現(xiàn)代的方法與技術，使學生具有適應于從事相關學科的基礎理論研究與實際生產(chǎn)應用的微生物學實驗技能。提高學生分析問題和解決問題的能力。根據(jù)本學科的特點，逐步使學生認識微生物的基本特性，比較它們與其它生物的相似和不同之處，知道如何研究微生物以及對研究中所出現(xiàn)的問題點樣分析，并加以解決。（二）課程的任務：微生物學實驗是生物學重要的基礎課之一，要求學生熟悉微生物學方法與技術，掌

2、握無菌操作技能和建立無菌概念是微生物學實驗中最重要的內(nèi)容，重點掌握最基本的無菌操作技能，如接種、純培養(yǎng)、計數(shù)等。二、本課程與其他課程的聯(lián)系：1. 通過教師示范、講解與學生實際操作相結合方法，使學生牢固樹立無菌概念，掌握顯微鏡的使用、生物染色技術、形態(tài)學觀察的方法、微生物計數(shù)、培養(yǎng)基的配置和滅菌方法、微生物分離、純化等基本操作技能，基本了解常用的儀器設備的基本原理、構造、使用方法及使用中的注意事項，樹立嚴謹求實的科學態(tài)度，提高觀察、分析問題和解決問題的能力，培養(yǎng)勤儉節(jié)約、愛護公物和相互協(xié)作的優(yōu)良作風。2. 本實驗課內(nèi)容包括驗證性實驗、綜合性實驗兩個部分。驗證性實驗主要通過光學顯微鏡鏡檢觀察方法進

3、行教學，綜合實驗在教師指導下學生根據(jù)所掌握的理論基礎和實驗技能，由學生自己動手完成。實驗過程要求學生仔細觀察實驗現(xiàn)象，完整記錄原始實驗數(shù)據(jù)、結果，分析實驗現(xiàn)象并認真填寫實驗報告。三、教學內(nèi)容（一）實驗一 實驗室安全教育與微生物學實驗室常用的器皿目的要求掌握實驗室安全規(guī)則，了解微生物學實驗所用的器皿，因其大多要進行消毒、滅菌和用來培養(yǎng)微生物，因此了解其質(zhì)量、洗滌和包裝方法的要求。實驗內(nèi)容一、器皿的種類、要求與應用：1、試管大試管(約18mm×180mm) :可裝倒平板用的培養(yǎng)基；可作制備斜面用；裝液體培養(yǎng)基用于微生物的振蕩培養(yǎng) 中試管(1315)mm×(100150)mm:

4、裝液體培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌或做斜面用；用于細菌、霉菌、病毒等的稀釋和血清學試驗。小試管(1012)mm×100mm:一般用于糖發(fā)酵或血清學試驗，和其它需要節(jié)省材料的試驗。2、容量瓶主要用于準確配制一定濃度的溶液，它是一種細長頸、梨形的平底玻璃瓶，配有磨口塞，瓶頸上刻有標線。3、量筒用來量取液體體積的一種玻璃儀器，外壁上有刻度。常用量筒的規(guī)格有5ml、10ml、25ml、50ml、100ml、250ml等。4、三角瓶用來裝無菌水、培養(yǎng)基和振蕩培養(yǎng)微生物等。5、燒杯呈圓柱形，頂部的一側開有一個槽口，便于傾倒液體，有些燒杯外壁標有刻度，可以粗略地估計燒杯中液體的體積，這種燒杯叫印標燒杯，也叫刻度

5、燒杯，其分度并不十分精確，允許誤差一般在±5%。6、燒瓶 通常具有圓肚細頸的外觀，因瓶口很窄，不適用玻璃棒攪拌，若需要攪拌時，可以手握瓶口輕微轉(zhuǎn)動手腕即可順利攪拌混勻。燒瓶隨其外觀的不同分為圓底燒瓶和平底燒瓶兩種，通常平底燒瓶用在室溫下的反應，而圓底燒瓶則用在較高溫的反應，這是因為圓底燒瓶的玻璃厚薄較均勻，可承受較大的溫度變化。7、三角燒瓶（錐形瓶）錐形瓶瓶體較長，底大而口小，盛入溶液后，重心靠下，極便于手持振蕩，故常用于容量分析中作滴定容器。也可以供加熱、煮沸、貯存、消毒各種液體用，常用容量有：100ml、250ml、500ml、1000ml等。8、燒杯 用來配制培養(yǎng)基與各種溶液等

