PCR引物設(shè)計(jì)原理

1、1會計(jì)學(xué)PCR引物設(shè)計(jì)原理引物設(shè)計(jì)原理 哺乳動物哺乳動物 DNA DNA 為模板時(shí)，至少進(jìn)行為模板時(shí)，至少進(jìn)行2525個(gè)循環(huán)個(gè)循環(huán)才能得到足夠量的擴(kuò)增產(chǎn)物。一般為才能得到足夠量的擴(kuò)增產(chǎn)物。一般為30-3330-33個(gè)個(gè)循環(huán)。循環(huán)。 正向引物正向引物 （forward primerforward primer）：處于：處于DNADNA雙鏈上游的引物。如雙鏈上游的引物。如用于測序，則從用于測序，則從5 533方向讀出方向讀出 DNADNA正鏈的序列。正鏈的序列。 反向引物反向引物 （Reverse primerReverse primer）：處于目的：處于目的DNADNA雙鏈下游的引物雙鏈下游的引

2、物。如用于測序，則讀出。如用于測序，則讀出 DNADNA負(fù)鏈從下游到上游的反向序列。負(fù)鏈從下游到上游的反向序列。 反向（反向（reversedreversed）互補(bǔ)（互補(bǔ)（complementedcomplemented） Search criteriaSearch criteria 窗口：多種參數(shù)可以調(diào)整。窗口：多種參數(shù)可以調(diào)整。Primer LengthPrimer Length常設(shè)置在常設(shè)置在181830bp,30bp,短了特異性不好，長了沒有必要。短了特異性不好，長了沒有必要。當(dāng)然有特殊要求的除外，如加個(gè)酶當(dāng)然有特殊要求的除外，如加個(gè)酶切位點(diǎn)什么的。切位點(diǎn)什么的。PCR Product

3、 sizePCR Product size最好是最好是100100500bp500bp之間，小于之間，小于100bp100bp的的PCRPCR產(chǎn)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳出來，條帶很模物瓊脂糖凝膠電泳出來，條帶很模糊，不好看。至于上限倒也不必要糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。求苛刻。ManualManualSearch parameters Search parameters 人工搜索參數(shù)設(shè)置窗口人工搜索參數(shù)設(shè)置窗口。Search stringencySearch stringency應(yīng)選應(yīng)選HighHigh。GCGC含量一般是含量一般是40406060。其它參數(shù)默認(rèn)就可以。其它參數(shù)默認(rèn)就可以。

4、Search progress Search progress 窗口中顯示窗口中顯示Search CompletedOKSearch CompletedOK鍵鍵結(jié)果窗口結(jié)果窗口有三種顯示形式，上游引物、下游引物和成對顯示。有三種顯示形式，上游引物、下游引物和成對顯示。引物按優(yōu)劣次序排列，滿分為引物按優(yōu)劣次序排列，滿分為100100。選其中的一對引物，在主。選其中的一對引物，在主窗口顯示結(jié)果。窗口顯示結(jié)果。對于上述引物，如果其它各項(xiàng)指對于上述引物，如果其它各項(xiàng)指標(biāo)還可以，可在引物末端去掉一標(biāo)還可以，可在引物末端去掉一個(gè)不滿意的或加上一個(gè)堿基，看個(gè)不滿意的或加上一個(gè)堿基，看看引物的評估參數(shù)有沒有變

5、好點(diǎn)看引物的評估參數(shù)有沒有變好點(diǎn)。搜索出來的引物，按搜索出來的引物，按RatingRating排序排序，逐個(gè)送，逐個(gè)送OligoOligo軟件里評估。軟件里評估。當(dāng)然，搜索出的引物，其擴(kuò)增產(chǎn)當(dāng)然，搜索出的引物，其擴(kuò)增產(chǎn)物很短，你可以不選擇它。物很短，你可以不選擇它。引物引物3 3端端2 2個(gè)個(gè)A A或或T,T,或引物內(nèi)部或引物內(nèi)部連續(xù)的連續(xù)的G G或或C C太多，或引物太多，或引物3 3端端2 2個(gè)個(gè)G G或或C C，這樣的引物應(yīng)作，這樣的引物應(yīng)作為次選，沒得選了就選它。為次選，沒得選了就選它。該圖分為四部分：最上面是圖示模板及產(chǎn)物位置，該圖分為四部分：最上面是圖示模板及產(chǎn)物位置，“S”S”和

