臨床免疫學(xué)和免疫檢驗(yàn)免疫細(xì)胞的分離及其表面標(biāo)志檢測技術(shù)講義

1、第十四章免疫細(xì)胞的分離及其表面標(biāo)志檢測技術(shù)第一節(jié)免疫細(xì)胞的分離一、外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離外周血中單個(gè)核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）的比重與紅細(xì)胞、多核白細(xì)胞及血小板不同，介于1.075 1.090之間，紅細(xì)胞及粒細(xì)胞在 1.092左右，血小板在1.0301.035之間，因而可利用一種比重介于 1.075 1.092之間而近于等滲的溶液作密度梯度離心，使一定比重的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布而加以分離。分離介質(zhì)是分離各類細(xì)胞的關(guān)鍵，對(duì)分離介質(zhì)的基本要求是：對(duì)細(xì)胞無毒；基本等滲；不溶于 血漿及分離物質(zhì)；有特定的比重。Ficoll分離液為常規(guī)的淋巴細(xì)胞分離液，其比重為1.077 ± 0.002，主

2、要用于分離外周血中單個(gè)核細(xì)胞。其分布由上到下依次為：稀釋的血漿層、單個(gè)核細(xì)胞層、粒細(xì)胞層和紅細(xì)胞層。二、淋巴細(xì)胞的分離純淋巴細(xì)胞群的采集是利用單核細(xì)胞在37C和Ca2+存在時(shí)，能主動(dòng)黏附在玻璃、塑料、尼龍毛、棉花纖維或葡聚糖凝膠的特性，從單個(gè)核細(xì)胞懸液中除去單核細(xì)胞，從而獲得純淋巴細(xì)胞群。主要的方法有：1. 黏附貼壁法；2.吸附柱過濾法；3.磁鐵吸引法；4.Percoll分離液法。三、T、B細(xì)胞和T細(xì)胞亞群的分離（一）磁性微球分離法（二）熒光激活細(xì)胞分離儀分離法四、分離細(xì)胞的保存及活力測定1. 短期保存技術(shù)：將分離的細(xì)胞用適量含10%- 20%滅活小牛血清 的Hanks、Tc-199、RPMI

3、1640或其他培養(yǎng)液稀釋重懸。 短期保存可置于4C保存。2. 長期保存技術(shù)：液氮深低溫（-196 C）環(huán)境保存細(xì)胞，加入二甲亞砜作為保護(hù)劑?；盍y定最簡便常用的為臺(tái)盼藍(lán)染色法。這是一種陰離子型染料，不能透過活細(xì)胞正常完整的細(xì)胞膜，故活細(xì)胞不著色，但死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增加，可使染料通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使死細(xì)胞著色呈藍(lán) 色，通過死亡細(xì)胞與活細(xì)胞的百分比可反映細(xì)胞活力。第二節(jié)淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志及亞群分類常用于鑒定和檢測淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志的是簇分化抗原（CD。CD抗原的鑒定和檢測依賴于其相應(yīng)的單克隆抗體。一、T細(xì)胞表面標(biāo)志及其亞群T細(xì)胞是參與機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)并起主導(dǎo)調(diào)節(jié)作用的一組免疫細(xì)胞。所有的T細(xì)

4、胞均有共同的標(biāo)志性抗原，一般認(rèn)為是 CD3分子，不同功能的 T細(xì)胞亞群又有各自的標(biāo)志性抗原。根據(jù)T細(xì)胞的免疫效應(yīng)功能和表面CD分子表達(dá)至少可以將 T細(xì)胞分為：CD3CD4CD8輔助性T細(xì)胞（help T cell Th ）、CD3CD4CD8細(xì) 胞毒性 T 細(xì)胞（cytotoxic T cell ,Tc 或 CTL）和 CD4CD25調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞（regulatory T cell ,Tr 或 Treg ） 等幾組亞群。（一） T細(xì)胞表面主要的 CD抗原1. CD2表達(dá)于全部人 T細(xì)胞和NK細(xì)胞表面，因其能與綿羊紅細(xì)胞（SRBC結(jié)合，又稱為綿羊紅細(xì)胞 受體。2. CD3:表達(dá)于全部T細(xì)胞表

5、面，是T細(xì)胞的表面標(biāo)志，是TCR-CD3復(fù)合物的重要組成部分。3. CD4/CD8: CD4和CD8分子分別表達(dá)于外周血不同的T細(xì)胞亞群表面，是區(qū)分T細(xì)胞亞群的重要標(biāo)志。表達(dá)CD4的主要是輔助性T細(xì)胞，表達(dá)CD8的主要是細(xì)胞毒性 T細(xì)胞。4. 致有絲分裂受體、病毒受體。（二） T細(xì)胞亞群1. 輔助性T細(xì)胞：表面標(biāo)志是 CD3CD4CD8。主要有兩種輔助性 T細(xì)胞（Th1, Th2）,其產(chǎn)生的細(xì)胞因 子不同。Th1主要分泌IL-2、IFN- Y或TNF- B等細(xì)胞因子輔助細(xì)胞免疫或參與遲發(fā)型超敏反應(yīng)，本身具有 明顯的細(xì)胞毒作用；Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6或IL-10等細(xì)胞因子輔助

