液體MS培養(yǎng)基劇烈振蕩培養(yǎng)法制備大豆成熟胚愈傷組織的實(shí)驗設(shè)計

1、    液體ms培養(yǎng)基劇烈振蕩培養(yǎng)法制備大豆成熟胚愈傷組織的實(shí)驗設(shè)計    栗志摘 要：本文設(shè)計并討論了一種通過液體ms培養(yǎng)基劇烈振蕩培養(yǎng)的方式，由大豆成熟胚誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的思路，通過實(shí)驗確定了其可行性，并通過實(shí)驗和統(tǒng)計，尋找到一種比較適宜的優(yōu)化培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度為25±1、光照10001500lx 12h/d、 蔗糖濃度30g/l、 ph 5.86.0、1mg/l 2，4-d和0.25mg/l 6-ba、 100r/min振蕩培養(yǎng)。關(guān)鍵詞：大豆;成熟胚;愈傷組織;植物組織培養(yǎng);液體培養(yǎng)基;劇烈振蕩;實(shí)驗設(shè)計：s-3    

2、;   ：adoi：10.19754/j.nyyjs.20201030021引言用植物組織制備愈傷組織是植物組織培養(yǎng)過程中非常重要也非常典型的步驟，也是后續(xù)研究步驟的基礎(chǔ) 1，傳統(tǒng)的愈傷組織制備方法是將消毒后的植物組織接種在生長素、細(xì)胞分裂素等植物激素的固體或半固體培養(yǎng)基上，讓植物組織細(xì)胞在生長分裂的同時逐步脫分化，生長出愈傷組織，隨后這些愈傷組織可用于固體培養(yǎng)或液體懸浮培養(yǎng)等實(shí)驗操作。植物組織作為外植體，需要和在植物體內(nèi)相似的環(huán)境來保證生存需要，在傳統(tǒng)方法中之所以接種在含瓊脂的固體、半固體培養(yǎng)基，而非接種在液體培養(yǎng)基上，原因是植物組織組織需要充足的氧氣來滿足持生理活動的需要，如果在

3、靜止的液體培養(yǎng)基中沉沒，會因缺氧會導(dǎo)致生長抑制，甚至導(dǎo)致植物組織死亡，heller（1953）曾采用紙橋法讓植物組織在接觸液態(tài)培養(yǎng)基的同時漂浮在液體培養(yǎng)基表面，以免沉沒缺氧死亡2。大豆（glycine max）是重要的糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物，大豆成熟胚是常用于誘導(dǎo)愈傷組織的材料，常用的大豆胚愈傷組織誘導(dǎo)方法使用的是固體培養(yǎng)基3。本文嘗試通過液體培養(yǎng)基劇烈振蕩培養(yǎng)的方法，讓大豆成熟胚在無瓊脂、無紙橋的情況下，保證氧氣供應(yīng)，于液相環(huán)境生長，并設(shè)置不同的條件組合，尋找較為適合液相直接培養(yǎng)法制備愈傷組織的參數(shù)，以期打開一條制備原生質(zhì)體的新思路。1 實(shí)驗準(zhǔn)備1.1 試驗材料新鮮的大豆（glycine max

4、）種子（品系為南農(nóng)46）。1.2 試劑及設(shè)備有效氯含量為5.5%6.5%的次氯酸鈉溶液、75%乙醇溶液、無菌水、ms培養(yǎng)基、蔗糖、植物生長素2，4-d、細(xì)胞分裂素6-ba、1mol·l-1naoh溶液、精密ph試紙、錐形瓶、棉塞、培養(yǎng)皿、解剖剪、解剖刀、鑷子、超凈工作臺、恒溫?fù)u床。2 實(shí)驗步驟挑取新鮮、飽滿、種皮完整、含水量高、未經(jīng)過干燥處理的大豆種子，在75%乙醇溶液中浸泡1min，隨后在5.5%6.5%次氯酸鈉溶液中浸泡5min，用無菌水沖洗4次，于無菌狀態(tài)下用解剖剪和鑷子剝?nèi)シN皮，去除子葉，取出完整的成熟胚作為外植體，用無菌水沖洗后，接種于高溫蒸汽滅菌冷卻后的加入不同激素濃度的

5、液態(tài)ms培養(yǎng)基上，以不同振蕩轉(zhuǎn)速在恒溫?fù)u床上培養(yǎng)。選用ms作為培養(yǎng)基，用1mol·l-1 naoh溶液調(diào)節(jié)ph。4個固定參數(shù)為：培養(yǎng)溫度25±1、光照10001500lx 12h·d-1、蔗糖濃度30g·l-1、ph 5.86.03-5。2個變動參數(shù)為：振蕩轉(zhuǎn)速分為6檔： 25r·min-1，50r·min-1，75r·min-1，100r·min-1，125r·min-1，150r·min-1。植物激素濃度分為5檔：無激素、0.5mg·l-1 2， 4-d + 0.125mg