6、和“A”A”可查看有義鏈可查看有義鏈或反義鏈的引物。右邊是兩個(gè)引物在模板上結(jié)合位置的直觀圖；第二層是?；蚍戳x鏈的引物。右邊是兩個(gè)引物在模板上結(jié)合位置的直觀圖；第二層是模板及引物序列的配對情況；第三層顯示引物的各種參數(shù)。板及引物序列的配對情況；第三層顯示引物的各種參數(shù)。注意：尾末給出該注意：尾末給出該引物的最佳退火溫度引物的最佳退火溫度！第四層：四種重要指標(biāo)的分析！第四層：四種重要指標(biāo)的分析引物長度：引物長度：控制著引物的特異性和在控制著引物的特異性和在PCR反應(yīng)中的退火反應(yīng)中的退火溫度。長的溫度。長的PCR引物能給擴(kuò)增帶來更好的特異性，可以引物能給擴(kuò)增帶來更好的特異性，可以通過降低退火溫度提高

7、反應(yīng)的靈敏度，不過長引物易形通過降低退火溫度提高反應(yīng)的靈敏度，不過長引物易形成包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)二聚體自身互補(bǔ)等二級結(jié)構(gòu)。適宜引物成包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)二聚體自身互補(bǔ)等二級結(jié)構(gòu)。適宜引物長度為長度為18-27 nt。Tm 融鏈溫度融鏈溫度：根據(jù)相：根據(jù)相鄰二堿基對作用原理來鄰二堿基對作用原理來計(jì)算融鏈溫度。計(jì)算融鏈溫度。PCR 反反應(yīng)的合適應(yīng)的合適 Tm 范圍為范圍為56-63 （50-70）GC% 含量含量：對于：對于PCR 反應(yīng)來說反應(yīng)來說 GC含量在含量在50% 左右比左右比較合適。較合適。（40-60%,45-55%）Degeneracy多義性多義性，盡量減少，盡量減少引物多義性，這樣會帶來更好引物

8、多義性，這樣會帶來更好的特異性，盡量避免的特異性，盡量避免3末端末端的多義性，因?yàn)檫@個(gè)位置即使的多義性，因?yàn)檫@個(gè)位置即使一個(gè)堿基的錯(cuò)配都能阻止引物一個(gè)堿基的錯(cuò)配都能阻止引物延伸。延伸。 在在Choose Search SetChoose Search Set欄中：欄中：DatabaseDatabase根據(jù)預(yù)操作基根據(jù)預(yù)操作基因的種屬定了，可選因的種屬定了，可選Human genomic + transcriptHuman genomic + transcript或或OthersOthers 在在Program SelectionProgram Selection中：選擇中：選擇Somewhat

9、 similar Somewhat similar sequences (blastn)sequences (blastn)項(xiàng)，如下圖：項(xiàng)，如下圖： 在此界面最下面關(guān)鍵要點(diǎn)擊在此界面最下面關(guān)鍵要點(diǎn)擊Algorithm parametersAlgorithm parameters參參數(shù)設(shè)置，進(jìn)入?yún)?shù)設(shè)置界面。數(shù)設(shè)置，進(jìn)入?yún)?shù)設(shè)置界面。 在在General ParametersGeneral Parameters中：中：Expect thressholdExpect thresshold期望閾值須改為期望閾值須改為10001000，大于，大于10001000也可以；在也可以；在Word sizeW

10、ord size的下拉框?qū)?shù)字改為的下拉框?qū)?shù)字改為7 7。 圖中圖中：序列與引物匹配的得分值小于：序列與引物匹配的得分值小于4040分、分、40405050分、分、50-8050-80分、分、80-20080-200分等分等，分值越高，特異性越好；，分值越高，特異性越好；線段代表上或下游線段代表上或下游引物引物，其顏色和上面對照后就可得出該條引物的分值。兩線段，其顏色和上面對照后就可得出該條引物的分值。兩線段間沒有連線的，表示單條引物與該基因一致。有連線的代表這間沒有連線的，表示單條引物與該基因一致。有連線的代表這些序列與上游引物匹配（些序列與上游引物匹配（Strand=Plus/PlusS