6、。9、離心管常用的有0.5ml、1.5ml、10ml、15ml、20ml等規(guī)格，其上有刻度，專供離心機使用。主要用于微生物分子生物學實驗中，小量菌體的離心，DNA或RNA的檢測和提取等。10、移液管和吸管均用于吸取和轉(zhuǎn)移少量液體。移液管上刻有標線，在標明的溫度下，當吸取溶液至彎月面與標線相切后，讓溶液自然放出，此時所放出溶液的體積即等于管上所標的體積。常用的移液管有1mL、2mL、5mL、1OmL等。吸管常用的規(guī)格有兩種：一種為無刻度的毛細管；另一種為有刻度吸管，管壁有精細的刻度。一般長為25cm，常用的容量為0.2mL、0.5mL、1mL、2mL、5mL、1OmL。11、染色缸有方形和圓形兩

7、種，方形的較大，可放10張載玻片，圓形的較小，可放5張載玻片，供細菌、血液及組織切片的標本染色用。12、漏斗 分短頸和長頸式兩種。漏斗直徑大小不等，有60mm、100mm和150mm等幾種不同規(guī)格，供分裝溶液或者上墊濾紙、紗布、棉花作過濾雜質(zhì)用。13、滴瓶 有橡皮帽式和玻塞式，分無色和棕色，容量有30mL和60mL等，供儲存試劑或染色液用。14、下口瓶分為有龍頭和無龍頭兩種。容量有2500mL、5000mL兩種規(guī)格。供存放蒸餾水或常用的消毒藥液用。15、培養(yǎng)皿由一底一蓋組成一套，常用的培養(yǎng)皿皿底直徑90 mm，高15mm,皿底皿蓋均為玻璃制成。在培養(yǎng)皿內(nèi)倒入適量固體培養(yǎng)基制成平板，可用于分離、

8、純化、鑒定菌種、活菌計數(shù)以及測定抗生素、噬菌體的效價等。16、載玻片及蓋玻片 載玻片主要用于微生物涂片、染色，做形態(tài)觀察等。另有凹玻片，就是在一塊厚玻片當中有一圓形凹窩，做懸滴觀察活細菌及血清學試驗用。蓋玻片為極薄的玻片，用于標本封閉及懸滴標本等。17、德漢氏小管觀察細菌在糖發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)產(chǎn)氣情況時，一般在小試管內(nèi)再套一倒置的小套管（約6mm×36mm），此小管即為德漢氏小管，又稱發(fā)酵小套管。18、雙層瓶由內(nèi)外兩個玻璃瓶組成，內(nèi)層小錐形瓶放香柏油，供油鏡觀察微生物時使用，外層瓶放二甲苯，用以擦凈油鏡頭。19、接種工具接種工具有接種環(huán)，接種針，接種鉤，接種鏟，玻璃涂布器等。為細菌學檢驗工

9、作中接種、分離細菌或挑取菌落制作涂片所必不可少的工具。接種環(huán)常裝于鋁質(zhì)的握柄上，用壞后可隨時更換。二、玻璃器皿的洗滌方法1、新玻璃器皿的洗滌 在2%的鹽酸溶液中浸泡數(shù)小時，用自來水沖洗干凈。2、舊玻璃器皿的洗滌（1）試管、培養(yǎng)皿、三角瓶：洗衣粉和去污粉洗刷，自來水沖洗。A 裝有固體培養(yǎng)基：刮掉，洗滌。B 帶菌的器皿：2%來蘇爾或0.25%新潔爾滅消毒液中浸泡24小時或煮沸0.5小時，然后洗滌。C 帶病原菌培養(yǎng)物的器皿：先高壓蒸汽滅菌，倒去培養(yǎng)物。（2）玻璃吸管：吸管尖端與裝在水龍頭上的橡皮管連接，反復沖洗。A 吸過血液、血清、糖溶液或染料溶液等的玻璃吸管：立即投入盛有自來水的容器中浸泡，實驗后

