食品檢驗(yàn)檢疫學(xué)5動(dòng)物性食品中致病微生物和寄生蟲的檢驗(yàn)檢疫實(shí)用教案

1、動(dòng)物性食品中微生物污染的可能途徑主要有：動(dòng)物性食品中微生物污染的可能途徑主要有：食品原料本身的污染；食品原料本身的污染；動(dòng)物養(yǎng)殖環(huán)境動(dòng)物養(yǎng)殖環(huán)境(hunjng)中的微生物對(duì)食品原料中的微生物對(duì)食品原料的污染；的污染；屠宰過程中的污染；屠宰過程中的污染；深加工動(dòng)物食品可能受到加工車間、加工設(shè)備深加工動(dòng)物食品可能受到加工車間、加工設(shè)備表面殘存微生物污染；表面殘存微生物污染；食品從加工出廠、貯存、運(yùn)輸、銷售過程中可食品從加工出廠、貯存、運(yùn)輸、銷售過程中可以受到相應(yīng)環(huán)境以受到相應(yīng)環(huán)境(hunjng)中微生物的污染；中微生物的污染；在家庭、賓館等廚房中生熟食品的交叉污染。在家庭、賓館等廚房中生熟食品的交

2、叉污染。第一節(jié)第一節(jié) 動(dòng)物性食品中菌落總數(shù)動(dòng)物性食品中菌落總數(shù)(zngsh)(zngsh)與大腸菌群的檢驗(yàn)與大腸菌群的檢驗(yàn)第1頁/共125頁第一頁，共125頁。食品微生物檢測(cè)所涉及食品微生物檢測(cè)所涉及(shj)的的類群類群第2頁/共125頁第二頁，共125頁。 微生物檢測(cè)微生物檢測(cè)(jin c)程序程序 樣品的采集 注意： 1 所用接觸(jich)樣品的用具經(jīng)過滅菌 2 取樣要均勻、特殊樣品要控制溫度 3 樣品采好后要貼上標(biāo)簽（注明：樣品名稱、來源、數(shù)量、采樣人、地點(diǎn)及時(shí)間）樣品的微生物檢驗(yàn)樣品的微生物檢驗(yàn)注意：注意：1 采好的樣品送檢采好的樣品送檢不要超過不要超過3小時(shí)小時(shí)2 檢完的樣品的存

3、檢完的樣品的存放放(cnfng)時(shí)間時(shí)間 3 報(bào)告的填寫報(bào)告的填寫 第3頁/共125頁第三頁，共125頁。 微生物對(duì)食品的污染問題是我國乃微生物對(duì)食品的污染問題是我國乃至全世界食品安全中最突出至全世界食品安全中最突出(t ch)的的問題，我國為此數(shù)次頒布食品微生物檢問題，我國為此數(shù)次頒布食品微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。按照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)要求，驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。按照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)要求，菌落總數(shù)和大腸菌群是食品企業(yè)出廠時(shí)菌落總數(shù)和大腸菌群是食品企業(yè)出廠時(shí)必檢的微生物指標(biāo)。必檢的微生物指標(biāo)。第4頁/共125頁第四頁，共125頁。菌落總數(shù)是指一定培養(yǎng)條件下（如需氧狀況、培菌落總數(shù)是指一定培養(yǎng)條件下（如需氧狀況、培養(yǎng)基成

4、分、養(yǎng)基成分、PH、培養(yǎng)溫度和時(shí)間等）每克（每毫升）、培養(yǎng)溫度和時(shí)間等）每克（每毫升）食品樣品中所生長出來的細(xì)菌菌落總數(shù)。食品樣品中所生長出來的細(xì)菌菌落總數(shù)。檢測(cè)菌落總數(shù)，可以判定食品被細(xì)菌污染程度，檢測(cè)菌落總數(shù)，可以判定食品被細(xì)菌污染程度，反映出食品的新鮮程度和衛(wèi)生狀況。如果某食品的反映出食品的新鮮程度和衛(wèi)生狀況。如果某食品的菌落總數(shù)嚴(yán)重超標(biāo)，說明其產(chǎn)品的衛(wèi)生狀況達(dá)不到菌落總數(shù)嚴(yán)重超標(biāo)，說明其產(chǎn)品的衛(wèi)生狀況達(dá)不到基本基本(jbn)的衛(wèi)生要求，食品將加速腐敗變質(zhì)，失的衛(wèi)生要求，食品將加速腐敗變質(zhì)，失去食用價(jià)值。去食用價(jià)值。第5頁/共125頁第五頁，共125頁。 菌落總數(shù)菌落總數(shù)(zngsh)的

5、檢驗(yàn)程序的檢驗(yàn)程序第6頁/共125頁第六頁，共125頁。第7頁/共125頁第七頁，共125頁。 注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：1 操作要在無菌的狀態(tài)下進(jìn)行。操作要在無菌的狀態(tài)下進(jìn)行。2 操作時(shí)間越短越好。操作時(shí)間越短越好。3 樣品不同選擇的稀釋倍數(shù)不同。樣品不同選擇的稀釋倍數(shù)不同。4 培養(yǎng)基冷卻培養(yǎng)基冷卻(lngqu)溫度不宜過高或過低。溫度不宜過高或過低。第8頁/共125頁第八頁，共125頁。大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、需氧和兼性厭氧的革蘭糖、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性氏陰性(ynxng)無芽孢桿菌，包括腸無芽孢桿菌，包括腸桿菌科的大腸埃希氏菌屬、檸檬桿菌屬、腸桿菌桿菌科的大腸

6、埃希氏菌屬、檸檬桿菌屬、腸桿菌屬和克雷伯菌屬細(xì)菌。屬和克雷伯菌屬細(xì)菌。檢測(cè)大腸菌群，可以判定食品被與糞便污染有關(guān)檢測(cè)大腸菌群，可以判定食品被與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌污染的程度。如果某食品的大腸菌群超標(biāo)，的細(xì)菌污染的程度。如果某食品的大腸菌群超標(biāo)，則可以推測(cè)其產(chǎn)品中存在著腸道致病菌污染的可能則可以推測(cè)其產(chǎn)品中存在著腸道致病菌污染的可能性，食用之可能導(dǎo)致食物中毒或罹患流行病。性，食用之可能導(dǎo)致食物中毒或罹患流行病。第9頁/共125頁第九頁，共125頁。第二節(jié)第二節(jié) 動(dòng)物性食品中致病性細(xì)菌的檢驗(yàn)動(dòng)物性食品中致病性細(xì)菌的檢驗(yàn)沙門氏菌沙門氏菌致病性大腸桿菌致病性大腸桿菌(gnjn)(gnjn)副溶血弧菌副溶

7、血弧菌金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌溶血性鏈球菌溶血性鏈球菌產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌肉毒梭菌肉毒梭菌結(jié)核分枝桿菌結(jié)核分枝桿菌(gnjn)(gnjn)空腸彎曲桿菌空腸彎曲桿菌(gnjn)(gnjn)炭疽桿菌炭疽桿菌(gnjn)(gnjn)產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)氣莢膜梭菌蠟樣芽孢桿菌蠟樣芽孢桿菌(gnjn)(gnjn)變形桿菌變形桿菌(gnjn)(gnjn)第10頁/共125頁第十頁，共125頁。食品食品(shpn)中沙門氏中沙門氏菌檢驗(yàn)菌檢驗(yàn)第11頁/共125頁第十一頁，共125頁。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握食品中沙門氏菌的檢驗(yàn)原理、掌握食品中沙門氏菌的檢驗(yàn)原理(yunl)。2、掌握食品