11、trand=Plus/Plus）、并與下游引物）、并與下游引物互補(bǔ)（互補(bǔ)（Strand=Plus/MinusStrand=Plus/Minus），），理論上可以擴(kuò)增出基因片斷。理論上可以擴(kuò)增出基因片斷。點(diǎn)擊線段，就能跳轉(zhuǎn)到該基因的結(jié)果信息概要。點(diǎn)擊線段，就能跳轉(zhuǎn)到該基因的結(jié)果信息概要。Accession，數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫系列的身份證：點(diǎn)系列的身份證：點(diǎn)擊之后可以獲得該擊之后可以獲得該序列的信息序列的信息Desscription序序列列的簡單描述的簡單描述高的就是有兩線段間高的就是有兩線段間有連線的有連線的代表隨機(jī)匹配的可代表隨機(jī)匹配的可能性能性。E值值接近零時(shí)接近零時(shí)最有意義，也就是最有意義，也就

12、是說序列完全匹配了說序列完全匹配了。比對到的序列長度比對到的序列長度E值越小為好！值越小為好！匹配上的堿基數(shù)占總匹配上的堿基數(shù)占總序列長度的比例序列長度的比例缺失或插入，用缺失或插入，用“-”來表來表示示Query1、2表示輸入表示輸入的兩對引物，的兩對引物，Sbjct表表示在庫里比對的序列示在庫里比對的序列默認(rèn)的參數(shù)實(shí)際上是從默認(rèn)的參數(shù)實(shí)際上是從100到到1000，這個(gè)你得自己改，如果你希望產(chǎn)，這個(gè)你得自己改，如果你希望產(chǎn)物的大小符合你的預(yù)期，盡可能把物的大小符合你的預(yù)期，盡可能把范圍改小，比如范圍改小，比如480-500 至于至于RT-PCR所用的引物，最好是所用的引物，最好是使得產(chǎn)物跨過

13、內(nèi)含子，這樣避免潛使得產(chǎn)物跨過內(nèi)含子，這樣避免潛在在DNA對對RT-PCR的干擾。的干擾。 用用OligoOligo軟件設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)/ /評估評估PCRPCR引物引物 啟動啟動OligoOligo，選擇，選擇FileFileopenopen，打開要進(jìn)行引物分析，打開要進(jìn)行引物分析的序列。的序列。圖中顯示的三個(gè)指標(biāo)：圖中顯示的三個(gè)指標(biāo)：TmTm值、值、GG和和 Frequencies Frequencies。退火溫度窗口是設(shè)計(jì)引物退火溫度窗口是設(shè)計(jì)引物的的主窗口主窗口，其他兩個(gè)具有，其他兩個(gè)具有輔助輔助作用。作用。因?yàn)榉治鲆婕岸鄠€(gè)指標(biāo)，啟動窗口的因?yàn)榉治鲆婕岸鄠€(gè)指標(biāo)，啟動窗口的Cascade

14、 Cascade 排列排列方式不太方便，可從方式不太方便，可從windowswindows菜單改為菜單改為TileTile方式。方式。用用TileTile方式方式顯示窗口顯示窗口圈出來的序列部分及黃色的圈出來的序列部分及黃色的barbar即即代表當(dāng)前分析的代表當(dāng)前分析的2121個(gè)堿基的個(gè)堿基的TmTm值值 可點(diǎn)擊窗口的左下角的可點(diǎn)擊窗口的左下角的UpperUpper、LowerLower按鈕選擇上游引物、下游引物。按鈕選擇上游引物、下游引物。 TmTm值似乎太低了值似乎太低了TmTm值似乎太高了值似乎太高了顯示了裝載的整個(gè)序列的顯示了裝載的整個(gè)序列的 6-7 mers6-7 mers寡核苷酸順