10、集中沖洗。B 塞有棉花的吸管：用水將棉花沖出，然后沖洗。C 吸過含有微生物培養(yǎng)物的吸管：2%來蘇爾或0.25%新潔爾滅消毒液中浸泡24小時然后洗。D 吸管內(nèi)壁有油垢：洗滌液中浸泡數(shù)小時，再沖洗。洗凈后的試管倒置于試管筐內(nèi)，三角瓶倒置于洗滌架上，培養(yǎng)皿的皿底和皿蓋分開，依次壓著皿邊排列倒扣在桌上,晾干。洗滌后，若內(nèi)壁的水均勻分布成一薄層，表示完全洗凈，若還掛有水珠，則需用洗滌液浸泡數(shù)小時，然后再用自來水沖洗。 三、各種器皿的包扎1、培養(yǎng)皿的包扎：培養(yǎng)皿常用舊報紙緊緊包裹（也可用金屬筒包裝），一包710套，包好后干熱或濕熱滅菌。 2、吸管的包扎：在上端約0.5cm處，塞入一小段1.5 cm長的棉花

11、（勿用脫脂棉），目的是避免將外界或嘴中雜菌吹入管內(nèi)，或不慎將菌液吸出管外。然后用45 cm寬的長紙條包扎。3、試管和三角瓶等的包扎： 試管口和三角瓶瓶口塞棉花塞或硅膠塞；用二層報紙包扎好（如有牛皮紙，效果更好），進行干熱或濕熱滅菌。試管較多時，一般7個或10個一組，再用雙層報紙包扎。附：棉塞的制作：棉塞可過濾空氣，防止雜菌侵入并可減緩培養(yǎng)基水份的蒸發(fā)，故在微生物工作中一直普遍使用著。做棉塞的要求：松緊適中，不能太松也不能太緊，太松達不到濾菌的目的，并且易脫落，太緊通氣不好，操作不便，做到手拿不掉，又易轉(zhuǎn)動；深淺適度，棉塞總長1.5寸左右，約有1/3在試管外，2/3在試管內(nèi)，順時針方向塞入。棉花

12、要求采用普通棉花，它能防潮不易吸水，不要用脫脂藥棉，它易吸水又昂貴。（由教師示范）實驗材料和用品 以上所有器皿。（二）實驗二 環(huán)境微生物的檢查目的要求1、證明實驗室環(huán)境與體表存在微生物；2、比較來自不同場所與不同條件下細菌的數(shù)量和類型；3、觀察不同類群微生物的菌落形態(tài)特征；4、體會無菌操作的重要性。實驗原理平板培養(yǎng)基含有細菌生長所需要的營養(yǎng)成分，當取自不同來源的樣品接種于培養(yǎng)基上，在合宜溫度下培養(yǎng)，1-2d內(nèi)每一菌體即能通過很多次細胞分裂而進行繁殖，形成一個可見的細胞群體的集落，稱為菌落。每一種細菌所形成的菌落都有它自己的特點，例如菌落的大小，表面干燥或濕潤、隆起或扁平、粗糙或光滑，邊緣整齊或

13、不整齊，菌落透明或半透明或不透明，顏色以及質(zhì)地疏松或緊密等。因此，可通過平板培養(yǎng)來檢查環(huán)境中細菌的數(shù)量和類型。實驗內(nèi)容1、環(huán)境微生物的檢測：倒平板、接種環(huán)境微生物；2、滅菌器皿的準備：學習包扎平皿、移液管。實驗材料和用品1、材料：環(huán)境中各種微生物；2、用品：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、無菌平皿、移液管、平皿、酒精燈、牛皮紙、記號筆。（三）實驗三 顯微鏡的構造、性能和使用方法目的要求1、學習掌握油鏡的規(guī)范使用方法；2、復習掌握光學顯微鏡的基本結構及使用方法。實驗原理油鏡工作原理：1、增加照明亮度；2、顯微鏡的分辨力：指顯微鏡能夠辨別兩點之間最小距離的能力。它與接物鏡的數(shù)值孔徑成正比，與光的波長成反比。分