8、中沙門氏菌的檢驗(yàn)方法。、掌握食品中沙門氏菌的檢驗(yàn)方法。第12頁/共125頁第十二頁，共125頁。 二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理(yunl)（一）沙門氏菌屬簡(jiǎn)介（一）沙門氏菌屬簡(jiǎn)介 沙門氏菌屬是一群符合腸桿菌科定義并與其血清學(xué)相關(guān)的革蘭氏陰性沙門氏菌屬是一群符合腸桿菌科定義并與其血清學(xué)相關(guān)的革蘭氏陰性(ynxng)(ynxng)、需氧性、無芽孢桿菌。本菌屬種類繁多，抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，現(xiàn)已發(fā)、需氧性、無芽孢桿菌。本菌屬種類繁多，抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)現(xiàn)20002000多個(gè)血清型，我國已發(fā)現(xiàn)血清型近多個(gè)血清型，我國已發(fā)現(xiàn)血清型近200200個(gè)。個(gè)。第13頁/共125頁第十三頁，共125頁。沙門氏菌沙門氏菌(

9、sh mn sh jn)屬屬生物學(xué)特性生物學(xué)特性形態(tài)特征：形態(tài)特征： 革蘭氏陰性，大小為革蘭氏陰性，大小為1-31-30.4-0.9m0.4-0.9m的兩的兩端 鈍 圓 的 短 桿 菌端 鈍 圓 的 短 桿 菌(gnjn)(gnjn)，無芽孢，無芽孢，一般無莢膜，除雞沙一般無莢膜，除雞沙門氏菌和雛沙門氏菌門氏菌和雛沙門氏菌以外，都有周身鞭毛，以外，都有周身鞭毛，運(yùn)動(dòng)力強(qiáng)。運(yùn)動(dòng)力強(qiáng)。第14頁/共125頁第十四頁，共125頁。培養(yǎng)特性：培養(yǎng)特性：沙門氏菌需氧或兼性厭氧，沙門氏菌需氧或兼性厭氧，1042都可都可生長，最適生長溫度生長，最適生長溫度(wnd)為為37，最，最適適pH為為6.87.8。營

10、養(yǎng)瓊脂平板上：營養(yǎng)瓊脂平板上：3537培養(yǎng)培養(yǎng)18-24h，其菌落大小一般為其菌落大小一般為23mm，光滑、濕潤、，光滑、濕潤、無色、半透明、邊緣整齊。無色、半透明、邊緣整齊。血平板上：中等大小的灰白色菌落。血平板上：中等大小的灰白色菌落。第15頁/共125頁第十五頁，共125頁。沙門氏菌沙門氏菌(sh mn sh jn)屬的抗原屬的抗原 菌體抗原菌體抗原(kngyun)(kngyun)（O O抗原抗原(kngyun)(kngyun)） 表面抗原表面抗原(kngyun)(kngyun)（K K抗原抗原(kngyun)(kngyun)）：）：ViVi抗原抗原(kngyun)(kngyun)和和M

11、 M抗原抗原(kngyun)(kngyun) 鞭毛抗原鞭毛抗原(kngyun)(kngyun)（H H抗原抗原(kngyun)(kngyun)） 纖毛抗原纖毛抗原(kngyun)(kngyun)第16頁/共125頁第十六頁，共125頁。 沙門氏菌沙門氏菌(sh mn sh jn)屬屬致病性致病性 沙門氏菌胃腸炎是由除傷寒沙門氏菌外任何一型沙門氏菌而沙門氏菌胃腸炎是由除傷寒沙門氏菌外任何一型沙門氏菌而所致，潛伏期一般所致，潛伏期一般6-726-72小時(shí)，主要癥狀為惡心、嘔吐、腹絞小時(shí)，主要癥狀為惡心、嘔吐、腹絞痛、腹瀉、發(fā)熱寒顫頭痛。病程一般痛、腹瀉、發(fā)熱寒顫頭痛。病程一般1 12 2天或更長。

12、感染劑天或更長。感染劑量為量為15152020個(gè)菌，死亡率達(dá)個(gè)菌，死亡率達(dá)1 14%4%。最易感群體是年幼兒童、。最易感群體是年幼兒童、虛弱者、年長老人、免疫缺陷者等。虛弱者、年長老人、免疫缺陷者等。 污染源主要是人和家畜的糞便，沙門氏菌常存在于動(dòng)物中，污染源主要是人和家畜的糞便，沙門氏菌常存在于動(dòng)物中，特別是禽類和豬。在許多環(huán)境中也有存在。從水，土壤，昆特別是禽類和豬。在許多環(huán)境中也有存在。從水，土壤，昆蟲中，從工廠和廚房設(shè)施的表面和動(dòng)物糞便中已發(fā)現(xiàn)該類細(xì)蟲中，從工廠和廚房設(shè)施的表面和動(dòng)物糞便中已發(fā)現(xiàn)該類細(xì)菌。它們可以存在于多類食品中，包括生肉，禽，奶制品和菌。它們可以存在于多類食品中，包括

13、生肉，禽，奶制品和蛋，魚，蝦和田雞腿，酵母，椰子，醬油和沙拉調(diào)料，蛋糕蛋，魚，蝦和田雞腿，酵母，椰子，醬油和沙拉調(diào)料，蛋糕粉，奶油粉，奶油(niyu)(niyu)夾心甜點(diǎn)，頂端配料，干明膠，花生露，夾心甜點(diǎn)，頂端配料，干明膠，花生露，橙汁，可可和巧克力。橙汁，可可和巧克力。第17頁/共125頁第十七頁，共125頁。 （二）檢驗(yàn)（二）檢驗(yàn)(jinyn)1.1.前增菌前增菌: : 第一步使食物樣品在含有第一步使食物樣品在含有(hn yu)(hn yu)營養(yǎng)的非選擇性培養(yǎng)營養(yǎng)的非選擇性培養(yǎng)基中增菌，使受損傷的沙門氏菌細(xì)胞恢復(fù)到穩(wěn)定的生理狀態(tài)。基中增菌，使受損傷的沙門氏菌細(xì)胞恢復(fù)到穩(wěn)定的生理狀態(tài)。2.

14、2.選擇性增菌選擇性增菌: : 在含選擇性抑制劑的促生長培養(yǎng)基中間，樣品進(jìn)一步增在含選擇性抑制劑的促生長培養(yǎng)基中間，樣品進(jìn)一步增菌的一個(gè)步驟。此培養(yǎng)基允許沙門氏菌持續(xù)增殖，同時(shí)阻止大多數(shù)其菌的一個(gè)步驟。此培養(yǎng)基允許沙門氏菌持續(xù)增殖，同時(shí)阻止大多數(shù)其他細(xì)菌的增殖。他細(xì)菌的增殖。3.3.選擇性平板分離選擇性平板分離: : 這一步采用固體選擇性培養(yǎng)基，抑制非沙門氏菌的這一步采用固體選擇性培養(yǎng)基，抑制非沙門氏菌的生長，提供肉眼可見的疑似沙門氏菌純菌落的識(shí)別。生長，提供肉眼可見的疑似沙門氏菌純菌落的識(shí)別。4.4.生物化學(xué)篩選生物化學(xué)篩選: : 排除大多數(shù)非沙門氏菌。也提供了沙門氏菌培養(yǎng)物菌排除大多數(shù)非沙

15、門氏菌。也提供了沙門氏菌培養(yǎng)物菌屬的初步鑒定。屬的初步鑒定。5.5.血清學(xué)技術(shù)提供了培養(yǎng)物菌種的鑒定。血清學(xué)技術(shù)提供了培養(yǎng)物菌種的鑒定。第18頁/共125頁第十八頁，共125頁。 三、實(shí)驗(yàn)儀器和材料三、實(shí)驗(yàn)儀器和材料1冰箱：冰箱：04。2恒溫恒溫(hngwn)培養(yǎng)箱：培養(yǎng)箱：361，42。3顯微鏡：顯微鏡：10100。4高壓滅菌器。高壓滅菌器。5 超凈工作臺(tái)。超凈工作臺(tái)。6 均質(zhì)器或滅菌乳缽。均質(zhì)器或滅菌乳缽。7 架盤藥物天平：架盤藥物天平：0g500g,精確度精確度0.5g。8 滅菌廣口瓶：滅菌廣口瓶：500mL。9 滅菌錐形瓶：滅菌錐形瓶：500mL、250mL。10 滅菌吸管：滅菌吸管：