15、序寡核苷酸順序的相對頻率。寡核苷酸的的相對頻率。寡核苷酸的3 3端如果在一個(gè)特定端如果在一個(gè)特定的數(shù)據(jù)庫（的數(shù)據(jù)庫（GenBankGenBank的子數(shù)據(jù)庫）更普遍（即的子數(shù)據(jù)庫）更普遍（即出現(xiàn)的頻率更高），那么更容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)出現(xiàn)的頻率更高），那么更容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)。FrequenciesFrequencies，堿基頻率窗口，堿基頻率窗口如果選擇出現(xiàn)頻率較低的位點(diǎn)作為如果選擇出現(xiàn)頻率較低的位點(diǎn)作為3 3末端，那么就減少了在末端，那么就減少了在復(fù)雜的底物（比如整個(gè)復(fù)雜的底物（比如整個(gè)基因組基因組DNADNA）內(nèi)的許多位點(diǎn)結(jié)合）內(nèi)的許多位點(diǎn)結(jié)合、引發(fā)的幾率，從而減少了非特異性、引發(fā)的幾率，從而減

16、少了非特異性PCRPCR產(chǎn)物的形成。產(chǎn)物的形成。 平均頻率為平均頻率為10001000的話，的話，CTTGGCCTTGGC的頻率為的頻率為15001500以上，而以上，而TTGGCGTTGGCG德頻率很低，約德頻率很低，約300300。GG，序列內(nèi)部堿基穩(wěn)定性窗口，序列內(nèi)部堿基穩(wěn)定性窗口 顯示了寡核苷酸的內(nèi)部穩(wěn)定顯示了寡核苷酸的內(nèi)部穩(wěn)定性性( (五聚體的自有能五聚體的自有能) )。-1.9-1.9值值=-=-（3.1+3.1+3.1+1.63.1+3.1+3.1+1.6）GG值反應(yīng)了序列與模板的結(jié)合強(qiáng)度；值反應(yīng)了序列與模板的結(jié)合強(qiáng)度；最好引物的最好引物的GG值在值在55端和中間值比較高，而端和

17、中間值比較高，而在在33端相對低。端相對低。dAdCdGdTdA-1.9-1.3-1.6-1.5dC-1.9-3.1-3.6-1.6dG-1.6-3.1-3.1-1.3dT-1.0-1.6-1.9-1.9第二個(gè)核苷酸第二個(gè)核苷酸第一個(gè)（第一個(gè)（55）核苷酸）核苷酸例子：例子：雙鏈雙鏈d d（ACGG/CCGTACGG/CCGT）的）的GG是：是： G G（ACGGACGG）=G=G（ACAC）+ +GG（CGCG）+ +GG（GGGG） =- =-（1.3+3.6+3.11.3+3.6+3.1）=-8.0kcol/mol=-8.0kcol/mol 顯示了顯示了3 3末端序列末端序列GG值較值較

18、低，適合引發(fā)。低，適合引發(fā)。 3 3末端序末端序列列GG太太高。高。你可以在三個(gè)窗口你可以在三個(gè)窗口中自行設(shè)計(jì)引物中自行設(shè)計(jì)引物。選擇了自己認(rèn)為順眼選擇了自己認(rèn)為順眼的位置，此時(shí)，的位置，此時(shí)，點(diǎn)擊點(diǎn)擊UperUper，上游，上游引物即可顯示。引物即可顯示。同時(shí)在序列下游尋找同時(shí)在序列下游尋找下游引物，點(diǎn)擊下游引物，點(diǎn)擊LowerLower，即可顯示，即可顯示下游引物。下游引物。對你設(shè)計(jì)的引物對你設(shè)計(jì)的引物質(zhì)量進(jìn)一步分析。質(zhì)量進(jìn)一步分析。同時(shí)在序列下游尋找同時(shí)在序列下游尋找下游引物，點(diǎn)擊下游引物，點(diǎn)擊LowerLower，即可顯示，即可顯示下游引物。下游引物。 參數(shù)設(shè)置與搜索選擇參數(shù)設(shè)置與搜索

