DNA測序技術PPT學習教案

1、會計學1DNA測序技術測序技術一、DNA序列測定的意義二、測序技術的建立三、DNA測序技術的發(fā)展四、DNA測序技術的展望五、DNA測序技術的應用第1頁/共45頁 DNADNA的序列測定是分子生物學研究中的一項的序列測定是分子生物學研究中的一項非常重要的和關鍵的內(nèi)容。如在基因的分離、定非常重要的和關鍵的內(nèi)容。如在基因的分離、定位、基因結(jié)構(gòu)與功能的研究、基因工程中載體的位、基因結(jié)構(gòu)與功能的研究、基因工程中載體的組建、基因表達與調(diào)控、基因片段的合成和探針組建、基因表達與調(diào)控、基因片段的合成和探針的制備、基因與疾病的關系等等，都要求對的制備、基因與疾病的關系等等，都要求對DNADNA一一級結(jié)構(gòu)的詳細了

2、解。級結(jié)構(gòu)的詳細了解。第2頁/共45頁 人類基因組計劃（人類基因組計劃（Human Genome ProjectHuman Genome ProjectHGPHGP）于）于19901990年正式啟動，其主要目標有：識別人類年正式啟動，其主要目標有：識別人類DNADNA中所有基因（超過中所有基因（超過1010萬個）；測定組成人類萬個）；測定組成人類DNADNA的的3030億堿基對的序列億堿基對的序列；將這些信息儲存到數(shù)據(jù)庫中；開；將這些信息儲存到數(shù)據(jù)庫中；開發(fā)出有關數(shù)據(jù)分析工具；致力于解決該計劃可能引發(fā)的發(fā)出有關數(shù)據(jù)分析工具；致力于解決該計劃可能引發(fā)的倫理、法律和社會問題。已于倫理、法律和社會問

3、題。已于20032003年完成。年完成。人類基因組計劃是當代生命科學一項偉大的科學工人類基因組計劃是當代生命科學一項偉大的科學工程，它奠定了程，它奠定了2121世紀生命科學發(fā)展和現(xiàn)代醫(yī)藥生物技術世紀生命科學發(fā)展和現(xiàn)代醫(yī)藥生物技術產(chǎn)業(yè)化的基礎，具有科學上的巨大意義和商業(yè)上的巨大產(chǎn)業(yè)化的基礎，具有科學上的巨大意義和商業(yè)上的巨大價值。價值。第3頁/共45頁19491949年年, Frederick Sanger, Frederick Sanger開發(fā)了測定胰島素兩條肽鏈開發(fā)了測定胰島素兩條肽鏈氨基末端序列的技術氨基末端序列的技術,1953,1953年測定了胰島素的氨基酸序列年測定了胰島素的氨基酸序列

4、。19501950年年，EdmanEdman提出了蛋白質(zhì)的提出了蛋白質(zhì)的N N端測序技術端測序技術, ,后來在后來在此基礎上發(fā)展出了蛋白質(zhì)自動測序技術。此基礎上發(fā)展出了蛋白質(zhì)自動測序技術。19651965年年，SangerSanger等發(fā)明了等發(fā)明了RNARNA的小片段序列測定法的小片段序列測定法, ,并并完成了大腸桿菌完成了大腸桿菌5S rRNA5S rRNA的的120120個核苷酸的測定。個核苷酸的測定。同一時期同一時期,Holley,Holley完成了酵母丙氨酸轉(zhuǎn)運完成了酵母丙氨酸轉(zhuǎn)運tRNAtRNA的序列測定的序列測定。第4頁/共45頁19751975年，年，SangerSanger和

5、和CoulsonCoulson發(fā)明了發(fā)明了“加減法加減法”測定測定DNADNA序列。序列。19771977年年， Sanger Sanger在引入雙脫氧核苷三磷酸在引入雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)(ddNTP)后后, ,形成了雙脫氧鏈終止法形成了雙脫氧鏈終止法, ,使得使得DNADNA序列測定的效率和準確序列測定的效率和準確性大大提高。性大大提高。19771977年年，MaxamMaxam和和GilbertGilbert報道了化學降解法測定報道了化學降解法測定DNADNA的序列。的序列。第5頁/共45頁 DNA DNA序列測定技術出現(xiàn)后序列測定技術出現(xiàn)后, ,迅速超越了蛋迅速超越了蛋白質(zhì)和白

