一株野生多孔菌的分離鑒定及生物學(xué)特性研究

1、    一株野生多孔菌的分離鑒定及生物學(xué)特性研究    楊和川 蘇文英 譚一羅 秦裕營 馬騰 浦漢春 周振玲摘要：本研究通過對(duì)一株野生多孔菌子實(shí)體進(jìn)行分離純化，并對(duì)獲得的菌株進(jìn)行its鑒定。序列分析結(jié)果表明，該菌株與硬毛栓菌相似性為100%。進(jìn)一步研究了不同溫度、碳源、氮源以及ph對(duì)野生多孔菌菌絲生長的影響，從中選出最優(yōu)的3個(gè)水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，野生多孔菌菌絲的最適生長條件為：碳源為蔗糖、氮源為酵母浸粉、ph 7.0、培養(yǎng)溫度為35。本研究為野生多孔菌資源的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。關(guān)鍵詞：多孔菌;生物學(xué)特性;its序列分析多孔菌（polypore

2、）是高等真菌的一個(gè)類群，該類群真菌子實(shí)層體呈孔狀、質(zhì)地為革質(zhì)至木質(zhì)1。多孔菌廣泛分布于各種類型的森林中，目前在我國已知的多孔菌有704種。多孔菌除了在生態(tài)生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要的生態(tài)功能外，很多種類本身具有良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，如藥用多孔菌靈芝（ganoderma lucidum）、云芝（coriolus versicolor）、樺褐孔菌（inonotus obliquus）、茯苓（wolfiporia cocos）、桑黃（inonotus sanghuang）、豬苓（polyporus umbellatus）等，已被證實(shí)具有調(diào)節(jié)增強(qiáng)人體免疫力、抗腫瘤、降血壓及降血脂等功效2-5。有些多孔菌如灰樹花（g

3、rifola frondosa）、疊生干酪孔菌（ oligoporus obductus）等，因營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量較高，具有很好的食用價(jià)值6。 此外，有些多孔菌產(chǎn)生的木質(zhì)素分解酶，如漆酶（lacease）、錳過氧化物酶（manganese peroxidase）、木質(zhì)素過氧化物酶（lignin peroxidase），被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、生物修復(fù)、紙漿漂白和環(huán)境治理等領(lǐng)域7-9。因此，對(duì)野生多孔菌的采集分離和應(yīng)用研究，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開發(fā)前景。本研究將利用從連云港市海州區(qū)許莊村采集的野生多孔菌子實(shí)體為試材，分離獲得其菌絲體并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特性和分子鑒定研究，為保護(hù)野生多孔菌生物多樣性及

4、資源的合理開發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1材料與方法1.1供試材料1.1.1供試菌株野生多孔菌采自江蘇省連云港市海州區(qū)許莊村，供試菌株為野生分離。保藏于連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)中心，編號(hào)dk1。轉(zhuǎn)接到pda培養(yǎng)基上活化，用于后續(xù)試驗(yàn)。1.1.2供試固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨3g，瓊脂20g，水1l，ph自然。碳源實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：碳源 20g、蛋白胨3g，瓊脂20g，水1l，ph自然。氮源實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：氮源3g、葡萄糖20g，瓊脂20g，水1l，ph自然。ph 實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨3g，瓊脂20g，水1l，調(diào)節(jié)ph。溫度實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨3g，瓊脂20g，水1l，p

5、h自然。1.2方法1.2.1菌種活化在超凈工作臺(tái)上將保存的野生多孔菌菌株轉(zhuǎn)接至基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)。1.2.2its序列分析菌絲體總dna提取利用dna提取試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，北京）。以真菌通用引物its1（ 5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3'） 和its4（5'-tcctccgcttattggatatgc-3'）為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，體系采用50 l體系（10×taq buffer，3;dntp，4;its1，2;its4，2;dna taq 聚合酶，1;基因組dna，3;ddh2o，33），反應(yīng)條件為：94，2