19、選擇searchfor primers and probessearchfor primers and probes，進(jìn)行如右圖設(shè)置。，進(jìn)行如右圖設(shè)置。 點(diǎn)擊點(diǎn)擊search rangessearch ranges，設(shè)置引物范圍和，設(shè)置引物范圍和 PCR PCR產(chǎn)物的大小產(chǎn)物的大小 點(diǎn)擊點(diǎn)擊parametersparameters，進(jìn)行參數(shù)設(shè)置。，進(jìn)行參數(shù)設(shè)置。因?yàn)樵O(shè)計(jì)的是一對引物，正、負(fù)鏈的復(fù)選框因?yàn)樵O(shè)計(jì)的是一對引物，正、負(fù)鏈的復(fù)選框都要選上。同時(shí)選都要選上。同時(shí)選compatible pairscompatible pairs默認(rèn)下，默認(rèn)下，對引物的要求對引物的要求：無二：無二聚體、聚體、

20、33高度特異、高度特異、GC%GC%含量有限定、去除錯(cuò)誤引發(fā)含量有限定、去除錯(cuò)誤引發(fā)引物等。引物等。 Primer LengthPrimer Length設(shè)設(shè)置在置在181830bp,30bp,短短了特異性不好，了特異性不好，長了沒有必要長了沒有必要; ; PCR Product sizePCR Product size最好是最好是100100500bp500bp之間，小于之間，小于100bp100bp的的PCRPCR產(chǎn)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳出來，條帶很物瓊脂糖凝膠電泳出來，條帶很模糊。上限沒有太多的限定。模糊。上限沒有太多的限定。 普通設(shè)置、參數(shù)及更多參數(shù)普通設(shè)置、參數(shù)及更多參數(shù) 從高到低六個(gè)等

21、級的設(shè)從高到低六個(gè)等級的設(shè)定，最后有一個(gè)用戶定定，最后有一個(gè)用戶定制選項(xiàng)。當(dāng)對軟件功能制選項(xiàng)。當(dāng)對軟件功能不了解時(shí)，應(yīng)選不了解時(shí)，應(yīng)選very very high/Highhigh/High。 選選automatically change automatically change string string 后，搜索引物時(shí)，如后，搜索引物時(shí)，如果在高等級設(shè)定中無法搜索果在高等級設(shè)定中無法搜索到引物對時(shí)自動降級一個(gè)等到引物對時(shí)自動降級一個(gè)等級來搜索，直到找到為止。級來搜索，直到找到為止。反向引物時(shí)用反向引物時(shí)用讓引物的長度可以改變，讓引物的長度可以改變，以適應(yīng)設(shè)定的以適應(yīng)設(shè)定的TmTm值或值或P

22、EPE（prime Efficeinceprime Efficeince）值（引發(fā)效率）。值（引發(fā)效率）。可以限定所選引物對的最可以限定所選引物對的最大數(shù)目。大數(shù)目。實(shí)際上需要我們改動的只實(shí)際上需要我們改動的只有有引物的長度引物的長度，根據(jù)實(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求做相應(yīng)改動。驗(yàn)需求做相應(yīng)改動。其他的參數(shù)就使用其他的參數(shù)就使用OligoOligo默認(rèn)值，一般無需改動默認(rèn)值，一般無需改動。直接使用直接使用OligoOligo默認(rèn)值，默認(rèn)值，一般也無需改變。一般也無需改變。 參數(shù)設(shè)置完畢后，點(diǎn)擊確認(rèn)參數(shù)設(shè)置完畢后，點(diǎn)擊確認(rèn)OKOK，程序即進(jìn)行引物搜，程序即進(jìn)行引物搜索。索。引物搜索結(jié)果如入：引物搜索結(jié)果如入

23、：OligoOligo提供了按引物位提供了按引物位置、產(chǎn)物大小、退火溫置、產(chǎn)物大小、退火溫度、度、GCGC含量等的排列含量等的排列方式。方式。OligoOligo最突出的功能不在于引物搜索最突出的功能不在于引物搜索而在于引物分析而在于引物分析。它提供了多種分析方法并以不同的形式展現(xiàn)出來。它提供了多種分析方法并以不同的形式展現(xiàn)出來。選擇其中的一對引物，這時(shí)程序自動彈出一個(gè)選擇其中的一對引物，這時(shí)程序自動彈出一個(gè)PCRPCR分分析窗口。析窗口。PCRPCRoptimal annealing temperature optimal annealing temperature （最佳（最佳退火溫度）數(shù)