6、質(zhì)和RNARNA測序技術測序技術, ,成為現(xiàn)代分子生物學中成為現(xiàn)代分子生物學中最重要的技術。最重要的技術。第6頁/共45頁第7頁/共45頁第一代第一代DNADNA測序技術測序技術： 傳統(tǒng)的化學降解法、雙脫氧鏈終止法以及在它們的傳統(tǒng)的化學降解法、雙脫氧鏈終止法以及在它們的基礎上發(fā)展來的各種基礎上發(fā)展來的各種DNADNA測序技術。測序技術。 第一代第一代DNADNA測序技術包括：測序技術包括：化學降解法化學降解法、雙脫氧鏈終雙脫氧鏈終止法止法、熒光自動測序技術熒光自動測序技術和和雜交測序技術雜交測序技術。第8頁/共45頁基本原理基本原理: : 利用特異的利用特異的選擇性試劑選擇性試劑，專一性的隨機

7、斷裂，專一性的隨機斷裂DNADNA成不同長短的片段。根據(jù)試劑的選擇性及片段成不同長短的片段。根據(jù)試劑的選擇性及片段在高分辨力的在高分辨力的聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳上的區(qū)帶位置，判上的區(qū)帶位置，判斷斷DNADNA片段末端核苷酸的種類，從而測出片段末端核苷酸的種類，從而測出DNADNA的序的序列。列。第9頁/共45頁 將雙鏈將雙鏈DNADNA樣品變?yōu)闃悠纷優(yōu)閱捂渾捂?每個單鏈的同一方向末端都用放射每個單鏈的同一方向末端都用放射性同位素性同位素標記標記, ,以便顯示以便顯示DNADNA條帶條帶 分別用不同方法處理分別用不同方法處理, ,獲得只差獲得只差一個核苷酸的一個核苷酸的降解降解DN

8、ADNA群體群體 電泳電泳, ,讀取讀取DNADNA的核苷酸順序的核苷酸順序技術路技術路線線第10頁/共45頁堿基堿基特異修飾方法特異修飾方法GPh8.0,用用硫酸二甲酯硫酸二甲酯對對 N7進行甲基化進行甲基化,使使 C8-C9鍵對堿基裂解有特殊敏感性鍵對堿基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0 哌啶甲酸哌啶甲酸可使嘌呤環(huán)的可使嘌呤環(huán)的N原子化原子化,從而導從而導致脫嘌呤致脫嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鳥嘌呤的糖苷并因此消弱腺嘌呤和鳥嘌呤的糖苷鍵鍵C+T肼肼可打開嘧啶環(huán)可打開嘧啶環(huán),后者重新環(huán)化成五元環(huán)后易后者重新環(huán)化成五元環(huán)后易除去除去C1.5mol/L NaCl存在時存在時,可用可用肼肼除去胞嘧啶

9、除去胞嘧啶Maxam-Gilbert Maxam-Gilbert 法所用的化學技法所用的化學技術術第11頁/共45頁第12頁/共45頁 化學降解法剛問世時，準確性較好，也容易為普通化學降解法剛問世時，準確性較好，也容易為普通研究人員所掌握，因此用得較多。而且化學降解較之鏈研究人員所掌握，因此用得較多。而且化學降解較之鏈終止法具有一個明顯的優(yōu)點，即所測序列來自終止法具有一個明顯的優(yōu)點，即所測序列來自原原DNA分分子子而不是酶促合成產(chǎn)生的拷貝，排除了合成時造成的錯而不是酶促合成產(chǎn)生的拷貝，排除了合成時造成的錯誤。但化學降解法操作過程較麻煩，且用到放射性物質(zhì)誤。但化學降解法操作過程較麻煩，且用到放射

10、性物質(zhì)，逐漸被簡便快速的，逐漸被簡便快速的Sanger法所代替。法所代替。第13頁/共45頁1.2 1.2 雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法 又稱為又稱為SangerSanger法。該法的原理是：法。該法的原理是：利用利用DNADNA聚合聚合酶，以待測酶，以待測單鏈單鏈DNADNA為模板，以為模板，以dNTPdNTP為底物，設立四為底物，設立四種相互獨立的測序反應體系，在每個反應體系中加入種相互獨立的測序反應體系，在每個反應體系中加入不同的不同的雙脫氧核苷三磷酸雙脫氧核苷三磷酸（dideoxyribo nucleoside dideoxyribo nucleoside triphos phatet