14、辨力=（1/2光波長度）/數(shù)值孔徑實驗內(nèi)容1、復習顯微鏡的使用方法；2、油鏡的使用原理、操作要點（包括清潔方法）；3、當堂考核油鏡使用方法，合格方能通過。實驗材料和用品學生顯微鏡、細菌三型裝片；雙層瓶(內(nèi)裝香柏油和乙醚酒精擦拭液)、擦鏡紙。（四）實驗四 細菌的簡單染色與顯微觀察目的要求1、學習微生物涂片、染色的基本技術，掌握細菌的簡單染色法；2、初步認識細菌的個體形態(tài)、菌落形態(tài)特征；3、鞏固顯微鏡(油鏡)的使用方法和無菌操作技術。實驗原理簡單染色法是利用單一染料對細菌進行染色的一種方法。此法操作簡便，適用于菌體一般形狀和細菌排列的觀察。常用堿性染料進行簡單染色，這是因為：在中性、堿性或弱酸性溶

15、液中，細菌細胞通常帶負電荷，而堿性染料在電離時，其分子的染色部分帶正電荷(酸性染料電離時，其分子的染色部分帶正電荷)，因此堿性染料的染色部分很容易與細菌結合使細菌著色。染色后的細菌細胞與背景形成鮮明的對比，在顯微鏡下更易于識別。常用作簡單染色的染料有：美藍、結晶紫、堿性復紅等。當細菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降時，細菌所帶正電荷增加，此時可用伊紅、酸性復紅或剛果紅等酸性染料染色。實驗內(nèi)容1、微生物菌落形態(tài)的觀察：幾種代表類型微生物菌落形態(tài)特征了解、辨識；2、細菌簡單染色及個體形態(tài)的觀察：無菌接種操作；涂片、干燥、固定、染色、水洗、干燥、鏡檢。實驗材料和用品1、材料：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、環(huán)

16、境微生物檢測平板；2、用品：學生顯微鏡、酒精燈、載玻片、接種環(huán)、雙層瓶(內(nèi)裝香柏油和乙醚酒精擦拭液)、擦鏡紙；呂氏堿性美藍染液(或草酸銨結晶紫染液)。（五）實驗五 革蘭氏染色目的要求1、學習并初步掌握革蘭氏染色法；2、了解革蘭氏染色法的原理及其在細菌分類鑒定中的重要性。實驗原理革蘭氏染色法是細菌學中最重要的鑒別染色法，是1884年由丹麥病理學家Christain Gram氏創(chuàng)立的，而后一些學者在此基礎上作了某些改進。該染色法能將細菌分為G菌和G菌，是基于這兩類細菌的細胞壁結構和成分不同。G菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質(zhì)，增

17、加了細胞壁的通透性，使初染的結晶紫和碘的復合物易于滲出，結果細菌就被脫色，再經(jīng)番紅復染后就成紅色。G菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細菌仍保留初染時的顏色。實驗內(nèi)容1、革蘭氏染色法基本步驟：制片初染媒染脫色復染鏡檢；2、染色成敗原因分析；3、實驗操作考核一。實驗材料和用品1、材料：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌；2、用品：學生顯微鏡、酒精燈、載玻片、接種環(huán)、雙層瓶(內(nèi)裝香柏油和乙醚酒精擦拭液)、擦鏡紙；革蘭氏染色液(結晶紫染液、盧戈氏碘液、95乙醇、番紅液)。（六）實驗六 細菌的芽孢染色法目的要求1、學習并掌握芽孢染色法。2、觀察