6、體液免疫，參與速發(fā)型超敏 反應(yīng)，但本身不具有明顯的細(xì)胞毒作用。2. 細(xì)胞毒性 T細(xì)胞：表面標(biāo)志是 CD3CD4CD8。分泌細(xì)胞因子的特征與Th1和Th2十分相似，遂細(xì)分為Tc1與Tc2, Tc1與Tc2都有典型的細(xì)胞毒性效應(yīng)。3. 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞：主要包括兩個(gè)亞群，一種是 CD4CD25調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；另一種為 CD8調(diào)節(jié)性T細(xì)胞， 其主要包括CD8CD28調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和CD8CD28限制性的調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞。二、B細(xì)胞表面標(biāo)志B細(xì)胞活化后轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞，分泌抗體，執(zhí)行體液免疫功能。B細(xì)胞表面的膜免疫球蛋白（Smlg）、Fc受體、補(bǔ)體受體、EB病毒受體和小鼠紅細(xì)胞受體是B細(xì)胞的重要表面標(biāo)志，其中以Sm

7、Ig為B細(xì)胞所特有，是鑒定B細(xì)胞可靠的指標(biāo)。 B細(xì)胞表面較特異的 CD分子有CD19 CD20 CD21 CD22和 CD23等，其中有些 屬全體B細(xì)胞共有的標(biāo)志，而有些僅是活化B細(xì)胞特有，據(jù)此可用單克隆抗體，通過間接熒光免疫法、酶免疫組化法或流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)其進(jìn)行檢測。膜免疫球蛋白（mlg）又稱為BCR表達(dá)于所有成熟的 B細(xì)胞表面，是 B細(xì)胞最具特性的表面標(biāo)志。mIg的主要作用是結(jié)合特異性抗原，故又稱為抗原受體。成熟B細(xì)胞的mIg主要為mIgM和mlgDtB細(xì)胞及其亞群的檢測是研究自身免疫性疾病及疾病中免疫調(diào)節(jié)紊亂的重要指標(biāo)。三、NK細(xì)胞表面標(biāo)志NK細(xì)胞的表面標(biāo)志：人類 NK細(xì)胞表面標(biāo)志主要以

8、 CD16 CD56來認(rèn)定。目前NK標(biāo)志以CD3、CD1& CD56為公認(rèn)。CD16分子又稱為低親和性IgG Fc受體，當(dāng)IgG類抗體與靶細(xì)胞表面相應(yīng)抗原表位特異性結(jié) 合后，可通過其Fc段與NK細(xì)胞表面FcR川結(jié)合，行使針對(duì)靶細(xì)胞的定向非特異性殺傷作用，也即NK細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC。第三節(jié)抗原提呈細(xì)胞（APC指能攝取、加工、處理抗原，并將抗原提呈給抗原特異性淋巴細(xì)胞的一類免疫細(xì)胞?？乖岢始?xì)胞可分為兩類：“專職”抗原提呈細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和B細(xì)胞，它們均可表達(dá) MHC-H類分子；“非專職”抗原提呈細(xì)胞，包括內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和激活T細(xì)胞等，它們?cè)谀?/p>

9、些因素刺激下可表達(dá)MHC-H類分子，并具有抗原提呈功能。另外，所有表達(dá) MHC-I類分子并具有提呈內(nèi)源性抗原能力的細(xì)胞，廣義上也屬于抗原提呈細(xì)胞。一、單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)（MPS包括骨髓內(nèi)的前單核細(xì)胞、外周血中的單核細(xì)胞和組織內(nèi)的巨噬細(xì)胞。單核-吞噬細(xì)胞的典型的表面標(biāo)志是CD14二、樹突狀細(xì)胞（DC樹突狀細(xì)胞（DC是一大類專職抗原提呈細(xì)胞，其主要有兩種來源，即髓系和淋巴系。DC是形態(tài)、表型和功能高度異質(zhì)的細(xì)胞。根據(jù)刺激T細(xì)胞增殖能力的不同，它們被分為成熟和不成熟的DC根據(jù)誘導(dǎo)T細(xì)胞分化為不同效應(yīng) T細(xì)胞的功能，將它們分為誘導(dǎo)分化Th1的DC（ DC1和誘導(dǎo)分化Th2的DC（DC

10、2 ;根據(jù)明顯的譜系和細(xì)胞表型的不同，分為骨髓DC和淋巴DG人成熟DC的主要特征表面標(biāo)志為 CD1a CD11c和CD83但不表達(dá)其他淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)志。第四節(jié) 免疫細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測及應(yīng)用一、免疫細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測方法通常采用相應(yīng)的標(biāo)記單克隆抗體為探針，通過標(biāo)志物對(duì)陽性細(xì)胞作出指示，對(duì)有關(guān)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，根 據(jù)標(biāo)志物的不同形成了不同的檢測方法，有代表性的幾種方法為：（一）抗體致敏細(xì)胞花環(huán)法（二）免疫細(xì)胞化學(xué)法（三）免疫熒光法：將分離得到的外周血單個(gè)核細(xì)胞與相應(yīng)的以熒光素標(biāo)記的CD單克隆抗體作用（直接法），或與抗相應(yīng) CD單克隆抗體作用后，洗去游離的抗體，再加入熒光素標(biāo)記的抗小鼠IgG抗血清（間