11、riphos phate，ddNTPddNTP）作為鏈延伸終止劑。在測序）作為鏈延伸終止劑。在測序引物引導下，按照堿基配對原則，每個反應體系中合引物引導下，按照堿基配對原則，每個反應體系中合成一系列長短不一的引物延伸鏈，通過高分辨率的變成一系列長短不一的引物延伸鏈，通過高分辨率的變性性聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，分離，放射自顯影放射自顯影檢測后，從檢測后，從凝膠底部到頂部按凝膠底部到頂部按5353方向讀出新方向讀出新合成鏈序列合成鏈序列，由此推知待測模板鏈的序列由此推知待測模板鏈的序列 。第14頁/共45頁 POHdNTPddNTP POHOH P P P POH第15頁/共45

12、頁雙雙脫脫氧氧鏈鏈末末端端終終止止法法測測序序原原理理示示意意圖圖 第16頁/共45頁 Sanger Sanger法因操作簡便，得到廣泛的應用。后法因操作簡便，得到廣泛的應用。后來在此基礎上發(fā)展出多種來在此基礎上發(fā)展出多種DNADNA測序技術，其中測序技術，其中最重要的是最重要的是熒光自動測序技術熒光自動測序技術。第17頁/共45頁1.3 1.3 熒光自動測序技術熒光自動測序技術 熒光自動測序技術基于熒光自動測序技術基于SangerSanger原理，用原理，用熒光標記代替熒光標記代替同位素標記同位素標記，并用，并用成像系統(tǒng)成像系統(tǒng)自動檢測，從而大大提高了自動檢測，從而大大提高了DNADNA測序

13、的速度和準確性。測序的速度和準確性。 目前，應用最廣泛的應用生物系統(tǒng)公司目前，應用最廣泛的應用生物系統(tǒng)公司(applied (applied biosystemsbiosystems ，ABI)3730ABI)3730系列自動測序儀即是基于系列自動測序儀即是基于毛細管毛細管電泳電泳和和熒光標記技術熒光標記技術的的DNADNA測序儀測序儀。如。如ABI3730XLABI3730XL測序儀測序儀擁有擁有9696道毛細管，道毛細管，4 4種雙脫氧核苷酸的堿基分別用不同的種雙脫氧核苷酸的堿基分別用不同的熒光標記熒光標記，在通過毛細管時不同長度的，在通過毛細管時不同長度的DNADNA片段上的片段上的4

14、4種熒種熒光基團被激光激發(fā)，發(fā)出不同顏色的熒光，被光基團被激光激發(fā)，發(fā)出不同顏色的熒光，被CCDCCD檢測系檢測系統(tǒng)識別，并直接翻譯成統(tǒng)識別，并直接翻譯成DNADNA序列。序列。第18頁/共45頁目前所用自動測序技術的改進目前所用自動測序技術的改進第19頁/共45頁3730全自動測序儀第20頁/共45頁1.41.4雜交測序技術雜交測序技術 該方法不同于化學降解法和該方法不同于化學降解法和SangerSanger法，是利用法，是利用DNADNA雜交原理，將一系列雜交原理，將一系列已知序列的單鏈寡核苷酸片已知序列的單鏈寡核苷酸片段段固定在基片上，把待測的固定在基片上，把待測的DNADNA樣品片段變

15、性后與其樣品片段變性后與其雜交，根據(jù)雜交情況排列出樣品的序列信息。雜交，根據(jù)雜交情況排列出樣品的序列信息。 雜交測序檢測速度快，采用標準化的高密度雜交測序檢測速度快，采用標準化的高密度寡核寡核苷酸芯片苷酸芯片能夠大幅度降低檢測的成本，具有部分第二能夠大幅度降低檢測的成本，具有部分第二代測序技術的特點。但該方法誤差較大，且不能重復代測序技術的特點。但該方法誤差較大，且不能重復測定。測定。第21頁/共45頁 通過幾十年的逐步改進通過幾十年的逐步改進, , 第第1 1 代測序儀的讀長可以代測序儀的讀長可以超過超過1000 bp, 1000 bp, 原始數(shù)據(jù)的準確率可以高達原始數(shù)據(jù)的準確率可以高達99

