乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率逐年上升的趨勢并且發(fā)病

1、論著人乳腺癌原代培養(yǎng)體外藥敏試驗研究100021北京中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤所生物檢測中心李艷芬，tn海梅，陳國際r曹冬艷，劉毅，李茉，王小兵，劉朝陽，梁智，程冬婉，張偉|摘要目的：探討用atp生物熒光腫瘤體外約敏檢測技術(shù)(atp-tca)研究乳腺癌約敏 的界質(zhì)性和個體化療的可行性。方法：用atp-tca檢測114例乳腺癌標木對13種單藥或聯(lián) 合用藥的敏感性。結(jié)果：個體z間的藥物敏感性存在著明顯的界質(zhì)性。單藥中最有效的藥物 為紫杉醇、長春瑞濱、表阿霉素、絲裂霉素和阿霉素，分別有73.3%、64.1%、62.3%、49.9 %和40.0%的標木對其敏感。聯(lián)合用約(紫杉醇+表阿霉素，環(huán)磷酰胺+表

2、阿霉素+氟尿喘 嚨)的敏感率高于單約。結(jié)論：乳腺癌對抗癌約物的敏感程度存在著異質(zhì)性。atp生物熒光 腫瘤紗敏檢測技術(shù)可用于為乳腺癌選擇合適的化療約物。關(guān)鍵詞atp生物熒光腫瘤藥敏檢測技術(shù)；乳腺癌；化療藥物敏感性中圖分類號：r737.9文獻標識碼：a文章編號：1009-0460(2006)00-0000-00evaluation of chemosensitivity of human breast cancer determined by primary culture assay in vitroli yan-fen, tian hai-mei, chen guo-ji, cao dong-

3、yan, liu yi, li mo, wang xiao-bing, liu zhao-yang, liang zhi, cheng dong-wan, zhang wei. tumor marker research center, cancer hospital/institute, chinese academy of medical sciences, peking union medical college, beijing 100021, chinacorresponding auther: zhang wei, e-mail： zhangww 1954 abstract obj

4、ective to investigate the heterogeneity of chemosensitivity in breast cancer using an atp-tumor chemosensitivity assay (atp-tca) and the feasibility of individual chemotherapy methods an atp-tca was used to determine the effect of 13 single or combined cytotoxic drugs in surgical specimens from 114

5、patients with breast cancer cancer. results there were considerable differences in chemosensitivity between individuals. the most active single drug in the assay was identified as paclitaxel, navelbine, epirubicin, mitomycin and adriamycin, 73.3%, 64.1 %, 62.3%, 49.9% and 40.0% of specimens showed s

6、ensitivity to them, respectively. combination of chemotherapy (paclitaxel+epirubicin, cyclophosphamide+epirubicin+5-fluorouracil) was found to be more effective than relative drugs alone conclusions there was the heterogeneity of the in vitro chemosensitivity in breast cancer. the use of the atp-tca

7、 provide a method of selecting appropriate anti-cancer drugs in breast cance匚key words atp-tumor chemosensitivity assay; breast cancer; chemosensitivity1 通訊作者 張偉 tel: e-mail: zhangwwl9542 100021北京中國頁學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤所腹部外科陳國際乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤z-,其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，并冃發(fā)病年齡冇下 降的趨勢?；熓侨橄侔┚C合治療的重要組成部分。由于乳腺癌對化

8、療約物的嫩感性存在個 體差異，因此在化療詢通過體外藥敏試驗為每個病人篩選敏感性藥物，有針對性地用藥，有 可能提高化療的療效以及降低不良反應(yīng)。atp生物熒光腫瘤體外藥敏檢測技術(shù)（atp-tumor chemosensitivity assay, atp-tca）是目前較為先進的體外約敏檢測技術(shù)山習(xí)，其原理是在有 氧和atp的條件下，熒光酶催化熒光素發(fā)出熒光，強度與atp含量呈正相關(guān)。因為細胞死亡 后，胞內(nèi)的atp被迅速水解并且活細胞中atp含量基本恒定。所以，所測得熒光強度可間接 反映出存活細胞量。從而可根據(jù)其判斷抗腫瘤藥物的藥敏結(jié)果。腫瘤細胞存活率越低,說明腫 瘤細胞對該化療藥物敏感性越高，殺

9、傷力也越強,反之則敏感性越低。我們用atp-tca方法對 114例新鮮的初發(fā)乳腺癌手術(shù)標本進行了體外藥敏檢測，現(xiàn)報道如下。1材料與方法1 .1腫瘤標本 收集2002年2月2005年2月我院和外院的114例行改良根治術(shù)的乳腺癌 于術(shù)標本。其中浸潤性導(dǎo)管癌91例，浸潤性小葉癌12例，導(dǎo)管內(nèi)癌6例，髓樣癌4例，浸 潤性小葉癌合并導(dǎo)管內(nèi)癌1例；tnm分期為i期22例，ii期79例，iii期13例；114例患 者，年齡3172歲，屮位年齡48歲。均為原發(fā)腫瘤，術(shù)前未經(jīng)放化療或免疫治療。1.2化療藥物 所用的化療藥物的100%測試約物濃度（100%tdc）見表u聯(lián)合用約的每 個藥物的濃度與單藥濃度相同。表