16、10mL（具（具0.1 mL刻度）。刻度）。11 天菌培養(yǎng)皿：天菌培養(yǎng)皿：90mm。12 滅菌小試管：內(nèi)徑滅菌小試管：內(nèi)徑3mm50mm。13 滅菌毛細(xì)管。滅菌毛細(xì)管。第19頁/共125頁第十九頁，共125頁。 四、培養(yǎng)基和試劑四、培養(yǎng)基和試劑1緩沖蛋白胨水緩沖蛋白胨水(BP)2氯化鎂孔雀綠氯化鎂孔雀綠(MM)增菌液增菌液3四硫酸鈉煌綠四硫酸鈉煌綠(TTB)增菌液增菌液4亞硒酸鹽胱氨酸亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液增菌液5亞硫酸鉍瓊脂亞硫酸鉍瓊脂(BS)6DHL瓊脂瓊脂7HE瓊脂：按瓊脂：按GB/T 4789.282003中中4.21規(guī)定。規(guī)定。8TSI瓊脂瓊脂9蛋白胨水、靛基質(zhì)蛋白胨水、靛基質(zhì)

17、(j zh)試劑試劑10 尿素瓊脂尿素瓊脂(pH7.2)11 氨基酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基氨基酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基12 沙門氏菌因子血清：按沙門氏菌因子血清：按26種用于初步分型；種用于初步分型；57種用于進(jìn)一步分型；種用于進(jìn)一步分型；163種用于詳細(xì)分型。種用于詳細(xì)分型。第20頁/共125頁第二十頁，共125頁。五、檢驗(yàn)樣品五、檢驗(yàn)樣品1 1 鮮豬肉、鮮牛肉；凍豬肉鮮豬肉、鮮牛肉；凍豬肉2 2 鮮牛奶、鮮魚鮮牛奶、鮮魚(xin y)(xin y)；凍魚；凍魚3 3 香腸、蝦仁香腸、蝦仁第21頁/共125頁第二十一頁，共125頁。六、沙門氏菌六、沙門氏菌(sh mn sh jn)檢驗(yàn)流程檢驗(yàn)流程 檢樣

18、檢樣 前增菌法前增菌法 直接增菌法直接增菌法 凍肉、蛋品、乳品及其它加工食品凍肉、蛋品、乳品及其它加工食品 鮮肉、鮮蛋、鮮乳及其它未經(jīng)加工的食品鮮肉、鮮蛋、鮮乳及其它未經(jīng)加工的食品 25g 25g BP 225mL 25g BP 225mL 25g 滅菌生理鹽水滅菌生理鹽水25mL 25mL 制成檢樣均質(zhì)液制成檢樣均質(zhì)液 （36361 1） 一般一般 4 h 4 h，干蛋品，干蛋品 18 1824 h24 h10mL10mLMM(MM(或或TTB)100mL 10mLTTB)100mL 10mLSC 100mL SC 100mL 檢樣均質(zhì)液的半量檢樣均質(zhì)液的半量MM(MM(或或TTB)100m

19、L TTB)100mL 檢樣均質(zhì)液的半量檢樣均質(zhì)液的半量SC 100mL SC 100mL 42 18 42 1824 h 24 h （36361 1） 18 1824 h 42 1824 h 42 1824 h 24 h （36361 1） 18 1824 h 24 h BS DHL( BS DHL(或或HEHE、WSWS、SS)SS) （36361 1） 40 4048 h 48 h （36361 1） 18 1824 h 24 h 挑取可疑菌落挑取可疑菌落 TSI TSI（斜面、底層、產(chǎn)氣、（斜面、底層、產(chǎn)氣、H2SH2S）、蛋白胨水（靛基質(zhì)）、尿素（）、蛋白胨水（靛基質(zhì)）、尿素（pH7

20、.2pH7.2）、）、KCNKCN、賴氨酸、賴氨酸 H2S H2S靛基質(zhì)靛基質(zhì) H2S H2S靛基質(zhì)靛基質(zhì) H2S H2S靛基質(zhì)靛基質(zhì) 非如左述的非如左述的 尿素尿素KCNKCN賴氨酸賴氨酸 尿素尿素KCNKCN賴氨酸賴氨酸 尿素尿素KCNKCN賴氨酸賴氨酸/ / 各種反應(yīng)結(jié)果各種反應(yīng)結(jié)果 甘露醇、山梨醇甘露醇、山梨醇 ONPGONPG 沙門氏菌血清學(xué)實(shí)驗(yàn)沙門氏菌血清學(xué)實(shí)驗(yàn)(shyn)(shyn) 沙門氏菌血清學(xué)實(shí)驗(yàn)沙門氏菌血清學(xué)實(shí)驗(yàn)(shyn)(shyn) 非沙門氏菌非沙門氏菌 非非沙門氏菌沙門氏菌 報(bào)告報(bào)告第22頁/共125頁第二十二頁，共125頁。 七、操作步驟七、操作步驟 1 1、前增

21、菌和增菌、前增菌和增菌 凍肉、蛋品、乳品及其他加工食品均應(yīng)經(jīng)過前增菌。以無菌凍肉、蛋品、乳品及其他加工食品均應(yīng)經(jīng)過前增菌。以無菌操作取操作取25g25g（mLmL），加在裝有），加在裝有225mL225mL緩沖蛋白胨水的緩沖蛋白胨水的500mL500mL廣口瓶廣口瓶?jī)?nèi)。固體食品可先應(yīng)用均質(zhì)器以內(nèi)。固體食品可先應(yīng)用均質(zhì)器以80008000 10000r/min 10000r/min打碎打碎1min1min，或用乳缽加滅菌砂磨碎，粉狀食品用滅菌匙或玻棒研磨使乳化或用乳缽加滅菌砂磨碎，粉狀食品用滅菌匙或玻棒研磨使乳化(rhu)(rhu)，于，于363611培養(yǎng)培養(yǎng)4h (4h (干蛋品培養(yǎng)干蛋品培養(yǎng)

22、18h18h24h)24h)，移取，移取10mL10mL，轉(zhuǎn)種于，轉(zhuǎn)種于100mL100mL氯化鎂孔雀綠增菌液或四硫酸鈉煌綠增菌液內(nèi)，氯化鎂孔雀綠增菌液或四硫酸鈉煌綠增菌液內(nèi)，于于4242培養(yǎng)培養(yǎng)18h18h 24h 24h。同時(shí)，另取。同時(shí)，另取10mL10mL，轉(zhuǎn)種于，轉(zhuǎn)種于100mL100mL亞硒酸鹽亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內(nèi)，于胱氨酸增菌液內(nèi)，于363611培養(yǎng)培養(yǎng)18h18h24h24h。 第23頁/共125頁第二十三頁，共125頁。 鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其他未經(jīng)加工鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其他未經(jīng)加工(ji gng)(ji gng)的食品不必經(jīng)過前增菌。的食品不必經(jīng)過前增菌。各取各取25g(2

23、5mL)25g(25mL)加入滅菌生理鹽水加入滅菌生理鹽水25mL25mL，按前法做成檢樣勻液；取，按前法做成檢樣勻液；取25mL25mL，接，接種于種于100mL100mL氯化鎂孔雀綠增菌液或四硫磺酸鈉煌綠增菌液內(nèi)，于氯化鎂孔雀綠增菌液或四硫磺酸鈉煌綠增菌液內(nèi)，于4242培養(yǎng)培養(yǎng)24h24h；另取另取25mL25mL接種于接種于100mL100mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內(nèi)，于亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內(nèi)，于363611培養(yǎng)培養(yǎng)18h18h24h24h。第24頁/共125頁第二十四頁，共125頁。 2 2、分離、分離 取增菌液取增菌液1 1環(huán)，劃線接種于一個(gè)亞硫酸鉍瓊脂平板和一個(gè)環(huán)，劃線接種于一個(gè)亞硫