16、.999%, 99.999%, 測定每千堿基序列的成本是測定每千堿基序列的成本是0.5 0.5 美元美元, , 每天的數(shù)據(jù)通量每天的數(shù)據(jù)通量可以達到可以達到600000 600000 堿基。堿基。第22頁/共45頁 第一代測序技術在分子生物學研究中發(fā)揮過重要的作第一代測序技術在分子生物學研究中發(fā)揮過重要的作用用, ,如人類基因組計劃如人類基因組計劃(human genome projec(human genome project t,HGP),HGP)主主要基于第一代要基于第一代DNADNA測序技術。目前基于熒光標記和測序技術。目前基于熒光標記和SangerSanger的雙脫氧鏈終止法原理的的

17、雙脫氧鏈終止法原理的熒光自動測序儀熒光自動測序儀仍被廣泛仍被廣泛地應用。地應用。 隨著人類基因組計劃的完成隨著人類基因組計劃的完成, ,人們進入了后基因組時代人們進入了后基因組時代, ,即功能基因組時代即功能基因組時代, ,傳統(tǒng)的測序方法已經(jīng)不能滿足傳統(tǒng)的測序方法已經(jīng)不能滿足深度測深度測序序和和重復測序重復測序等大規(guī)?；蚪M測序的需求等大規(guī)?；蚪M測序的需求, ,這促使了新一代這促使了新一代DNADNA測序技術的誕生。新一代測序技術即測序技術的誕生。新一代測序技術即第二代測序技術第二代測序技術。第23頁/共45頁 第二代測序技術，主要包括羅氏第二代測序技術，主要包括羅氏454454公司的公司的

18、GS FLXGS FLX測序平臺、測序平臺、IlluminaIllumina公司的公司的Solexa Genome AnalyzerSolexa Genome Analyzer測序平臺和測序平臺和ABIABI公司的公司的SOLiDSOLiD測序平臺。測序平臺。 第二代測序技術最顯著的特征是第二代測序技術最顯著的特征是高通量高通量, ,一次能對幾十一次能對幾十萬到幾百萬條萬到幾百萬條DNADNA分子進行序列測序分子進行序列測序, ,使得對一個物種的轉(zhuǎn)使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組測序或基因組深度測序變得方便易行錄組測序或基因組深度測序變得方便易行。第24頁/共45頁 第二代測序技術將片段化的基因組第二代

19、測序技術將片段化的基因組DNADNA兩側(cè)連上接兩側(cè)連上接頭頭, ,隨后用不同的方法產(chǎn)生幾百萬個隨后用不同的方法產(chǎn)生幾百萬個空間固定的空間固定的PCRPCR克隆克隆陣列陣列。每個克隆由單個文庫片段的多個拷貝組成。然后。每個克隆由單個文庫片段的多個拷貝組成。然后進行進行引物雜交引物雜交和和酶延伸反應酶延伸反應。由于所有的克隆都在同一。由于所有的克隆都在同一平面上平面上, ,這些反應就能夠大規(guī)模平行進行這些反應就能夠大規(guī)模平行進行, ,每個延伸反應所每個延伸反應所摻入的摻入的熒光標記熒光標記的成像檢測也能同時進行的成像檢測也能同時進行, ,從而獲得測序從而獲得測序數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)。DNADNA序列延伸和成

20、像檢測不斷重復序列延伸和成像檢測不斷重復, ,最后經(jīng)過最后經(jīng)過計算計算機分析機分析就可以獲得完整的就可以獲得完整的DNADNA序列信息。序列信息。 第二代測序技術包括：第二代測序技術包括：454454測序技術測序技術、SolexaSolexa測序測序技術技術和和SOLiDSOLiD測序技術測序技術。第25頁/共45頁2.1 4542.1 454測序技術測序技術 原理：在原理：在DNADNA聚合酶聚合酶、ATPATP硫酸化酶硫酸化酶、熒光素酶熒光素酶和和雙磷酸酶雙磷酸酶的作用下，將每一個的作用下，將每一個dNTPdNTP的聚合與一次的聚合與一次化學發(fā)光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測化學發(fā)光信化學發(fā)