10、1所用的化療約物及劑量藥物100%tdc ( u g/ml)氟尿喘陀（5-fu）25.00健擇(gem)25.00足葉乙貳（vp16）20.00紫杉醇（ptx）10.00環(huán)磷酰胺（ctx）*2.75阿霉素（adm）loo表阿霉索（epi）1.00長春瑞濱（nvb）1.00米托蔥酮（mito）0.80絲裂霉素（mmc）0.50徑基喜樹堿（hcpt）0.30*因ctx在體外無活性，實驗中所采用的是ctx的體內(nèi)活化物4-hco1.3儀器和試劑 熒光測定儀mpl1型（徳國berthold公司）。atp生物熒光腫瘤藥物敏感性 檢測試劑盒，含混合消化酶、培養(yǎng)基、紅細胞去除液、細胞培養(yǎng)板（96孑l）、atp

11、提取液和 熒光酶一熒光索工作液（北京金紫晶生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）。1.4體外藥敏檢測實驗 無菌取得的新鮮乳腺癌手術(shù)標木，在含抗牛素的培養(yǎng)基屮浸泡25min 后，剪成0.5lmn?碎塊，置于50ml離心管中，加用培養(yǎng)基稀釋1倍的混合消化酶10ml, 于37°c消化過夜。用培養(yǎng)基洗滌2次，獲得單細胞懸液。臺盼藍染色，計數(shù)活的腫瘤細胞。先加待測藥物于96孔培養(yǎng)板,每個藥物設(shè)100%、5（）%、25%、12.5%和6.25%tdc5個濃 度，每個濃度2個平行孔，并設(shè)無藥對照（m0）,和最大抑制對照（mi）。接種腫瘤細胞，細 胞數(shù)為2xl04個/孔。在37°c, 5%co2條件下培養(yǎng)

12、5d后，開始測定。最大抑制對照孔加50 最大抑制劑，其余各孔加50u1atp提取液，在震蕩器上震蕩30s,室溫靜置5min0再次 震蕩混勻。每孔取50p1液體，按相應(yīng)的位置加到熒光測試板內(nèi)，每孔加入50卩1熒光素一熒 光酶混合液。再次震蕩混勻5s,立刻在熒光掃描儀上測定熒光強度。1.5藥敏檢測判定標準 計算藥物ic90和ic50o ic90<90%且ic50v25%判定為高度敏感； ic90<90%或ic50v25%判定為屮度敏感；ic90>90%且ic50>25%判定為不敏感。1.6統(tǒng)計學(xué)分析用spss 10.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間數(shù)據(jù)比較用x?檢驗。2結(jié)果2.1標

13、本的可評價率 本研究收集的114例標本屮，冇104例進行了成功的體外藥敏檢測， 可評價率為91.2%。10例不成功的標本中，8例來口 i期患者，2例來門ii期患者，均是由 于標本較小，獲得的細胞數(shù)太少而放棄檢測。2.2乳腺癌標木的藥物敏感性個體差異性104例乳腺癌標木進行了 4至13種單藥和/或聯(lián)合 用藥的藥敏檢測，其中56份僅選用了 411種單藥，其余48例選用了單藥和聯(lián)合用藥。104 例標本屮，冇30例（28.8%）冇至少1個高敏感藥物，其余74例（71.2%）冇至少1個屮度 敏感約物。附圖顯示的是2例典型化療藥物體外抑制腫瘤生長曲線。圖a所示的病例對ptx 高度敏感，而圖b所示的病例對a

14、dm高度敏感?？梢娙橄侔吮镜乃幬锩舾行源嬖趥€體差 異。1001005025測試藥物濃度（tdc）12.56.25adm k-mmc-gem -hcpt-aepi vp16-5-fu ptx1001005025測試藥物濃度（tdc）12.56.25adm -5-fu-ptx -hcpt-amito fgemtvp16 ptx圖a、b二個典型病例的體外藥敏測試結(jié)果2.3化療藥物的體外抑瘤活性 表2顯示乳腺癌標本對11種單藥和2種聯(lián)合用藥的敏感性。 在所測試的單藥中，乳腺癌標本對ptx的高度敏感率最高，為13.9%,而刈其余10個單藥 的高度敏感率均低于10%。如將高度敏感率和屮度敏感率之和定義為