24、值得參考。在退火溫度）數(shù)值得參考。在PCRPCR摸索條摸索條件的時(shí)候，退火溫度為其數(shù)值加減件的時(shí)候，退火溫度為其數(shù)值加減2 2的的范圍就可以了。范圍就可以了。產(chǎn)物產(chǎn)物TmTm值與引值與引物物TmTm值（低的那個(gè)值（低的那個(gè)）的差異，一般控制在）的差異，一般控制在2020度以內(nèi)。度以內(nèi)。引引物間物間TmTm值的差異，一值的差異，一般控制在般控制在5-65-6度以內(nèi)。度以內(nèi)。引發(fā)效率：上（下）引物對引發(fā)效率：上（下）引物對于正、負(fù)鏈正確引發(fā)效率比于正、負(fù)鏈正確引發(fā)效率比。最佳引物濃度最佳引物濃度在在Analyze Analyze 菜單中，菜單中，Oligo Oligo 提供了眾多分提供了眾多分析功

25、能。選擇相應(yīng)的析功能。選擇相應(yīng)的功能，分析結(jié)果。功能，分析結(jié)果。Key InfoKey InfoDuplex formation Duplex formation ，引物二聚體，引物二聚體引物二聚體是影響引物二聚體是影響PCRPCR反應(yīng)異常的重要因素反應(yīng)異常的重要因素應(yīng)避免，至少也要使應(yīng)避免，至少也要使設(shè)計(jì)的引物形成的二聚體是不穩(wěn)定的，即其設(shè)計(jì)的引物形成的二聚體是不穩(wěn)定的，即其GG值應(yīng)該偏低值應(yīng)該偏低由由退退火溫度火溫度決定，決定，5050的退火溫度和的退火溫度和6565對二聚體的影響肯定不一樣對二聚體的影響肯定不一樣。The most stable 3-Dimer The most stab

26、le 3-Dimer Delta GDelta G絕對值一般不要超絕對值一般不要超過過4.5kcal/mol4.5kcal/mol。G G絕對絕對值越大結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。值越大結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。結(jié)合堿基對不要超過結(jié)合堿基對不要超過3 3個(gè)個(gè)。the most stable Dimer overallthe most stable Dimer overall絕對值一般應(yīng)小于多少絕對值一般應(yīng)小于多少kcal/molkcal/mol跟跟PCRPCR退火溫度有關(guān)退火溫度有關(guān)。實(shí)驗(yàn)表明在。實(shí)驗(yàn)表明在PCRPCR退火溫度退火溫度6565時(shí)，時(shí)，6.7kcal/mol6.7kcal/mol沒有問題沒有問題。Hairpi

27、n formation Hairpin formation ，引物發(fā)夾結(jié)構(gòu)，引物發(fā)夾結(jié)構(gòu)Delta GDelta G絕對值一般不要絕對值一般不要超過超過4.5kcal/mol4.5kcal/mol。結(jié)合堿基對不要超過結(jié)合堿基對不要超過3 3個(gè)個(gè)。特定的發(fā)夾如果沒有顯示特定的發(fā)夾如果沒有顯示TmTm值，值，那么發(fā)夾結(jié)構(gòu)就不容易形成那么發(fā)夾結(jié)構(gòu)就不容易形成 。結(jié)合堿基對已經(jīng)超過結(jié)合堿基對已經(jīng)超過3 3個(gè)個(gè)。在在3 3形成發(fā)夾會引發(fā)形成發(fā)夾會引發(fā)引物內(nèi)部的延伸反應(yīng)引物內(nèi)部的延伸反應(yīng)，減少了參加正式反，減少了參加正式反應(yīng)引物的數(shù)量應(yīng)引物的數(shù)量。Composition and TmComposition

28、 and Tm上下游引物的上下游引物的GCGC控制在控制在40406060。最后一種是最后一種是Primer5Primer5所采所采用的方法。用的方法。Td is a normalized Tm in Td is a normalized Tm in 1M salt conditions1M salt conditionsthe Tm is a variable value, that the Tm is a variable value, that depends on salt and DNA depends on salt and DNA concentration set in the