21、光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測化學發(fā)光信號的有無和強度，達到實時檢測號的有無和強度，達到實時檢測DNADNA序列的目的。序列的目的。 第26頁/共45頁第27頁/共45頁 454 454生命科學公司在生命科學公司在20052005年最早推出了第二代測序平年最早推出了第二代測序平臺臺Genome Sequencer 20Genome Sequencer 20，并測序了支原體，并測序了支原體MycoplasmaMycoplasma genitaliumgenitalium的基因組。的基因組。 并在并在20072007年推出性年推出性能更優(yōu)的第二代基因組測序系統(tǒng)一能更優(yōu)的第二代基因組測序系統(tǒng)一Gen

22、ome Sequencer Genome Sequencer FLX System(GS FLX)FLX System(GS FLX)。羅氏在。羅氏在20052005年便與年便與454454公司洽談公司洽談并購事宜，并購事宜，20072007年完成并購，緊接著公布了年完成并購，緊接著公布了DNADNA雙螺旋的雙螺旋的發(fā)現(xiàn)者之一發(fā)現(xiàn)者之一沃森沃森(Jim Watson)(Jim Watson)的個人基因組，測序總的個人基因組，測序總花費不到一百萬美元?；ㄙM不到一百萬美元。第28頁/共45頁2.2 Solexa2.2 Solexa測序技術測序技術 核心技術：核心技術：“DNADNA簇簇”和和“可逆

23、性末端終止可逆性末端終止” ” 。 原理：將基因組原理：將基因組DNADNA的隨機片段附著到光學透明的玻璃表的隨機片段附著到光學透明的玻璃表面（即面（即Flow cellFlow cell），這些），這些DNADNA片段經(jīng)過延伸和橋式擴增后，片段經(jīng)過延伸和橋式擴增后，在在Flow cellFlow cell上形成了數(shù)以億計上形成了數(shù)以億計ClusterCluster，每個，每個ClusterCluster是具有是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇。然后利用帶熒光基團的四種特殊數(shù)千份相同模板的單分子簇。然后利用帶熒光基團的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過可逆性終止的脫氧核糖核苷酸，通過可逆性終止的SBSS

24、BS（邊合成邊測序）（邊合成邊測序）技術對待測的模板技術對待測的模板DNADNA進行測序。進行測序。 Illumina Illumina公司的新一代測序儀公司的新一代測序儀Genome AnalyzerGenome Analyzer最早由最早由SolexaSolexa公司研發(fā)，利用合成測序公司研發(fā)，利用合成測序( (SequencingbySequencingby Synthesis) Synthesis)的原理，實現(xiàn)自動化樣本制備及大規(guī)模平行測序。的原理，實現(xiàn)自動化樣本制備及大規(guī)模平行測序。第29頁/共45頁 Genome Analyzer Genome Analyzer系統(tǒng)需要的系統(tǒng)需要的

25、樣品量低至樣品量低至100ng100ng，文，文庫構(gòu)建過程簡單，減少了樣品分離和制備的時間，配對庫構(gòu)建過程簡單，減少了樣品分離和制備的時間，配對末端讀長可達到末端讀長可達到2 250 50 bpbp，每次運行后可獲得超過，每次運行后可獲得超過20 20 GBGB的高質(zhì)量過濾數(shù)據(jù)，且運行成本較低，是性價比較的高質(zhì)量過濾數(shù)據(jù)，且運行成本較低，是性價比較高的新一代測序技術。高的新一代測序技術。第30頁/共45頁 SOLID SOLID通過連接反應進行測序。其基本原理是以四色熒通過連接反應進行測序。其基本原理是以四色熒光標記的寡核苷酸進行多次連接合成，取代傳統(tǒng)的聚合酶連光標記的寡核苷酸進行多次連接合成