15、敏感，那么敏感的順序 為 ptx> nvb>epi>mmc>adm,分別為 73.3%、64.1%、62.3%、49.9%和 40.0%,其余 6 種單藥的敏感率在20%40%之間。ptx+epi和ctx+epi+5-fu兩種聯(lián)合用藥的敏感率 分別為97.9%和93.6% （表2）,遠遠高于任一單藥，差異有顯著性意義（pv0.01）,但2 種聯(lián)合用藥之間無顯著性差異（q0.05）。單藥和聯(lián)合用藥的敏感率與臨床實驗報道的冇效率 基本相符i】。表2乳腺癌標本對11種單約和2種聯(lián)合用約的敏感譜單藥或聯(lián)合高度敏感（）屮度敏感（）休外敏感率-（%）臨床有效率ptx13.9 (14

16、/101)59.4 (60/101)73.332 62nvb9.7 (10/103)54.4 (56/103)6440 44epi5.7 (3/53)56.6 (30/53)62.316 62mmc3.8 (1/26)46(12/26)49.925 38adm3.6 (2/55)36.4 (20/55)40.043 545-fu9.4 (9/96)29(28/96)38.528gem3.7 (3/81)30.8 (25/81)34.525 37ctx4.0 (1/25)28.0 (7/25)32.034mito2.0 (1/50)2&0 (14/50)30.020 30hcpt2.9

17、(2/70)24.3 (17/70)27.2無報道vp162.9 (2/70)17.1 (12/70)20.0018.2ptx+epi39.6 (19/48)58.3 (28/48)97.950 94ctx+epk 5-fu10.6 (5/47)83.0 (39/47)93.670 893.討論atp-tca法是口前較為先進的體外腫瘤藥敏檢測方法。試驗所需要的細胞數(shù)量較少，標 本的可評價率較高。在各種實體瘤中，乳腺癌的標本較碩，內(nèi)有大量的纖維，操作時應(yīng)盡可 能剪碎，并用稀釋1倍的混合消化酶消化過夜，否則難以或得單細胞懸液。這是保證試驗成 功的比較重要的步驟。另外還要注意取材時避開壞死較多的區(qū)域

18、，盡量保證標本塊不小于 lcm本研究用atp-tca法對114例初發(fā)乳腺癌標本進行體外腫瘤藥敏檢測，104例獲得成 功，可評價率為91.2%。木研究的體外藥敬結(jié)杲顯示，不同患者的的藥物嫩感性有個體羌異性（附圖）o 104例標 本中，有30例（28.8%）有至少1個高敏感藥物，其余74例（71.2%）有至少1個中度敏感 藥物。結(jié)果提示atp-tca法可以為患者篩選相對敏感的藥物，為臨床上有針對性地用藥提供 直接的實驗依據(jù)。乳腺癌是對化療敏感性癌種。本研究的體外藥敏結(jié)果顯示，乳腺癌化療屮常用的ptx、 nvb、epi、mmc、adm、5fu、gem和ctx單藥的敏感性在32%以上，其余5種單藥 的

19、敏感性較低（表2）,與臨床上觀察的冇效率基本一致，提示體外藥敏結(jié)果可以反映體內(nèi) 藥物敏感性。但體外環(huán)境尚不能完全模擬體內(nèi)環(huán)境。例如體外實驗屮腫瘤細胞已被分散成單 細胞，可以與化療藥物充分接觸，在體內(nèi)顯然不可能達到如此充分的接觸，因此體外藥敏結(jié) 果可能略高于體內(nèi)有效率。本研究的結(jié)呆顯示，聯(lián)合用藥的敏感性遠高丁單藥。紫杉類和蔥 環(huán)類約物聯(lián)合化療方案是治療乳腺癌最強的方案，臨床報道一線有效率高達94%習(xí)。另一個 聯(lián)合化療方案，即5-fu和恵環(huán)類和ctx方案可給局部晩期病人帶來70%89%的有效率 l3a，,jo我們的結(jié)果與臨床上觀察的有效率基木一致。國外在晚期乳腺癌上進行的應(yīng)用atp-tca法體外藥

20、敏結(jié)果和體內(nèi)有效率的對比研究表 明，體內(nèi)外的結(jié)果比較一致即叫 敏感性為90%,特異性為86%叫 本研究的結(jié)果顯示,應(yīng) 用atp-tca法進行乳腺癌體外藥墩檢測，可評價率為91.2%；所得到的各種單藥和聯(lián)合用藥 的體外藥物敏感性與臨床上觀察的冇效率基本一致。結(jié)果提示，atp-tca法可以用于乳腺癌 體外藥敏檢測。參考文獻1 傅軍，張偉.atp生物熒光腫瘤休外藥敏檢測技術(shù)及其臨床應(yīng)用研究進展j.中國腫瘤臨床 與康復(fù),2004, 11（3）:274-277.2 kurbacher cm, cree ia. chemosensitivity testing using microplate adeno

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