18、芽孢的形態(tài)特征：形狀、大小及著生位置。實驗原理芽孢染色法是利用芽孢和菌體對染色體的親合力的不同的原理，用不同的染色體進行著色，使芽孢和菌體呈不同的顏色而便于區(qū)別。芽孢壁厚，透性低，著色、脫色均較困難，所以我們必須采取著色力強、濃度高的孔雀綠染液（5%）進行染色：染色過程中延長染色時間，10分鐘（一般為23分鐘）并且在加熱條件下進行染色。進入菌體的染料可經(jīng)水洗脫色，而進入芽孢的染料則難以透出，若再利用復染液進行復染，此時菌體就被染成紅色，而芽孢難以著色，仍呈綠色。實驗內(nèi)容1、涂片：將培養(yǎng)24小時枯草桿菌作涂片、干燥、固定。 2、染色：涂片上蓋上一張2.5×2cm濾紙片，在上面滴加56滴

19、孔雀綠（不易過多，以鋪滿濾紙為宜），用鑷子加在載玻片在火焰上徐徐加熱，使燃料冒蒸汽（但不沸騰），切勿使燃料蒸干，隨時添加染色液，保持10分鐘（從冒蒸汽時開始計時）。 3、沖洗：取下冷卻，取掉濾紙，沖洗至孔雀綠不再退色為止。 4、復染：用番紅液復染12分鐘，水洗，氣干。 5、鏡檢：待干燥后，置油鏡觀察，芽孢呈綠色，菌體呈紅色。實驗材料和用品1、材料：枯草芽孢桿菌1-2d牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)物、梭狀芽胞桿菌1-2d牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)物；2、用品：5孔雀綠水溶液、0.5%番紅水溶液、無菌水、香柏油、二甲苯；普通光學顯微鏡、擦鏡紙、綢布、酒精燈、載玻片、接種針、培養(yǎng)皿、雙層瓶（內(nèi)裝香柏油和二

20、甲苯）、試管夾等。 （七）實驗七 細菌鞭毛染色及運動性觀察目的要求1、學習并初步掌握鞭毛染色法，觀察細菌鞭毛的形態(tài)特征；2、學習用壓滴法觀察細菌的運動性。實驗原理鞭毛是細菌的運動“器官”，細菌是否具有鞭毛，以及鞭毛著生的位置和數(shù)目是細菌的一項重要形態(tài)特征。細菌的鞭毛很纖細，其直徑通常為0.010.02微米，所以，除了很少數(shù)能形成鞭毛束(由許多根鞭毛構成)的細菌可以用相差顯微鏡直接觀察到鞭毛束的存在外，一般細菌的鞭毛均不能用光學顯微鏡直接觀察到，而只能用電子顯微鏡觀察。要用普通光學顯微鏡觀察細菌的鞭毛，必須用鞭毛染色法。實驗內(nèi)容1、硝酸銀染色法染色；2、壓滴法觀察細菌的運動性。實驗材料和用品1、

21、材料：變形桿菌；2、用品：學生顯微鏡、酒精燈、載玻片、接種環(huán)、雙層瓶(內(nèi)裝香柏油和乙醚酒精擦拭液)、擦鏡紙；鞭毛染色液(鞭毛染色液A、鞭毛染色液B)。（八）實驗八 酵母菌的形態(tài)觀察及死活細胞的鑒別目的要求1、觀察酵母菌的形態(tài)及出芽生殖方式，學習區(qū)分酵母菌死活細胞的實驗方法。2、掌握酵母菌的一般形態(tài)特征及其與細菌的區(qū)別。實驗原理酵母菌是不運動的單細胞真核微生物，其大小通常比常見細菌大幾倍甚至十幾倍。美藍是一種無毒性的染料，它的氧化型呈藍色，還原型無色。用美藍對酵母的活細胞進行染色時，由于細胞的新陳代謝作用，細胞內(nèi)具有較強的還原能力，能使美藍由藍色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型，因此，具有還原能力的酵母