24、酸鉍瓊脂平板和一個(gè)DHLDHL瓊脂平板瓊脂平板( (或或HEHE瓊瓊脂平板、脂平板、WSWS或或SSSS瓊脂平板瓊脂平板) )。兩種增菌液可同時(shí)劃線接種在同一個(gè)平板上。于。兩種增菌液可同時(shí)劃線接種在同一個(gè)平板上。于363611分別培養(yǎng)分別培養(yǎng)(piyng)18h(piyng)18h24h(DHL24h(DHL、HEHE、WSWS、SS)SS)或或40h40h48h(BS)48h(BS)，觀察各個(gè)平板上生長的菌落。觀察各個(gè)平板上生長的菌落。 第25頁/共125頁第二十五頁，共125頁。沙門氏菌屬各群在各種選擇性瓊脂沙門氏菌屬各群在各種選擇性瓊脂(qingzh)平板上平板上的菌落特征的菌落特征 選

25、擇性瓊脂平板選擇性瓊脂平板沙門氏菌沙門氏菌、沙門氏菌沙門氏菌（即亞利桑那菌）（即亞利桑那菌） BSBS瓊脂瓊脂產(chǎn)硫化氫菌落為黑色帶有金屬光澤，棕產(chǎn)硫化氫菌落為黑色帶有金屬光澤，棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株不產(chǎn)生硫化氫，形成或棕色；有些菌株不產(chǎn)生硫化氫，形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變黑色帶有金屬光澤黑色帶有金屬光澤 DHLDHL瓊脂瓊脂無色半透明，產(chǎn)硫化氫菌落中心帶黑色無色半透明，產(chǎn)硫化氫菌落中心帶黑色或幾乎全黑色或幾乎全黑色乳糖遲緩陽性或陰性的菌株與亞乳糖遲緩陽性或陰性的菌株與亞屬屬、相同；乳相同；乳糖陽性

26、的菌株為粉紅色，中心帶糖陽性的菌株為粉紅色，中心帶黑色黑色 HEHE瓊脂瓊脂 WSWS瓊脂瓊脂藍(lán)綠色或藍(lán)色；多數(shù)菌株產(chǎn)硫化氫，菌藍(lán)綠色或藍(lán)色；多數(shù)菌株產(chǎn)硫化氫，菌落中心黑色或幾乎全黑色落中心黑色或幾乎全黑色乳糖陽性的菌株為黃色，中心黑乳糖陽性的菌株為黃色，中心黑色或幾乎全黑色；乳糖遲緩陽性色或幾乎全黑色；乳糖遲緩陽性或陰性的菌株為藍(lán)綠色或藍(lán)色，或陰性的菌株為藍(lán)綠色或藍(lán)色，中心黑色或幾乎全黑色中心黑色或幾乎全黑色 SSSS瓊脂瓊脂無色半透明，產(chǎn)硫化氫菌株，有的菌落無色半透明，產(chǎn)硫化氫菌株，有的菌落中心帶黑色，但不如以上培養(yǎng)基明顯中心帶黑色，但不如以上培養(yǎng)基明顯乳糖遲緩陽性或陰性的菌株與亞乳糖遲緩

27、陽性或陰性的菌株與亞屬屬、相同；乳相同；乳糖陽性的菌株為粉紅色，中心黑糖陽性的菌株為粉紅色，中心黑色，但中心無黑色形成時(shí)與大腸色，但中心無黑色形成時(shí)與大腸埃希氏菌不能區(qū)別埃希氏菌不能區(qū)別第26頁/共125頁第二十六頁，共125頁。 3 3、生化試驗(yàn)、生化試驗(yàn) 自選擇性瓊脂平板上直接挑取數(shù)個(gè)可疑菌落，分別接自選擇性瓊脂平板上直接挑取數(shù)個(gè)可疑菌落，分別接種三糖鐵瓊脂、蛋白陳水種三糖鐵瓊脂、蛋白陳水( (供做靛基質(zhì)供做靛基質(zhì)(j zh)(j zh)試驗(yàn)試驗(yàn)) )、尿素瓊脂尿素瓊脂(pH7.2)(pH7.2)、氰化鉀、氰化鉀(KCN)(KCN)培養(yǎng)基和賴氨酸脫竣酶試培養(yǎng)基和賴氨酸脫竣酶試驗(yàn)培養(yǎng)基及對(duì)照

28、培養(yǎng)基各驗(yàn)培養(yǎng)基及對(duì)照培養(yǎng)基各1 1管，于管，于363611培養(yǎng)培養(yǎng)18h18h24h24h，必要時(shí)可延長至必要時(shí)可延長至48h48h，按生化反應(yīng)初步鑒定表判定結(jié)果。按，按生化反應(yīng)初步鑒定表判定結(jié)果。按反應(yīng)序號(hào)分類，沙門氏菌屬的結(jié)果應(yīng)屬于反應(yīng)序號(hào)分類，沙門氏菌屬的結(jié)果應(yīng)屬于A1A1、A2A2和和B1B1，其，其他他5 5種反應(yīng)結(jié)果均可以排除。種反應(yīng)結(jié)果均可以排除。 第27頁/共125頁第二十七頁，共125頁。 腸桿菌科各屬在三糖鐵瓊脂腸桿菌科各屬在三糖鐵瓊脂(qingzh)內(nèi)的反內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果應(yīng)結(jié)果 斜面斜面底層底層產(chǎn)氣產(chǎn)氣硫化氫硫化氫可能的菌屬和種可能的菌屬和種/ /沙門氏菌屬、弗勞地氏檸檬酸

29、沙門氏菌屬、弗勞地氏檸檬酸桿菌、變形桿菌屬、緩慢愛德桿菌、變形桿菌屬、緩慢愛德華氏菌華氏菌/ /沙門氏菌沙門氏菌、弗勞地氏檸檬酸、弗勞地氏檸檬酸桿菌、普通變形桿菌桿菌、普通變形桿菌沙門氏菌屬、大腸埃希氏菌、沙門氏菌屬、大腸埃希氏菌、蜂窩哈夫尼亞菌、摩根氏菌，蜂窩哈夫尼亞菌、摩根氏菌，普羅菲登斯菌屬普羅菲登斯菌屬傷寒沙門氏菌，雞沙門氏菌、傷寒沙門氏菌，雞沙門氏菌、志賀氏菌屬、大腸埃希氏菌、志賀氏菌屬、大腸埃希氏菌、蜂窩哈夫尼亞菌、摩根氏菌，蜂窩哈夫尼亞菌、摩根氏菌，普羅菲登斯菌屬普羅菲登斯菌屬/ /大腸埃希氏菌、腸桿菌屬、克大腸埃希氏菌、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、弗雷伯氏菌屬、沙雷氏菌

30、屬、弗勞地氏檸檬酸桿菌勞地氏檸檬酸桿菌注：陽性；陰性；注：陽性；陰性；/ / 多數(shù)陽性，少數(shù)陰性多數(shù)陽性，少數(shù)陰性第28頁/共125頁第二十八頁，共125頁。反應(yīng)序號(hào)反應(yīng)序號(hào)硫化氫硫化氫（H H2 2S S）靛基質(zhì)靛基質(zhì)pH7.2pH7.2尿素尿素氰化鉀氰化鉀（KCNKCN）賴氨酸脫羧酶賴氨酸脫羧酶判定結(jié)果判定結(jié)果A1A1沙門氏菌屬沙門氏菌屬A2A2沙門氏菌屬（少見）緩慢愛沙門氏菌屬（少見）緩慢愛德華氏菌德華氏菌A3A3弗勞地氏檸檬酸桿菌、奇異弗勞地氏檸檬酸桿菌、奇異變形桿菌變形桿菌A4A4普通變形桿菌普通變形桿菌B1B1沙門氏菌屬、大腸埃希氏沙門氏菌屬、大腸埃希氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌菌、甲