11、接法），制片后用熒光顯微鏡觀察結(jié)果，計(jì)算陽性細(xì)胞占總計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分率。（四）流式細(xì)胞分析法：目前免疫細(xì)胞的檢測主要采用流式細(xì)胞術(shù)，結(jié)果客觀準(zhǔn)確，重復(fù)性好。二、淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志檢測的臨床意義淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志檢測是評(píng)價(jià)免疫功能的重要指標(biāo)。由于淋巴細(xì)胞，特別是T淋巴細(xì)胞在執(zhí)行免疫功能方面發(fā)揮多種作用，故有必要對(duì)各類淋巴細(xì)胞（淋巴細(xì)胞亞群）進(jìn)行分析。這中間主要是通過表面標(biāo)志 識(shí)別進(jìn)行計(jì)數(shù)。在評(píng)價(jià)免疫功能時(shí)經(jīng)常采用CD4/CD8比值。如CD4是HIV受體，HIV感染時(shí)CD4/CD8比值明顯降低。但CD4陽性細(xì)胞包括了很多功能性細(xì)胞，女口Th、Tr等，CD8陽性細(xì)胞也是如此，所以單用CD4/CD8比值反映

12、免疫功能顯然不夠準(zhǔn)確。除 AIDS患者外，實(shí)際觀察 CD4/CD8比值與患者的免疫功能及臨床癥狀的關(guān)系及意義 有限。對(duì)CD4和CD8T細(xì)胞的測定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反應(yīng)的監(jiān)測。CD4/CD8升高常見于自身免疫性疾??；而CD4/CD8降低常見于病毒感染、惡性腫瘤和再生障礙性貧血等。外周血中單個(gè)核細(xì)胞包括A. 有核紅細(xì)胞B. 淋巴細(xì)胞C. 單核細(xì)胞D. 淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞E. 粒細(xì)胞正確答案D答案解析外周血中單個(gè)核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。外周血單個(gè)核細(xì)胞的比重介于A. 1.001 1.075B. 1.012 1.030C. 1.030 1.035D. 1.075 1.

13、090E. 1.092 1.098正確答案D答案解析外周血中單個(gè)核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）的比重與紅細(xì)胞、多核白細(xì)胞及血小板不同，介于1.0751.090之間。Ficoll密度梯度分層液主要用于分離外周血中的A. 粒細(xì)胞B. 單個(gè)核細(xì)胞C. 紅細(xì)胞D. 巨噬細(xì)胞E. 血小板正確答案B答案解析Ficoll分離液為常規(guī)的淋巴細(xì)胞分離液，其比重為1.077 ± 0.002，主要用于分離外周血中單個(gè)核細(xì)胞。采用Ficoll密度梯度分離液處理血液后，分離結(jié)果從上至下依次為A. 稀釋的血漿、粒細(xì)胞、單個(gè)核細(xì)胞、紅細(xì)胞B. 稀釋的血漿、紅細(xì)胞、單個(gè)核細(xì)胞、粒細(xì)胞C. 單個(gè)核細(xì)胞、稀釋的血漿、粒細(xì)

14、胞、紅細(xì)胞D. 稀釋的血漿、單個(gè)核細(xì)胞、粒細(xì)胞、紅細(xì)胞E. 稀釋的血漿、單個(gè)核細(xì)胞、紅細(xì)胞正確答案D答案解析Ficoll分離液為常規(guī)的淋巴細(xì)胞分離液，其比重為1.077 ± 0.002，主要用于分離外周血中單個(gè)核細(xì)胞。其分布由上到下依次為：稀釋的血漿層、單個(gè)核細(xì)胞層、粒細(xì)胞層和紅細(xì)胞層。玫瑰花環(huán)形成細(xì)胞指的是A. B淋巴細(xì)胞B. T淋巴細(xì)胞C. 紅細(xì)胞D. 粒細(xì)胞E. 單核細(xì)胞正確答案B答案解析玫瑰花環(huán)形成細(xì)胞指的是T淋巴細(xì)胞?？赏ㄟ^ADCC介導(dǎo)細(xì)胞毒作用的細(xì)胞是A. 漿細(xì)胞B. CTLC. B細(xì)胞D. NK細(xì)胞E. 肥大細(xì)胞正確答案D答案解析CD16分子又稱為低親和性IgG Fc受體，當(dāng)IgG類抗體與靶細(xì)胞表面相應(yīng)抗原表位特異性 結(jié)合后，可通過其 Fc段與NK細(xì)胞表面FcR川結(jié)合，行使針對(duì)靶細(xì)胞的定向非特異性殺傷作用，也即 NK細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC。淋巴細(xì)胞活力檢測最常用的方法是A. 細(xì)胞培養(yǎng)B. 伊紅染色C. 臺(tái)盼藍(lán)染色D. 瑞氏染色E. 細(xì)胞計(jì)數(shù)正確答案C答案解析