22、活細胞是無色的、而死細胞或代謝作用微弱的衰老細胞則呈藍色或淡藍色，借此即可對酵母菌的死細胞和活細胞進行鑒別。實驗內(nèi)容酵母菌的形態(tài)觀察及死活細胞的鑒別。實驗材料和用品1、材料：釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；2、用品：學生顯微鏡、酒精燈、載玻片、接種環(huán)；0.05和O.1呂氏堿性美藍染色液。（九）實驗九 霉菌的形態(tài)觀察目的要求1、學習并掌握觀察霉菌形態(tài)的基本方法；2、初步了解霉菌的形態(tài)特征。實驗原理霉菌的形態(tài)結構觀察：霉菌可產(chǎn)生復雜分枝的菌絲體，分為基內(nèi)菌絲和氣生菌絲，氣生菌絲生長到一定階段分化產(chǎn)生繁殖菌絲，由繁殖菌絲產(chǎn)生孢子。霉菌菌絲體(尤其是繁殖菌絲)及孢子的形態(tài)

23、特征是識別不同種類霉菌的重要依據(jù)。霉菌菌絲和孢子的寬度通常比細菌和放線菌粗得多(約為310微米)，常是細菌菌體寬度的幾倍至幾十倍，因此，用低倍顯微鏡即可觀察。實驗內(nèi)容霉菌的觀察（試管直接觀察法）。實驗材料和用品1、材料：細黃鏈霉菌或青色鏈霉菌、黑曲霉、根霉；2、用品：學生顯微鏡、體視鏡、酒精燈、載玻片、鑷子等。（十）實驗十 培養(yǎng)基的配制與滅菌目的要求1、了解培養(yǎng)基的配制原理；2、通過對基礎培養(yǎng)基的配制，掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟；3、了解常見滅菌、清毒基本原理及方法；掌握干熱天菌、高壓蒸汽滅菌及過濾除菌的操作方法。實驗原理培養(yǎng)基是人工按一定比例配制的供微生物生長繁殖和合成代謝產(chǎn)物所需要的營

24、養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基的原材料可分為碳源、氮源、無機鹽、生長因素和水。根據(jù)微生物的種類和實驗目的不同，培養(yǎng)基也有不同的種類和配制方法。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養(yǎng)基，有時又稱為普通培養(yǎng)基。由于這種培養(yǎng)基中含有一般細胞生長繁殖所需要的最基本的營養(yǎng)物質(zhì)，所以可供微生物生長繁殖之用?；A培養(yǎng)基含有牛肉膏，蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏為微生物提供碳源、能源、磷酸鹽和維生素，蛋白胨主要提供氮源和維生素，而NaCl提供無機鹽。由于這種培養(yǎng)基多用于培養(yǎng)細菌，因此要用稀酸或稀堿將其pH調(diào)至中性或微堿性，以利于細菌的生長繁殖。干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌方法主要是通過升溫使蛋白質(zhì)變性從而達

25、到殺死微生物的效果。干熱滅菌是利用高溫使微生物細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關，在菌體受熱時，當環(huán)境和細胞內(nèi)含水量越大，則蛋白質(zhì)凝固就越快，反之含水量越小，凝固緩慢。高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。從而使沸點增高，得到高于100的溫度。導致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。實驗內(nèi)容1、配制牛肉膏蛋白胨等培養(yǎng)基；2、高壓蒸汽滅菌方法滅菌。實驗材料和用品1、試劑：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂粉；2、用品：試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、培養(yǎng)基、分裝器、天平、牛角匙、pH度紙、棉

26、花、牛皮紙、記號筆、麻繩、紗布、移液管、高壓蒸汽滅菌鍋等。（十一）實驗十一 微生物的分離與純化目的要求掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化微生物的基本操作技術。實驗原理從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。微生物在自然界中呈混雜狀態(tài)存在，要獲得所需菌種，必須從中進行分離。在保藏菌種時不慎污染時也需予以分離。 分離純化方法很多，基本原理相似，即將待分離樣品進行一定的稀釋，并使微生物的細胞（或孢子）盡量以分散狀態(tài)存在，然后使其長成一個個純種單菌落。分離純化常用的方法有：1、簡易單細胞挑取法它需要特制的顯微操縱器或其他顯微技術，因而其使用受到限制。2、平板分