31、型副傷寒沙門氏菌大腸埃希氏菌、志賀氏菌屬大腸埃希氏菌、志賀氏菌屬B2B2大腸埃希氏菌大腸埃希氏菌大腸埃希氏菌、志賀氏菌屬大腸埃希氏菌、志賀氏菌屬B3B3/ /克雷伯氏菌族各屬陰溝腸桿克雷伯氏菌族各屬陰溝腸桿菌、弗勞地氏檸檬酸桿菌菌、弗勞地氏檸檬酸桿菌B4B4/ /摩根氏菌，普羅菲登斯菌屬摩根氏菌，普羅菲登斯菌屬注注1 1：三糖鐵瓊脂底層均產(chǎn)酸，不產(chǎn)氣者可排除；斜面產(chǎn)酸與產(chǎn)氣與否均不限。：三糖鐵瓊脂底層均產(chǎn)酸，不產(chǎn)氣者可排除；斜面產(chǎn)酸與產(chǎn)氣與否均不限。注注2 2：KCNKCN和賴氨酸可選作其中一項(xiàng)，但不能判定結(jié)果時(shí)，仍需補(bǔ)做另一項(xiàng)。和賴氨酸可選作其中一項(xiàng)，但不能判定結(jié)果時(shí)，仍需補(bǔ)做另一項(xiàng)。注注3

32、 3：表示陽性；表示陰性；：表示陽性；表示陰性；/ /表示多數(shù)陽性，少數(shù)陰性。表示多數(shù)陽性，少數(shù)陰性。第29頁/共125頁第二十九頁，共125頁。沙門氏菌檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)(jinyn)幾點(diǎn)注意幾點(diǎn)注意 冷凍樣品解凍需在冷凍樣品解凍需在4545以下，有自動(dòng)調(diào)溫器自控的水浴鍋內(nèi)以下，有自動(dòng)調(diào)溫器自控的水浴鍋內(nèi)不斷攪拌進(jìn)行不斷攪拌進(jìn)行15min15min或在或在2-82-8，1818小時(shí)內(nèi)軟化小時(shí)內(nèi)軟化(runhu)(runhu)。 為保證檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性，必須在選擇性培養(yǎng)基上挑取足夠數(shù)量的為保證檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性，必須在選擇性培養(yǎng)基上挑取足夠數(shù)量的菌落進(jìn)行生化和血清學(xué)鑒定。菌落進(jìn)行生化和血清學(xué)鑒定。 進(jìn)行生

33、化反應(yīng)時(shí)，應(yīng)以純培養(yǎng)物進(jìn)行試驗(yàn)，如出現(xiàn)血清學(xué)陽性，進(jìn)行生化反應(yīng)時(shí)，應(yīng)以純培養(yǎng)物進(jìn)行試驗(yàn)，如出現(xiàn)血清學(xué)陽性，而生化反應(yīng)特征不符合時(shí)，應(yīng)對(duì)接種物進(jìn)行純化，用純化后的而生化反應(yīng)特征不符合時(shí)，應(yīng)對(duì)接種物進(jìn)行純化，用純化后的培養(yǎng)物重新進(jìn)行生化試驗(yàn)。培養(yǎng)物重新進(jìn)行生化試驗(yàn)。 測(cè)試中應(yīng)同時(shí)接種陽性對(duì)照菌株。測(cè)試中應(yīng)同時(shí)接種陽性對(duì)照菌株。第30頁/共125頁第三十頁，共125頁。金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌(p to qi jn)細(xì)菌細(xì)菌學(xué)及其檢驗(yàn)學(xué)及其檢驗(yàn) 第31頁/共125頁第三十一頁，共125頁。1 生物學(xué)性狀生物學(xué)性狀(xngzhung) 自然分布：自然分布： 金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌(qijn)

34、分布廣泛，存在于環(huán)境、空氣、水、牛奶、食品、污分布廣泛，存在于環(huán)境、空氣、水、牛奶、食品、污水及人和動(dòng)物等。與人關(guān)系密切，構(gòu)成人體皮膚、鼻腔、咽部等處的正常細(xì)菌群，對(duì)人有致水及人和動(dòng)物等。與人關(guān)系密切，構(gòu)成人體皮膚、鼻腔、咽部等處的正常細(xì)菌群，對(duì)人有致病性，是臨床醫(yī)學(xué)中常見的化膿性球菌病性，是臨床醫(yī)學(xué)中常見的化膿性球菌(qijn)之一，也是污染食品造成食物中毒的細(xì)菌之一，也是污染食品造成食物中毒的細(xì)菌之一。之一。第32頁/共125頁第三十二頁，共125頁。 形態(tài)與染色：形態(tài)與染色： 典型典型(dinxng)金黃色葡萄球菌呈球形，直徑金黃色葡萄球菌呈球形，直徑0.51.0微米，較非致病性葡萄球菌

35、略小，各個(gè)菌體的大小及排列較整微米，較非致病性葡萄球菌略小，各個(gè)菌體的大小及排列較整齊。細(xì)菌繁殖時(shí)呈多個(gè)平面的不規(guī)則分裂，堆積成葡萄串狀排列。齊。細(xì)菌繁殖時(shí)呈多個(gè)平面的不規(guī)則分裂，堆積成葡萄串狀排列。在膿汁或液體培養(yǎng)基中生長，常呈雙球或短鏈排列，易誤為鏈球在膿汁或液體培養(yǎng)基中生長，常呈雙球或短鏈排列，易誤為鏈球菌。金黃色葡萄球菌無鞭毛，故不能自由移動(dòng)，一般不形成莢膜，菌。金黃色葡萄球菌無鞭毛，故不能自由移動(dòng)，一般不形成莢膜，不產(chǎn)生芽孢。革蘭氏染色為陽性，衰老、死亡或被白細(xì)胞吞噬的不產(chǎn)生芽孢。革蘭氏染色為陽性，衰老、死亡或被白細(xì)胞吞噬的菌體，常轉(zhuǎn)呈革蘭氏陰性，故須注意。菌體，常轉(zhuǎn)呈革蘭氏陰性，故

36、須注意。第33頁/共125頁第三十三頁，共125頁。 培養(yǎng)特性：培養(yǎng)特性： 本菌為需氧或兼性厭氧，對(duì)營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好，本菌為需氧或兼性厭氧，對(duì)營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好，最適宜最適宜(shy)生長溫度為生長溫度為37，最適宜，最適宜(shy)pH為為7.4，耐鹽性強(qiáng)，在含，耐鹽性強(qiáng)，在含10-15%氯氯化鈉培養(yǎng)基中能生長，利用這一特性，可有利于金葡菌的檢出。化鈉培養(yǎng)基中能生長，利用這一特性，可有利于金葡菌的檢出。第34頁/共125頁第三十四頁，共125頁。 在普通瓊脂培養(yǎng)基上形成圓形、凸起、表面光滑、濕潤、在普通瓊脂培養(yǎng)基上形成圓形、凸起、表面光滑、濕潤、邊緣整齊

37、、不透明的菌落。直徑一般為邊緣整齊、不透明的菌落。直徑一般為1-2mm，密集生，密集生長的菌落較小，稀散或生長較久著，長的菌落較小，稀散或生長較久著， 直徑可達(dá)直徑可達(dá)4-5mm。 在 普 通 肉 湯 培 養(yǎng) 基 中 生 長 迅 速 ， 一 般 呈 均 勻 混 濁在 普 通 肉 湯 培 養(yǎng) 基 中 生 長 迅 速 ， 一 般 呈 均 勻 混 濁(hnzhu)生長，如培養(yǎng)基中的糖類被分解后，產(chǎn)生較生長，如培養(yǎng)基中的糖類被分解后，產(chǎn)生較多的酸性物質(zhì)即可發(fā)生酸性沉淀。培養(yǎng)時(shí)間較長，多的酸性物質(zhì)即可發(fā)生酸性沉淀。培養(yǎng)時(shí)間較長，2-3日后常有菌膜形成而出現(xiàn)粘性沉淀。日后常有菌膜形成而出現(xiàn)粘性沉淀。 第3