26、，取代傳統(tǒng)的聚合酶連接反應。具體步驟包括：接反應。具體步驟包括：文庫準備文庫準備擴增擴增微珠與玻片連接微珠與玻片連接連接測序連接測序 超高通量是超高通量是SOLIDSOLID系統(tǒng)最突出的特點，目前系統(tǒng)最突出的特點，目前SOLID 3SOLID 3單單次運行可產(chǎn)生次運行可產(chǎn)生50 GB50 GB的序列數(shù)據(jù)，相當于的序列數(shù)據(jù)，相當于1717倍人類基兇組覆倍人類基兇組覆蓋度。蓋度。2.3 SOLiD2.3 SOLiD測序技術測序技術第31頁/共45頁第32頁/共45頁 第三代測序技術是以第三代測序技術是以單分子測序單分子測序為特點的測序技術。為特點的測序技術。如生物科學公司如生物科學公司( (Bio

27、ScienceBioScience Corporation) Corporation)的的HeliScopeHeliScope單分子測序儀單分子測序儀(HeliScope SingleMolecular Sequencer)(HeliScope SingleMolecular Sequencer)以及正在研制的太平洋生物科學公司以及正在研制的太平洋生物科學公司(Pacific (Pacific Biosciences)Biosciences)的的單分子實時單分子實時DNADNA測序技術測序技術SingleMolecule Real Time (SMRT)DNA sequencing Singl

28、eMolecule Real Time (SMRT)DNA sequencing technologytechnology和牛津納米孔技術公司和牛津納米孔技術公司(Oxford (Oxford NanoporeNanopore TechnologiesLtdTechnologiesLtd) )的的納米孔單分子測序技術納米孔單分子測序技術等。等。第33頁/共45頁 目前目前, ,我國也啟動了第三代測序技術的研究。我國也啟動了第三代測序技術的研究。20092009年年1212月月, ,中科院北京基因組研究所與浪潮成立中科院北京基因組研究所與浪潮成立“中科院中科院北京基因組研究所北京基因組研究所浪潮

29、基因組科學聯(lián)合實驗室浪潮基因組科學聯(lián)合實驗室”,”,利用利用各自的優(yōu)勢聯(lián)合研發(fā)國產(chǎn)第三代測序儀各自的優(yōu)勢聯(lián)合研發(fā)國產(chǎn)第三代測序儀, ,第一臺樣機預計第一臺樣機預計20132013年問世年問世, ,屆時有望緩解測序儀核心技術受制于國外屆時有望緩解測序儀核心技術受制于國外公司的現(xiàn)狀。公司的現(xiàn)狀。 第二代的高通量測序技術已經(jīng)得到了很好的發(fā)展和第二代的高通量測序技術已經(jīng)得到了很好的發(fā)展和應用應用, , 但是由于其但是由于其測序速度、成本、準確度測序速度、成本、準確度等關鍵問題等關鍵問題的解決仍存在困難的解決仍存在困難, ,研究者們很快將目光轉(zhuǎn)向了更高更新研究者們很快將目光轉(zhuǎn)向了更高更新的測序解決方案。

30、的測序解決方案。 單分子測序也就應運而生。單分子測序也就應運而生。第34頁/共45頁第三代測序技術第三代測序技術非常驚人！非常驚人！1 1、它實現(xiàn)了、它實現(xiàn)了DNADNA聚合酶內(nèi)在自身的反應速度，聚合酶內(nèi)在自身的反應速度，一秒可以測一秒可以測1010個堿基個堿基，測序速度是化學法測序的，測序速度是化學法測序的2 2萬倍。萬倍。2 2、它實現(xiàn)了、它實現(xiàn)了DNADNA聚合酶內(nèi)在自身的聚合酶內(nèi)在自身的processivityprocessivity（延續(xù)性（延續(xù)性，也就是，也就是DNADNA聚合酶一次可以合成很長的片段），聚合酶一次可以合成很長的片段），一個反一個反應就可以測非常長的序列應就可以測非

31、常長的序列。 二代測序現(xiàn)在可以測到上百個二代測序現(xiàn)在可以測到上百個堿基，但是三代測序現(xiàn)在就可以測幾千個堿基。這為基因組堿基，但是三代測序現(xiàn)在就可以測幾千個堿基。這為基因組的重復序列的拼接提供了非常好的條件。的重復序列的拼接提供了非常好的條件。3 3、它的、它的精度非常高精度非常高，達到，達到99.9999%99.9999%。4 4、可直接測、可直接測RNARNA序列。序列。5 5、可直接測、可直接測甲基化的甲基化的DNADNA序列。序列。第35頁/共45頁 2008 2008年年4 4月，月，HelicoHelico BioScienceBioScience公司的公司的TimothyTimot