6、3;l-1 6-ba、 1mg·l-1 2， 4-d + 0.25mg·l-1 6-ba、 2mg·l-1 2， 4-d + 0.5mg 6-ba、4mg·l-1 2， 4-d + 1mg 6-ba 。每份液體培養(yǎng)基的體積為50ml，接種的大豆胚數(shù)量為3個，相同條件重復(fù)樣本數(shù)量為3個，每24h觀察1次胚形態(tài)的變化和愈傷組織的誘導(dǎo)狀況，接種14d后稱取、計算愈傷組織的平均重量。3 實(shí)驗結(jié)果振蕩轉(zhuǎn)速和大豆成熟胚愈傷組織生長情況存在顯著的相關(guān)性（參見圖1）。在25r·min-1轉(zhuǎn)速情況下，大豆成熟胚呈現(xiàn)一定程度的浸沒缺氧狀態(tài)，生長速度較為緩慢甚至逐步

7、停滯，愈傷組織誘導(dǎo)效率很低;在50r·min-1轉(zhuǎn)速下，大豆成熟胚浸沒缺氧狀態(tài)明顯減輕，生長速度顯著加快，愈傷組織誘導(dǎo)效率提升;75r·min-1轉(zhuǎn)速下，大豆成熟胚基本不表現(xiàn)出浸沒缺氧狀態(tài)，生長速度和愈傷組織誘導(dǎo)效率繼續(xù)提升;100r·min-1轉(zhuǎn)速下，大豆成熟胚不表現(xiàn)出浸沒缺氧狀態(tài)，生長速度和愈傷組織誘導(dǎo)效率趨于頂峰;125r·min-1和150r·min-1轉(zhuǎn)速下，大豆成熟胚不表現(xiàn)出浸沒缺氧狀態(tài)，生長速度和愈傷組織誘導(dǎo)效率相比于100r·min-1只有輕微波動，顯示出近似“飽和”的狀態(tài)，但過于劇烈的振蕩狀態(tài)不僅耗費(fèi)更多能量，也會產(chǎn)

8、生較多泡沫，不利于下一步的實(shí)驗操作。根據(jù)文獻(xiàn)資料，在固體ms培養(yǎng)基上，大豆成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)最適的2，4-d和6-ba濃度為2mg·l-1和0.5mg·l-13-5，但在液體培養(yǎng)基中，最適2，4-d和6-ba濃度有所不同（參見圖2），相比于無激素組，添加0.5mg·l-1 2， 4-d和0.125mg·l-16-ba、1mg·l-1 2， 4-d和0.25mg·l-16-ba可以在一定程度上增加愈傷組織的誘導(dǎo)效率，但2mg·l-1 2， 4-d和0.5mg·l-16-ba、4mg·l-12， 4-d和1m

9、g·l-16-ba對愈傷組織誘導(dǎo)有抑制效果，其中4mg·l-12， 4-d和1mg·l-16-ba的抑制效果尤為明顯。根據(jù)逐日觀察的記錄，大豆成熟胚在液體ms培養(yǎng)基中的生長可分為3個階段（參見圖3）：13d：胚生長階段，胚不斷膨脹、伸長，體積顯著增加，但形態(tài)不發(fā)生明顯變化。48d：生根階段，胚開始長出根系，根系隨著時間推移不斷延伸，形態(tài)發(fā)生明顯變化。914d：愈傷組織生成階段，形態(tài)進(jìn)一步變化，在上胚軸的位置開始出現(xiàn)愈傷組織，呈現(xiàn)白色到淡黃色不規(guī)則團(tuán)塊狀、質(zhì)地較為堅實(shí)，隨著時間推移顯著膨脹。4 結(jié)論與分析以大豆成熟胚作為外植體，通過液體ms培養(yǎng)基劇烈振蕩培養(yǎng)得到愈傷組織的方法被證明具有一定可行性，可作為一種和固體培養(yǎng)基法、紙橋法平行存在的愈傷組織誘導(dǎo)方法，值得進(jìn)一步的研究和實(shí)驗。目前得到的比較適合的培養(yǎng)優(yōu)化條件是：培養(yǎng)溫度為25±1、光照1000-1500lx 12h·d-1、 蔗糖濃度30g·l-1、 ph 5.86.0、1mg·l-1 2，4-d和0.25 mg·l-1 6-ba、 100r·min-1振蕩培養(yǎng)。參考文獻(xiàn)1 安利國，楊桂文.細(xì)胞工程m.第3版.科學(xué)出版社，2015：155，160.2 張郁松.影響大豆愈傷組織的誘導(dǎo)因素研究j.大豆科學(xué)，2007（01）：6