38、5頁/共125頁第三十五頁，共125頁。 在血瓊脂平板上形成較大菌落，有色素產(chǎn)生，由于本菌產(chǎn)生的色素為脂溶在血瓊脂平板上形成較大菌落，有色素產(chǎn)生，由于本菌產(chǎn)生的色素為脂溶性不溶于水，故色素只局限于菌落內(nèi)，不透入培養(yǎng)基中。該菌產(chǎn)生溶血毒性不溶于水，故色素只局限于菌落內(nèi)，不透入培養(yǎng)基中。該菌產(chǎn)生溶血毒素，使菌落周圍紅細(xì)胞溶解而形成透明的溶血環(huán)，非致病性葡萄球菌素，使菌落周圍紅細(xì)胞溶解而形成透明的溶血環(huán)，非致病性葡萄球菌(p to qi jn)無此現(xiàn)象。無此現(xiàn)象。 第36頁/共125頁第三十六頁，共125頁。在Bairdparker瓊脂平板上，菌落呈圓形凸起(t q)，表面光滑濕潤，直徑23mm，灰

39、黑色至黑色，有光澤，常有淺色的邊緣，周圍繞以不透明圈，其外常有一清晰帶，菌落有黃油樣粘稠感。從長期貯存的冷凍或脫水食品中分離的菌落，其黑色常較典型菌落淺些，且外觀可能較粗糙，質(zhì)地較干燥。第37頁/共125頁第三十七頁，共125頁。抵抗力：抵抗力： 葡萄球菌抵抗力較強(qiáng)，在干燥的膿汁中能存活數(shù)月，有些菌株需加熱葡萄球菌抵抗力較強(qiáng)，在干燥的膿汁中能存活數(shù)月，有些菌株需加熱(ji r)80 3060分鐘才被殺死。在分鐘才被殺死。在5%石炭酸中石炭酸中15分鐘死亡。分鐘死亡。第38頁/共125頁第三十八頁，共125頁。2 致病性致病性 金黃色葡萄球菌為潛在性的病原菌，它所產(chǎn)金黃色葡萄球菌為潛在性的病原菌

40、，它所產(chǎn)生的多種胞外蛋白質(zhì)對(duì)人和動(dòng)物組織有害，生的多種胞外蛋白質(zhì)對(duì)人和動(dòng)物組織有害，其中一類是各種酶類，如脂酶、蛋白酶、青其中一類是各種酶類，如脂酶、蛋白酶、青霉素酶、凝固酶和耐熱霉素酶、凝固酶和耐熱(nai r)DNA酶等，另酶等，另一類為毒素，它們是溶血素（一類為毒素，它們是溶血素（、 ）、）、溶白細(xì)胞素、腸毒素（溶白細(xì)胞素、腸毒素（A 、B、 C、 D、E、TSS）及化膿性毒素等。）及化膿性毒素等。 第39頁/共125頁第三十九頁，共125頁。2 致病性致病性 雖然人體對(duì)金葡菌感染具有一定的抵抗力，但當(dāng)機(jī)體抵抗力下降或皮膚粘膜受損時(shí)易被感染，可引起(ynq)局部或全身炎癥，侵入血流可引起

41、(ynq)敗血癥及膿毒血癥。金葡菌污染食品之后可能產(chǎn)生大量的腸毒素，腸毒素是該菌引起(ynq)食物中毒的主要因素之一。第40頁/共125頁第四十頁，共125頁。 金葡菌腸毒素具有極強(qiáng)的穩(wěn)定性，能抵抗許多蛋白金葡菌腸毒素具有極強(qiáng)的穩(wěn)定性，能抵抗許多蛋白酶的消化，只有在小于酶的消化，只有在小于pH2的條件下蛋白酶才能使其的條件下蛋白酶才能使其失去活性。這一點(diǎn)可以解釋，為什么攝入腸毒素在胃失去活性。這一點(diǎn)可以解釋，為什么攝入腸毒素在胃中有蛋白酶時(shí)，仍然引起食物中毒，因?yàn)槲敢旱乃岫戎杏械鞍酌笗r(shí)，仍然引起食物中毒，因?yàn)槲敢旱乃岫却笥诖笥趐H2，所以不能消化腸毒素。腸毒素還相當(dāng)耐熱，所以不能消化腸毒素。腸

42、毒素還相當(dāng)耐熱，經(jīng)煮沸經(jīng)煮沸30分鐘后仍不能完全破壞分鐘后仍不能完全破壞(phui)其毒性。其毒性。當(dāng)含腸毒素為當(dāng)含腸毒素為20/ml 的牛肉湯（的牛肉湯（pH6.2），在），在121 加熱需要加熱需要37分鐘以上，才能滅活毒素。分鐘以上，才能滅活毒素。 第41頁/共125頁第四十一頁，共125頁。 金葡菌腸毒素的產(chǎn)生因菌株不同而有所差異，有資料顯示，金葡菌腸毒素的產(chǎn)生因菌株不同而有所差異，有資料顯示，食品中存在的金葡菌幾乎都產(chǎn)生腸毒素，以食品中存在的金葡菌幾乎都產(chǎn)生腸毒素，以SEA型為最多。型為最多。以往認(rèn)為凝固酶陽性的金葡菌能產(chǎn)生腸毒素，但不是都產(chǎn)以往認(rèn)為凝固酶陽性的金葡菌能產(chǎn)生腸毒素，但

43、不是都產(chǎn)生腸毒素。后有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，有些產(chǎn)生腸毒素的金葡菌株產(chǎn)生腸毒素。后有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，有些產(chǎn)生腸毒素的金葡菌株產(chǎn)生耐熱生耐熱DNA酶卻不產(chǎn)生凝固酶，即一些凝固酶陰性菌株也酶卻不產(chǎn)生凝固酶，即一些凝固酶陰性菌株也產(chǎn)生腸毒素，要鑒定是否是產(chǎn)毒株，需同時(shí)進(jìn)行產(chǎn)生腸毒素，要鑒定是否是產(chǎn)毒株，需同時(shí)進(jìn)行(jnxng)凝固酶和耐熱凝固酶和耐熱DNA酶測(cè)定試驗(yàn)。而耐熱酶測(cè)定試驗(yàn)。而耐熱DNA酶和腸毒素酶和腸毒素的耐熱力相近似，由此可見耐熱的耐熱力相近似，由此可見耐熱DNA酶的產(chǎn)生與腸毒素的酶的產(chǎn)生與腸毒素的關(guān)系較凝固酶更為平行。所以常用耐熱關(guān)系較凝固酶更為平行。所以常用耐熱DNA 酶試驗(yàn)代替酶試驗(yàn)代替腸毒素測(cè)定

44、。自腸毒素測(cè)定。自1982年起有些國家就提出進(jìn)口方便食品中年起有些國家就提出進(jìn)口方便食品中不得檢出含有耐熱不得檢出含有耐熱DNA酶的金葡菌。酶的金葡菌。第42頁/共125頁第四十二頁，共125頁。結(jié)核結(jié)核(jih)分枝桿菌分枝桿菌第43頁/共125頁第四十三頁，共125頁。分枝桿菌屬分枝桿菌屬M(fèi)ycobacterium一類直或微彎曲的桿菌，有分枝生長趨勢(shì)，可呈絲一類直或微彎曲的桿菌，有分枝生長趨勢(shì)，可呈絲狀或菌絲樣生長。細(xì)胞壁脂質(zhì)含量高（分枝菌酸），狀或菌絲樣生長。細(xì)胞壁脂質(zhì)含量高（分枝菌酸），耐酸，抗酸染色陽性。對(duì)氧和營養(yǎng)要求高，生長慢。耐酸，抗酸染色陽性。對(duì)氧和營養(yǎng)要求高，生長慢。不產(chǎn)生毒

45、素和侵襲酶類，引起慢性疾病。不產(chǎn)生毒素和侵襲酶類，引起慢性疾病。又稱抗酸桿菌又稱抗酸桿菌(acid-fast bacillus)-不易著色，可抵抗鹽酸酒精的脫色作用不易著色，可抵抗鹽酸酒精的脫色作用分類屬放線菌科，本屬有分類屬放線菌科，本屬有80多種，可分三類：多種，可分三類： 結(jié)核分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌和麻風(fēng)結(jié)核分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌和麻風(fēng)(mfng)分枝桿菌。分枝桿菌。 細(xì)菌的細(xì)菌的DNA G+Cmol%為為6270第44頁/共125頁第四十四頁，共125頁。 臨床標(biāo)本(biobn) 抗酸染色+ L-J分離培養(yǎng) +7天 +7天 緩生菌 速生菌 PNB + - - T2H + + - 非