27、離法： 選擇適合于待分離微生物的生長條件，如營養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等要求,或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其他微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物 微生物在固體培養(yǎng)基上生長形成的單個菌落，通常是由一個細胞繁殖而成的集合體。因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。獲取單個菌落的方法可通過稀釋涂布平板或平板劃線等技術完成。實驗內(nèi)容1、土樣樣品的采集；2、倒平板；3、平板涂布法；4、制備土壤稀釋液；5、稀釋傾注法。實驗材料和用品1、 材料：校園土、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（12ml）；2、 用品：無菌培養(yǎng)皿、無菌刮鏟、1ml無菌吸管、盛 9ml無菌水試管 6支、盛90ml無菌水三角

28、瓶一個、酒精燈等。（十二）實驗十二 微生物的培養(yǎng)特征目的要求1、了解不同的微生物在瓊脂平板、斜面上、和液體培養(yǎng)基中的生長特點。2、懂得微生物接種技術的重要性與應用面；3、能描述微生物在瓊脂平板、斜面上、和液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)特征。實驗原理 微生物的培養(yǎng)特征是指微生物在固體、半固體和液體培養(yǎng)基中生長后所表現(xiàn)出的群體形態(tài)特征。不同的微生物有其固有的培養(yǎng)特征，這些特征一般用固體、半固體和液體培養(yǎng)基來進行檢測。實驗內(nèi)容1、斜面接種；2、穿刺接種；3、液體培養(yǎng)基接種；4、培養(yǎng)；5、細菌在固體斜面培養(yǎng)特征的觀察與描述；6、細菌在半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)特征的觀察與描述；7、細菌在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)特征的觀察與描述。實

29、驗材料和用品1、 材料：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌；2、 用品：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、接種環(huán)、接種針、無菌吸管、酒精燈等。（十三）實驗十三 菌種保藏目的要求學習并掌握菌種保藏的基本原理，比較幾種不同的保藏方法。實驗原理微生物具有容易變異的特性，因此，在保藏過程中，必須使微生物的代謝處于最不活躍或相對靜止的狀態(tài)，才能在一定的時間內(nèi)使其不發(fā)生變異而又保持生活能力。低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，所以，菌種保藏方法雖多，但都是根據(jù)這三個因素而設計的。1、傳代培養(yǎng)保藏法又有斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、皰肉培養(yǎng)基培養(yǎng)等（后者作保藏厭氧細菌用），培養(yǎng)后于46冰箱內(nèi)保存。 2、液體石蠟覆蓋保藏法

30、是傳代培養(yǎng)的變相方法，能夠適當延長保藏時間，它是在斜面培養(yǎng)物和穿刺培養(yǎng)物上面覆蓋滅菌的液體石蠟，一方面可防止因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而引起菌種死亡，另一方面可阻止氧氣進入，以減弱代謝作用。3、冷凍保藏法可分低溫冰箱（-20-30，-50-80）、干冰酒精快速凍結（約-70）和液氮（-196）等保藏法。4、冷凍干燥保藏法先使微生物在極低溫度（-70左右）下快速冷凍，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分（真空干燥）。有些方法如濾紙保藏法、液氮保藏法和冷凍干燥保藏法等均需使用保護劑來制備細胞懸液，以防止因冷凍或水分不斷升華對細胞的損害。保護性溶質(zhì)可通過氫和離子鍵對水和細胞所產(chǎn)生的親和力來穩(wěn)定細胞成分的構型。保護