32、hy等人在等人在ScienceScience上報道了他們開發(fā)的真正的單分子測序上報道了他們開發(fā)的真正的單分子測序技術技術, ,并利用該技術對一個并利用該技術對一個M13M13病毒基因組進行重測序病毒基因組進行重測序。 這項技術之所以被稱為真正的單分子測序這項技術之所以被稱為真正的單分子測序, ,是因為它是因為它完全跨過了前述完全跨過了前述3 3種高通量測序依賴的基于種高通量測序依賴的基于PCRPCR擴增的擴增的信號放大過程信號放大過程, ,真正達到了讀取單個熒光分子的能力。真正達到了讀取單個熒光分子的能力。 斯坦福大學的科學家最近利用斯坦福大學的科學家最近利用HeliscopeHeliscop

33、e單分子測單分子測序儀序儀, ,用了用了48 00048 000美元的試劑和美元的試劑和4 4個星期的時間個星期的時間, ,對一名對一名白人男子的基因組進行了測序。測序的覆蓋度達白人男子的基因組進行了測序。測序的覆蓋度達2828倍倍, ,覆蓋了覆蓋了90%90%的人類參考基因組。序列讀長的人類參考基因組。序列讀長24-70 24-70 bpbp, ,平均讀長為平均讀長為32 32 bpbp, ,并鑒定出并鑒定出280280萬個萬個SNPSNP位點和位點和752752個拷貝數(shù)變異。個拷貝數(shù)變異。3.1 HeliScope3.1 HeliScope單分子測序儀單分子測序儀第36頁/共45頁 Pac

34、ific bioscience Pacific bioscience 在在ScienceScience上報道了他們的上報道了他們的基基于于SMARTSMART技術的單分子測序技術技術的單分子測序技術, ,該技術利用單分子該技術利用單分子技術和技術和DNADNA聚合酶聚合酶, ,在聚合反應的同時就可以讀取測序在聚合反應的同時就可以讀取測序產(chǎn)物產(chǎn)物, ,目前一期的讀取速度為目前一期的讀取速度為3bp / s,3bp / s,但他們聲稱在但他們聲稱在2013 2013 前實現(xiàn)三分鐘讀完人類基因組。前實現(xiàn)三分鐘讀完人類基因組。PacificPacific技術目技術目前在研究大腸桿菌基因組時的評價讀長為

35、前在研究大腸桿菌基因組時的評價讀長為586586個堿基個堿基, ,有些能達到有些能達到28052805堿基堿基, ,新儀器的單個讀長已達新儀器的單個讀長已達1035110351個堿基個堿基, ,而且有望實現(xiàn)更大的讀長而且有望實現(xiàn)更大的讀長, ,而且準確率而且準確率99.9999%99.9999%。 3.2 3.2 單分子實時單分子實時DNADNA測序技術測序技術第37頁/共45頁 英國牛津納米公司成功研制出了英國牛津納米公司成功研制出了基于納米孔的單分基于納米孔的單分子測序技術子測序技術, ,該技術讀取數(shù)據(jù)的速度更快該技術讀取數(shù)據(jù)的速度更快, ,而且成本會大而且成本會大大降低大降低 。 在該測

36、序技術平臺中在該測序技術平臺中,DNA,DNA分子以一次一個堿分子以一次一個堿基的速度依次通過納米小孔基的速度依次通過納米小孔, ,利用核酸外切酶的特性來識利用核酸外切酶的特性來識別出不同的別出不同的DNADNA堿基堿基, ,同時還能檢測出堿基是否被甲基同時還能檢測出堿基是否被甲基化等相關的重要信息。化等相關的重要信息。3.3 3.3 納米孔單分子測序技術納米孔單分子測序技術第38頁/共45頁 據(jù)據(jù)2010 2010 年年7 7 月月30 30 日日Xiao YanXiao Yan（NanoNano LettLett，July July 3030，20102010）報道，美國賓夕法尼亞大學的研究人員開）報道，美