46、典型分枝桿菌 人型結(jié)核分枝桿菌 牛型分枝桿菌 光反應(yīng)性試驗(yàn) 光產(chǎn)色菌 暗產(chǎn)色菌 不產(chǎn)色菌 分枝桿菌的鑒定程序 第45頁/共125頁第四十五頁，共125頁。結(jié)核結(jié)核(jih)分枝桿菌分枝桿菌一、分類一、分類結(jié)核分枝桿菌（結(jié)核分枝桿菌（MycobacteriumTuberculosis，TB）復(fù)合群：）復(fù)合群： 人結(jié)核分枝桿菌人結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis) 牛分枝桿菌牛分枝桿菌(M.bovis) 非洲非洲(fi zhu)分枝桿菌分枝桿菌 田鼠分枝桿菌田鼠分枝桿菌第46頁/共125頁第四十六頁，共125頁。二、細(xì)菌特性二、細(xì)菌特性形態(tài)染色形態(tài)染色(rns)(rns) TB TB菌細(xì)長

47、略彎曲，有時(shí)可見分枝，呈單、成堆或成束排列，菌細(xì)長略彎曲，有時(shí)可見分枝，呈單、成堆或成束排列，無鞭毛、無芽胞，有莢膜?？沙霈F(xiàn)多形性，在陳舊的病灶無鞭毛、無芽胞，有莢膜?？沙霈F(xiàn)多形性，在陳舊的病灶和培養(yǎng)物中，形態(tài)常不典型，可呈顆粒狀，串球狀，短棒和培養(yǎng)物中，形態(tài)常不典型，可呈顆粒狀，串球狀，短棒狀，長絲形等。狀，長絲形等。TBTB菌革蘭染色菌革蘭染色(rns)(rns)陽性。陽性。 熒光染料金胺熒光染料金胺O O染色染色(rns)(rns)，在熒光下菌體呈橘黃色。，在熒光下菌體呈橘黃色。 萋尼氏抗酸性染色萋尼氏抗酸性染色(rns)(rns)法染色法染色(rns)(rns)，菌體染成紅，菌體染成紅

48、色。色。 第47頁/共125頁第四十七頁，共125頁。第48頁/共125頁第四十八頁，共125頁。第49頁/共125頁第四十九頁，共125頁。第50頁/共125頁第五十頁，共125頁。第51頁/共125頁第五十一頁，共125頁。第52頁/共125頁第五十二頁，共125頁。第53頁/共125頁第五十三頁，共125頁。培養(yǎng)特性培養(yǎng)特性 專性需氧菌，專性需氧菌，3%5%的的CO2能促進(jìn)生長能促進(jìn)生長(shngzhng)。最適。最適ph 6.56.8 ，最適溫度為，最適溫度為37，低于，低于30難生長難生長(shngzhng)，營養(yǎng)要求高，在，營養(yǎng)要求高，在含有蛋黃、馬鈐薯、甘油和天門冬素等的固體培含

49、有蛋黃、馬鈐薯、甘油和天門冬素等的固體培養(yǎng)基上才能養(yǎng)基上才能生長生長(shngzhng)，且生長，且生長(shngzhng)緩緩慢。慢。 固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基-典型菌落為干燥、堅(jiān)硬、表面呈典型菌落為干燥、堅(jiān)硬、表面呈顆粒狀、顆粒狀、 乳酪色或淡黃色，形似菜花樣。乳酪色或淡黃色，形似菜花樣。 液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基-生長生長(shngzhng)較快呈粗糙較快呈粗糙皺紋狀菌膜生長皺紋狀菌膜生長(shngzhng)，有毒株可，有毒株可 呈索狀生長呈索狀生長(shngzhng)（吐溫干擾）。（吐溫干擾）。第54頁/共125頁第五十四頁，共125頁。菜花樣(huyng)菌落第55頁/共125頁第五十五頁，

50、共125頁。生化反應(yīng)生化反應(yīng) 生化不活潑。不發(fā)酵糖類，多數(shù)菌株觸酶陽生化不活潑。不發(fā)酵糖類，多數(shù)菌株觸酶陽性，熱觸酶性，熱觸酶陰性，非結(jié)核分枝桿菌正好相反。陰性，非結(jié)核分枝桿菌正好相反。結(jié)核分枝桿菌煙酸和硝酸鹽試驗(yàn)陽性，耐噻吩結(jié)核分枝桿菌煙酸和硝酸鹽試驗(yàn)陽性，耐噻吩2羧酸羧酸肼肼(T2H)，牛型則相反。有毒株中性紅試驗(yàn)陽，牛型則相反。有毒株中性紅試驗(yàn)陽性。性。變異性變異性 TB菌易發(fā)生形態(tài)、菌落、最適生長菌易發(fā)生形態(tài)、菌落、最適生長(shngzhng)溫度、毒力和耐藥性的變異。溫度、毒力和耐藥性的變異。如卡介苗、如卡介苗、Much顆粒和多重耐藥菌株出現(xiàn)等。顆粒和多重耐藥菌株出現(xiàn)等。第56頁/共

51、125頁第五十六頁，共125頁。 抵抗力抵抗力 TB TB菌細(xì)胞壁含大量脂類，抵抗力較強(qiáng)菌細(xì)胞壁含大量脂類，抵抗力較強(qiáng) 干痰中存活干痰中存活6-86-8個(gè)月，粘附個(gè)月，粘附(zhn f)(zhn f)塵埃上保持塵埃上保持傳染性傳染性8-108-10天。天。 3%HCL 3%HCL或或4%NaOH4%NaOH、6%H2SO46%H2SO4溶液中能耐受溶液中能耐受3030分鐘分鐘 常以酸堿中和處理嚴(yán)重污染的檢材，殺死雜菌和常以酸堿中和處理嚴(yán)重污染的檢材，殺死雜菌和消化粘稠物質(zhì)，提高檢出率消化粘稠物質(zhì)，提高檢出率 對(duì)一定濃度的孔雀綠有抵抗力。對(duì)一定濃度的孔雀綠有抵抗力。 對(duì)濕熱、紫外線、酒精的抵抗力

52、弱。對(duì)濕熱、紫外線、酒精的抵抗力弱。 ( (如在液體中加熱如在液體中加熱60306030分鐘，直射日光下分鐘，直射日光下2 23 3小小時(shí)，時(shí)，75%75%酒精內(nèi)數(shù)分鐘即死亡。酒精內(nèi)數(shù)分鐘即死亡。) )第57頁/共125頁第五十七頁，共125頁。三、臨床意義三、臨床意義TBTB菌引起結(jié)核病。對(duì)人類致病的有人菌引起結(jié)核病。對(duì)人類致病的有人(yu rn)(yu rn)結(jié)核分枝桿菌、牛型結(jié)核桿菌和非洲結(jié)核分枝桿菌、牛型結(jié)核桿菌和非洲分枝桿菌，人型結(jié)核桿菌感染引起的發(fā)病率最高。成為全球性重大公共衛(wèi)生問題。分枝桿菌，人型結(jié)核桿菌感染引起的發(fā)病率最高。成為全球性重大公共衛(wèi)生問題。所致疾病所致疾病TBTB菌

53、的致病作用可能是細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)增殖引起炎癥反應(yīng)，以菌的致病作用可能是細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)增殖引起炎癥反應(yīng)，以及誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)性損傷有關(guān)。通過呼吸道、消化道及誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)性損傷有關(guān)。通過呼吸道、消化道和破損的皮膚粘膜進(jìn)入機(jī)體，侵犯多種組織器官，引起相應(yīng)和破損的皮膚粘膜進(jìn)入機(jī)體，侵犯多種組織器官，引起相應(yīng)器官，其中以肺結(jié)核最常見?？煞衷l(fā)感染和繼發(fā)感染。器官，其中以肺結(jié)核最常見。可分原發(fā)感染和繼發(fā)感染。第58頁/共125頁第五十八頁，共125頁。免疫性TB菌的感染率很高，發(fā)病率卻較低，這表明人體感染結(jié)核桿菌可獲得一定的抗結(jié)核免疫力，這種免疫稱為有菌免疫或傳染性免疫。TB菌的免疫原rRNA和變應(yīng)