31、劑有牛乳、血清、糖類、甘油、二甲亞砜等。實驗內(nèi)容1、 斜面低溫保藏法；2、 液體石蠟保藏法；3、 液氮冷凍保藏法；4、 冷凍干燥保藏法。實驗材料和用品1、材料：大腸桿菌、酵母菌，放線菌和霉菌；2、用品：肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，滅菌脫脂牛乳，滅菌水，化學純的液體石蠟，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黃土或紅土，冰塊、食鹽，干冰，95酒精，10鹽酸，無水氯化鈣；滅菌吸管，滅菌滴管，滅菌培養(yǎng)皿，管形安瓿管，淚滴形安瓿管（長頸球形底），40目與 100目篩子，油紙，濾紙條（0.5×1.2cm），干燥器，真空泵，真空壓力表，噴燈，L形五通管,冰箱，低溫冰箱（-30），液氮冷凍保藏器。（十四）實驗十四

32、微生物數(shù)量的測定目的要求1、學習平板菌落計數(shù)的基本原理和方法；2、了解光電比濁計數(shù)法的原理，學習、掌握光電比濁計數(shù)法的操作方法；3、了解血細胞計數(shù)板計數(shù)的原理，掌握使用血細胞計數(shù)板進行微生物計數(shù)的方法。實驗原理平板菌落計數(shù)法是將待測樣品經(jīng)適當稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個細胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個單細胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落。為了清楚地闡述平板菌落計數(shù)的結果，現(xiàn)在已傾向使用菌落形成單位(colony -forming units，cfu)而不以絕對菌落數(shù)來表示樣品的活菌含量。當光線通過微生物菌懸液時，由于菌體的散射及吸收作用使光線的透過量降低。在一定的范

33、圍內(nèi)，微生物細胞濃度與透光度成反比，與光密度成正比，而光密度或透光度可以由光電池精確測出。因此，可用一系列已知菌數(shù)的菌懸液測定光密度，作出光密度-菌數(shù)標準曲線。因此，對于不同微生物的菌懸液進行光電比濁計數(shù)應采用相同的菌株和培養(yǎng)條件制作標準曲線。顯微鏡直接計數(shù)法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上(又稱計菌器)，于顯微鏡下直接計數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。實驗內(nèi)容1、平板計數(shù)法；2、光電計數(shù)法；3、直接計數(shù)法(顯微鏡)；4、實驗操作考核二。實驗材料和用品1、材料：大腸桿菌；2、用品：學生顯微鏡、血細胞計數(shù)板、計數(shù)器、分光光度計、蓋玻片、無菌毛細滴管、無菌平皿、無

34、菌試管、無菌移液管、酒精燈、涂棒、鑷子、記號筆等；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、無菌生理鹽水。（十五）實驗十五 理化因素對微生物的影響目的要求1、了解常用化學消毒劑對微生物的作用；2、了解紫外線對微生物的作用；實驗原理常用化學消毒劑主要有重金屬及其鹽類、酚、醇、醛等有機溶劑、鹵族元素及其化合物、染料和表面活性劑等。重金屬離子可與菌體蛋白質(zhì)結合而使之變性或與某些酶蛋白的巰基相結合而使酶失活；有機溶劑可使蛋白質(zhì)及核酸變性，也可破壞細胞膜透性使內(nèi)含物外溢；碘可與蛋白質(zhì)酪氨酸殘基不可逆結合而使蛋白質(zhì)失活，氯氣與水發(fā)生反應產(chǎn)生的強氧化劑也具有殺菌作用；染料在低濃度條件下可抑制細菌生長。紫外線滅菌是用紫外線燈進行的。波長為200-300nm的紫外線都有殺菌能力，其中以260nm的殺菌力最強。在波長一定的條件下，紫外線的殺菌效率與強度和時間的乘積成正比。紫外線殺菌機制主要是因為它誘導了胸腺嘧啶二聚體的形成和DNA鏈的交聯(lián)，從而抑制了DNA的復制。另一方面，由于輻射能使空氣中的氧電離成O，再使O2氧化生成自臭氧(O3)或使水(H2O)氧化生成過氧化氫(H2O2)。O3和H2O2均有殺菌作用。實驗內(nèi)容1、化學因素對微生物的影響；2、物理因素對微生物的影響；實驗材料和用品1、材料：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌；2、用品：酒精燈、接種環(huán)、記號筆、紫外燈等；牛肉膏蛋白胨平板；0.1%升汞、10