選擇性凋亡DNALadder抽提試劑盒操作方法及步驟說明書

1、 TRIpure Reagent 抽提指南 目錄號 RP02 使用手冊 實驗室使用，僅用于體外 TRIpure Reagent 抽提指南 目錄號 RP02 使用手冊 實驗室使用，僅用于體外 TRIpure Reagent 抽提指南 目錄號 RP02 使用手冊 實驗室使用，僅用于體外v 試劑盒組成、儲存、穩(wěn)定性：試劑盒組成保存25次50次Extraction buffer4 ºC5 ml10 ml10% SDS室溫500µl1 mlEnzyme A-20 ºC500µl1 mlEnzyme B-20 ºC500µl1 mlPrecipi

2、tant4 ºC3.5 ml7 ml注意事項：為保持活性方便運輸，Enzyme B客戶收到時為凍干粉，收到后加500µl滅菌水（25次）或者1ml滅菌水（50次）溶解后20 ºC保存。Enzyme A和Enzyme B為酶溶液，應(yīng)該避免反復(fù)凍融降低活性，如果要分多次使用，最好按照每次使用量分裝后20 ºC保存。v 產(chǎn)品介紹：凋亡(apoptosis)或程序性死亡的細(xì)胞一個形態(tài)學(xué)的顯著特點是染色體DNA以核小體為單位（185 bp）規(guī)律斷裂形成長度約為n×185bp (n=1,2,3,4) 的DNA片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示為階梯狀凋亡DNA L

3、adder，是凋亡細(xì)胞最直觀的特征。本試劑盒選擇性從組織和細(xì)胞中分離提取凋亡DNA ladder，通過選擇性分離基因組DNA與凋亡DNA ladder，最大限度的減少了基因組DNA對凋亡DNA ladder的觀察干擾，因此顯著的提高了檢測敏感度，反應(yīng)可在微量離心管進行，2.5小時完成，快速方便；無需有機抽提，檢測靈敏度極高，可從約2000個凋亡細(xì)胞中檢測到DNA ladder。推薦起始細(xì)胞量為510 × 105 個，但投入的細(xì)胞量可在1 × 105 5 × 106之間變化。原則是總細(xì)胞中應(yīng)含有至少約12 × 104個凋亡細(xì)胞。多于2 × 104

4、個凋亡細(xì)胞通?？色@得十分清晰的凋亡DNA ladder。本試劑盒也可用于從組織中提取凋亡DNA ladder。但與培養(yǎng)細(xì)胞相比，整體動物組織凋亡細(xì)胞出現(xiàn)的時間、部位、程度等規(guī)律性差往往造成難以準(zhǔn)確取材，可能顯著影響實驗結(jié)果。但只要組織確實發(fā)生凋亡，有經(jīng)驗的用戶也可以使用本試劑盒從組織提取凋亡DNA ladder (參見說明4)。v 產(chǎn)品說明:1. 溴化乙錠染色過度將降低DNA條帶檢測靈敏度，可用水沖洗凝膠1030分鐘。如沖洗過頭可再用溴化乙錠復(fù)染。可用更靈敏的DNA染色劑SYBR Green。也可進行丙烯酰胺DNA凝膠電泳和DNA銀染。2. 對細(xì)胞進行干預(yù)處理后，凋亡可能僅在某一時間點或某一干

5、預(yù)強度下最為明顯。需要進行預(yù)試驗確定最佳干預(yù)時間或強度。此時也可用凋亡小體/hoeschst染色試劑盒(DN1801)快速染色凋亡小體觀察。3. 推薦起始細(xì)胞量為510 × 105 個，但投入的細(xì)胞量可在1 × 105 5 × 106之間變化。原則是總細(xì)胞中應(yīng)含有至少約12 × 104個凋亡細(xì)胞。多于2 × 104個凋亡細(xì)胞通?？色@得十分清晰的凋亡DNA ladder。六孔板的一個孔相當(dāng)于一個35 mm培養(yǎng)皿長滿后可得到110 ×105 個細(xì)胞，如果細(xì)胞凋亡發(fā)生率為10%，經(jīng)過處理可得到約110 × 104個凋亡細(xì)胞，應(yīng)該足

6、以獲得清晰的凋亡DNA ladder。反之如果不能從>3 ×106個細(xì)胞獲得清晰的凋亡DNA ladder，表明其中凋亡細(xì)胞少于1%。此時增加細(xì)胞用量也難已奏效。4. 從組織塊提取凋亡DNA ladder。取1020 mg組織塊放入小玻璃勻漿器，加100200l Extraction buffer，上下手動勻漿1520次。取出勻漿液，冰上510 min。振蕩10秒。4500 rpm 10分鐘收集上清液并轉(zhuǎn)移到新1.5ml離心管，執(zhí)行提取步驟3。另外一種方法是將3050mg組織剪碎后在PBS里面勻漿，制成細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞后接步驟2繼續(xù)執(zhí)行提取。5. 采用高質(zhì)量瓊脂糖，使用寬

7、度較小和厚度較窄的樣品梳子，制作較薄的瓊脂糖凝膠(厚度約24 mm)；用較低的電壓進行慢速電泳，將顯著增加凋亡DNA條帶檢測靈敏度。電泳距離不要太長，否則將使小的凋亡DNA條帶彌散而降低分辨率。v 操作步驟： 1. 用PBS漂洗細(xì)胞兩遍后微型離心機500 ×g 4ºC 5 min收集510 × 105個細(xì)胞（最好同時做一個未凋亡細(xì)胞的對照）。小心用移液槍吸棄上清，除盡管壁附著液體。2. 將離心管底部的細(xì)胞沉淀用手指輕輕彈松打散后，加入100µl的Extraction buffer，用振蕩器激烈混合10秒鐘后，1,1001,600 xg(約35004500

8、 rpm)離心5分鐘。3. 勿觸動管底沉淀，將上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管。4. 沉淀按操作2.方法再重復(fù)一次。5. 把上清液與操作3.的上清液合并于一起共約200µl，作為粗提取液(含有凋亡DNA片段，未凋亡染色體DNA已經(jīng)通過沉淀去除)。6. 向粗提取液中加入10% SDS 溶液 20µl后，再加入Enzyme A 20µl，混勻，56溫育1小時。7. 向上述混合液中加入Enzyme B 20µl，混勻,37溫育1小時，或者直到變得透亮（可過夜）。8. 向上述混合液中加入Precipitant 130µl后，顛倒混勻，再加入1 ml的乙醇，混勻后- 20放置1小時以上（沉淀凋亡DNA片段）。9. 至少13000rpm 4ºC離心15min，棄上清，加1ml 70乙醇漂洗一遍后離心，倒去乙醇，并且盡量吸除管壁附著液體。敞開管口，室溫晾干沉淀。10. 用17µl雙蒸水或TE Buffer充分溶解沉淀，加3µl 6 x DNA凝膠上樣緩沖液震蕩混勻。取全部20&