54、原結(jié)核菌素誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生(chnshng)由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)。第59頁/共125頁第五十九頁，共125頁。 致病物質(zhì)致病物質(zhì)1.1.脂質(zhì)脂質(zhì)占菌體干重的脂質(zhì)脂質(zhì)占菌體干重的202040%40%，占胞壁干重的，占胞壁干重的60%60%。磷脂：能刺激單核細(xì)胞增生，并可抑制蛋白酶的分解磷脂：能刺激單核細(xì)胞增生，并可抑制蛋白酶的分解作用作用(zuyng)(zuyng)，使病灶形成干酷樣壞死。，使病灶形成干酷樣壞死。 索狀因子：是分枝菌酸與海藻糖的復(fù)合物，具有破索狀因子：是分枝菌酸與海藻糖的復(fù)合物，具有破壞細(xì)胞線粒體膜，毒害微粒體酶類，抑制中性粒細(xì)胞游壞細(xì)胞線粒體膜，毒害微粒體酶類，抑制中性粒細(xì)

55、胞游走和吞噬作用走和吞噬作用(zuyng)(zuyng)，引起慢性肉牙腫。具有該物質(zhì)，引起慢性肉牙腫。具有該物質(zhì)的的TBTB菌毒株，在液體培養(yǎng)基中能緊密粘成索狀。菌毒株，在液體培養(yǎng)基中能緊密粘成索狀。 蠟質(zhì)蠟質(zhì)D D：是一種肽糖脂與分枝菌酸復(fù)合物，能引起：是一種肽糖脂與分枝菌酸復(fù)合物，能引起遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，并具有佐劑作用遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，并具有佐劑作用(zuyng)(zuyng)。 硫酸腦苷脂：硫酸腦苷脂：TBTB菌毒株胞壁中含有，能抑制吞噬細(xì)菌毒株胞壁中含有，能抑制吞噬細(xì)胞中的吞噬體與溶酶體融合，使結(jié)核桿菌在細(xì)胞內(nèi)存活。胞中的吞噬體與溶酶體融合，使結(jié)核桿菌在細(xì)胞內(nèi)存活。第60頁/共125頁第六

56、十頁，共125頁。2.2.莢膜主要為多糖，少量脂質(zhì)和蛋白莢膜主要為多糖，少量脂質(zhì)和蛋白質(zhì)。質(zhì)。 粘附和入侵分解物質(zhì)提供營粘附和入侵分解物質(zhì)提供營養(yǎng)防止有害物質(zhì)入侵養(yǎng)防止有害物質(zhì)入侵3.3.蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)TBTB菌菌體內(nèi)都含有數(shù)種蛋白菌菌體內(nèi)都含有數(shù)種蛋白質(zhì)，其中重要的蛋白質(zhì)是結(jié)核菌素。結(jié)質(zhì)，其中重要的蛋白質(zhì)是結(jié)核菌素。結(jié)核茵素與蠟質(zhì)核茵素與蠟質(zhì)D D結(jié)合，能引起較強(qiáng)的遲結(jié)合，能引起較強(qiáng)的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(bin ti fn yng)(bin ti fn yng)。其他蛋白質(zhì)可引起機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，其他蛋白質(zhì)可引起機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，但無保護(hù)作用。但無保護(hù)作用。第61頁/共125頁第六

57、十一頁，共125頁。 四、微生物學(xué)檢驗(yàn)四、微生物學(xué)檢驗(yàn)臨床標(biāo)本臨床標(biāo)本涂片檢查分離培養(yǎng)核酸檢測(cè)抗體檢測(cè)涂片檢查分離培養(yǎng)核酸檢測(cè)抗體檢測(cè)直接直接(zhji)(zhji)涂片集菌涂片處理標(biāo)本或無污染標(biāo)本涂片集菌涂片處理標(biāo)本或無污染標(biāo)本染色液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基動(dòng)物試驗(yàn)染色液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基動(dòng)物試驗(yàn)（羅氏或米氏）（羅氏或米氏）抗酸抗酸.金胺金胺O. O. 3737， 涂片鏡檢涂片鏡檢儀器培養(yǎng)儀器培養(yǎng) 7 7天生長天生長7 7天生長天生長快速生長菌慢生長菌菌種鑒定快速生長菌慢生長菌菌種鑒定抗酸染色菌落特點(diǎn)抗酸染色菌落特點(diǎn)鑒定試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)鑒定試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)第62頁/共125頁第六十二頁，共125頁。 標(biāo)本

58、采集標(biāo)本采集 感染部位不同，取不同的標(biāo)本，宜用能抑制污染菌的方法感染部位不同，取不同的標(biāo)本，宜用能抑制污染菌的方法 常見標(biāo)本：痰、尿、胸腹水等常見標(biāo)本：痰、尿、胸腹水等 檢查方法檢查方法 1.顯微鏡檢查顯微鏡檢查 1）直接涂片：用萋尼氏法染色）直接涂片：用萋尼氏法染色(rns)，若鏡檢找到抗酸性桿菌，通常應(yīng)報(bào)告：，若鏡檢找到抗酸性桿菌，通常應(yīng)報(bào)告：“查到抗酸性桿菌查到抗酸性桿菌”，需進(jìn)一步分離培養(yǎng)鑒定。，需進(jìn)一步分離培養(yǎng)鑒定。 2）濃縮集菌涂片：如標(biāo)本中菌量少，雜菌和雜質(zhì)多時(shí)，用離心沉淀法將菌濃縮聚）濃縮集菌涂片：如標(biāo)本中菌量少，雜菌和雜質(zhì)多時(shí)，用離心沉淀法將菌濃縮聚集，再取沉淀物涂片作抗酸染

59、色集，再取沉淀物涂片作抗酸染色(rns)檢查檢查 第63頁/共125頁第六十三頁，共125頁。 分離培養(yǎng)分離培養(yǎng) TB TB菌接種前處理液化和處理雜菌菌接種前處理液化和處理雜菌 4%NaOH 4%NaOH、6%H2SO46%H2SO4、胰酶、胰酶 15- 15-20min20min培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基選擇羅氏培養(yǎng)基羅氏培養(yǎng)基 鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基(PNB(PNB、T2HT2H、NAP)NAP)儀器培養(yǎng)儀器培養(yǎng)Bacte460Bacte460、BacT/ALERT3D BacT/ALERT3D 液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基 培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)時(shí)間長長 一般一般6-86-8周周 鑒定鑒定1.1.染色性染色性; 2.

60、; 2.菌落特征菌落特征; 3.; 3.生長速度生長速度; ; 4.4.色素產(chǎn)生色素產(chǎn)生; 5.; 5.生化生化(shn hu)(shn hu)試驗(yàn)試驗(yàn) 第64頁/共125頁第六十四頁，共125頁。 鑒別鑒別(jinbi)試驗(yàn)：試驗(yàn)： NAP(p-nitro-acetylamino-hydroxy-propiophenome)抑制試驗(yàn)抑制試驗(yàn) 結(jié)核分枝桿菌結(jié)核分枝桿菌 NAP- 非結(jié)核分枝桿菌非結(jié)核分枝桿菌 NAP+ 第65頁/共125頁第六十五頁，共125頁。 免疫學(xué)檢測(cè)免疫學(xué)檢測(cè) 1.結(jié)核菌素試驗(yàn)：結(jié)核菌素試驗(yàn)：OT或或PPD 遲發(fā)型超敏反應(yīng)。遲發(fā)型超敏反應(yīng)。 2.全血干擾素測(cè)定全血干擾素