29、 Search concentration set in the Search Parameters windowParameters windowTmTm值高時(shí)錯(cuò)配很少值高時(shí)錯(cuò)配很少，特異性強(qiáng)。，特異性強(qiáng)。False priming sitesFalse priming sites，錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)，錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)oligooligo會給會給正確引發(fā)效率正確引發(fā)效率和和錯(cuò)錯(cuò)誤引發(fā)效率誤引發(fā)效率。一般的原則：使誤引發(fā)效率一般的原則：使誤引發(fā)效率控制在控制在100100以下。以下。有時(shí)候有時(shí)候正確位點(diǎn)的引發(fā)效率正確位點(diǎn)的引發(fā)效率很很高的話，比如達(dá)到高的話，比如達(dá)到400400500500，錯(cuò)誤引發(fā)效率

30、超過錯(cuò)誤引發(fā)效率超過100100幅度若幅度若不大的話，也可以接受。不大的話，也可以接受。PrimerPrimer的的priming efficiencypriming efficiency應(yīng)該應(yīng)該是錯(cuò)配地方的是錯(cuò)配地方的4 4倍左右，更多倍左右，更多當(dāng)然更好。當(dāng)然更好。下游引物對下游引物對于負(fù)鏈，沒于負(fù)鏈，沒有發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤有發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤引發(fā)。引發(fā)。Selected OligoSelected OligoPrimer pairsPrimer pairs系統(tǒng)設(shè)計(jì)出的所有引物對系統(tǒng)設(shè)計(jì)出的所有引物對。internal stabilityinternal stabilityInternal stability

31、Internal stability很重要：我們希望引物的內(nèi)部穩(wěn)定性是中很重要：我們希望引物的內(nèi)部穩(wěn)定性是中間高、兩邊低的弧形，最起碼保證間高、兩邊低的弧形，最起碼保證3 3端不要過于穩(wěn)定。端不要過于穩(wěn)定。引物引物3 3端過于穩(wěn)定，很端過于穩(wěn)定，很容易導(dǎo)致不適當(dāng)擴(kuò)增。容易導(dǎo)致不適當(dāng)擴(kuò)增。上游引物的參數(shù)上游引物的參數(shù)注意：注意：必需把方框拉到上游引物處必需把方框拉到上游引物處。對應(yīng)的下游引物的對應(yīng)的下游引物的參數(shù)參數(shù)注意：注意：必需把方框拉到下游引物處必需把方框拉到下游引物處。Hybridization timeHybridization time，雜交時(shí)間，雜交時(shí)間該窗口顯示了不同長度、不同濃

32、度的該窗口顯示了不同長度、不同濃度的寡核苷酸的雜交時(shí)間寡核苷酸的雜交時(shí)間 ConcentrationConcentration您只需點(diǎn)一下鼠標(biāo)，就輕您只需點(diǎn)一下鼠標(biāo)，就輕松地實(shí)現(xiàn)對你地引物、松地實(shí)現(xiàn)對你地引物、PCRPCR產(chǎn)物、產(chǎn)物、DNADNA模版鏈即模版鏈即時(shí)的濃度、體積、時(shí)的濃度、體積、ODOD值值、分子量的轉(zhuǎn)換。、分子量的轉(zhuǎn)換。該濃度窗口是一個(gè)強(qiáng)大的該濃度窗口是一個(gè)強(qiáng)大的時(shí)間保存計(jì)算器。時(shí)間保存計(jì)算器。OligoOligo不僅能以圖表的方式將結(jié)果展示出來，還能以文不僅能以圖表的方式將結(jié)果展示出來，還能以文本的形式保存。本的形式保存。在軟件所出現(xiàn)的任何一個(gè)窗口，選擇在軟件所出現(xiàn)的任何一個(gè)

33、窗口，選擇Filedata AsFiledata As，把數(shù)據(jù)存為一個(gè)文本文件。把數(shù)據(jù)存為一個(gè)文本文件。文本保存的結(jié)果如下：文本保存的結(jié)果如下：最佳退火溫度最佳引物濃度、鹽濃度上游引物上游引物下游引物下游引物溫馨小提示溫馨小提示：當(dāng)你驗(yàn)：當(dāng)你驗(yàn)證引物時(shí)，不要如圖證引物時(shí)，不要如圖似的把引物序列直接似的把引物序列直接黏貼。此處，黏貼。此處，應(yīng)該應(yīng)該把把模板序列輸進(jìn)去。模板序列輸進(jìn)去。edit new sequence 里用里用鍵盤輸入上游引鍵盤輸入上游引物的模板序列（物的模板序列（A），），選擇選擇Accept/DiscardAccept。輸入輸入S或或dsDNA是錯(cuò)誤的。是錯(cuò)誤的。注意：看到的

34、序列是模板，而不是需注意：看到的序列是模板，而不是需要驗(yàn)證的引物。要驗(yàn)證的引物?？矗嚎矗荷嫌我镆呀?jīng)顯示了！上游引物已經(jīng)顯示了！顯示的是方框顯示的是方框/當(dāng)當(dāng)前序列的位置前序列的位置也可以這樣操作：方框定位到也可以這樣操作：方框定位到288，點(diǎn)擊，點(diǎn)擊Upper，即可顯示上游引物。，即可顯示上游引物。錯(cuò)誤！錯(cuò)誤！當(dāng)方框短于引物時(shí)，可改變當(dāng)當(dāng)方框短于引物時(shí)，可改變當(dāng)前序列長度前序列長度下游引物也顯示了！下游引物也顯示了！引物序列長度不同于當(dāng)前的引物引物序列長度不同于當(dāng)前的引物，從，從“Change”菜單中改變當(dāng)菜單中改變當(dāng)前的引物長度！前的引物長度！引物輸入完畢，接下引物輸入完畢，接下來分析各個(gè)

35、參數(shù)來分析各個(gè)參數(shù)上下引物上下引物3末端沒有二聚體產(chǎn)生末端沒有二聚體產(chǎn)生。Primer premier 5Primer premier 5OligoOligo上下引物間產(chǎn)生的二聚體，上下引物間產(chǎn)生的二聚體，G絕對值應(yīng)小于絕對值應(yīng)小于4.5值值。Primer premier 5Primer premier 5OligoOligo上引物上引物內(nèi)部形成的二聚體內(nèi)部形成的二聚體。G絕對值大于絕對值大于9，有點(diǎn)不能，有點(diǎn)不能接受，而且核苷酸為接受，而且核苷酸為4個(gè)。個(gè)。Primer premier 5Primer premier 5OligoOligo下引物下引物內(nèi)部形成的二聚體內(nèi)部形成的二聚體。G絕對

36、值小于絕對值小于4.5，可以接受，可以接受，最佳退火溫度時(shí)可以忽略。，最佳退火溫度時(shí)可以忽略。OligoOligoPrimer premier 5Primer premier 5上引物上引物內(nèi)部形成的發(fā)內(nèi)部形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)夾結(jié)構(gòu)。G絕對值小絕對值小于于4.5，可以接受。，可以接受。下引物下引物內(nèi)部沒有形成發(fā)內(nèi)部沒有形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)夾結(jié)構(gòu)。False Priming Sites，即錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)，在，即錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)，在Primer5中雖然也有分析，但不如中雖然也有分析，但不如oligo詳細(xì)詳細(xì)。Primer premier 5Primer premier 5注意注意：此處，引物在非特異位點(diǎn)進(jìn)行引發(fā)，錯(cuò)：此處，引物在非特異位點(diǎn)進(jìn)行引發(fā)，錯(cuò)誤引發(fā)。誤引發(fā)。Primer premier 5Primer premier 5上下引物內(nèi)部穩(wěn)定性分析上下引物內(nèi)部穩(wěn)定性分析上引物上引物6-mers 出現(xiàn)頻率分析出現(xiàn)頻率分析下引物下引物6-mers 出現(xiàn)頻率分析出現(xiàn)頻率分析Search progress Search progress 窗口中顯示窗口中顯示Search CompletedOKSearch CompletedOK鍵鍵Accessi