6、min;94，30s;56，30s;72，30s; 30 次循環(huán)，72，10min。獲得的pcr產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)。引物合成與pcr產(chǎn)物測(cè)序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。測(cè)得的 its 序列通過 blast 軟件進(jìn)行同源序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。1.2.3碳源試驗(yàn)分別以等量麥芽糖、淀粉、蔗糖、乳糖替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，121滅菌20min后倒入9cm培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿裝培養(yǎng)基15ml，待培養(yǎng)基凝固后，用打孔器（ 直徑8 mm） 在菌種菌落邊緣取接種塊分別接種，每個(gè)處理5 個(gè)重復(fù)，接種后置于25恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行黑暗培養(yǎng)。自接種后48h 開始，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，觀察并記

7、錄菌絲長勢(shì)。1.2.4氮源試驗(yàn)分別以等量硫酸銨、酵母浸粉、氯化銨、尿素替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中蛋白胨，實(shí)驗(yàn)方法同1.2.2。1.2.5溫度試驗(yàn)將接種后的平板培養(yǎng)皿分別置于 15、20、25、30、35、40不同溫度條件下培養(yǎng)，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù) （培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基 ） ，實(shí)驗(yàn)方法同1.2.2。1.2.6ph試驗(yàn)用0. 5047mol /l 的鹽酸和 0. 5001 mol /l 氫氧化鈉溶液分別調(diào)各培養(yǎng)基初始ph為5.0、6. 0、7.0、8. 0、9.0，實(shí)驗(yàn)方法同1.2.2。1.2.7正交試驗(yàn)在以上單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取各單因素實(shí)驗(yàn)中中最優(yōu)良的3個(gè)條件進(jìn)行

8、l9（34）正交試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方法同1.2.2。2結(jié)果與分析2.1its序列分析經(jīng)pcr擴(kuò)增和序列測(cè)定，獲得供試菌株its序列片段，經(jīng)blast在線比對(duì)后，與相近種菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。系統(tǒng)發(fā)育樹表明，供試菌株dk1與硬毛栓菌（trametes trogii）（eu790491.1）的相似性最高，達(dá)到100%。2.2不同碳源對(duì)菌絲生長的影響實(shí)驗(yàn)菌株在不同碳源下的生長情況見表1。以葡萄糖和麥芽糖為碳源時(shí)，菌絲生長速度較快，菌落邊緣整齊，但菌絲較為稀疏，其次為蔗糖，乳糖，可溶性淀粉為碳源時(shí)菌絲生長最為緩慢。2.3不同氮源對(duì)菌絲生長的影響實(shí)驗(yàn)菌株在不同氮源下的生長情況見表2。以酵母浸粉為氮源時(shí)，菌

9、絲生長速度較快，菌落邊緣整齊，且菌絲濃密，其次為蛋白胨，氯化銨以及硫酸銨為氮源時(shí)，菌絲生長速度相差不大，但菌絲較為稀疏。在以尿素為氮源的培養(yǎng)基上，實(shí)驗(yàn)菌株菌絲未見萌發(fā)。2.4不同溫度對(duì)菌絲生長的影響野生多孔菌菌株在不同溫度下菌絲的生長情況見表3。實(shí)驗(yàn)菌株在1545溫度范圍內(nèi)均能萌發(fā)生長，但在15條件下培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)菌株菌絲生長速度明顯慢于其他溫度條件下培養(yǎng)菌絲。從菌絲長勢(shì)及生長速度來看，35更利于實(shí)驗(yàn)菌株菌絲的生長。2.5不同ph對(duì)菌絲生長的影響實(shí)驗(yàn)菌株在不同ph下的生長情況見表2。菌絲在ph 69.0的條件下均可生長，且多孔菌菌絲在不同ph下差異并不顯著。綜合比較，最適ph為7.0。2.6正交實(shí)

10、驗(yàn)對(duì)碳源、氮源、ph 和溫度4個(gè)因素進(jìn)行篩選，挑選出最優(yōu)3 組水平處理，選擇4因素3水平作l9（34）正交試驗(yàn)（表5）。結(jié)果顯示，4種因素對(duì)多孔菌菌絲生長的影響為：溫度>氮源>ph>碳源。綜合評(píng)價(jià)，野生多孔菌最佳生長條件是蔗糖、酵母浸粉、ph 7.0、35。3小結(jié)硬毛栓菌（trametes trogii）是一種廣分分布于世界各地的白腐擔(dān)子菌，目前的多項(xiàng)研究都已證實(shí)該菌可被用于工業(yè)染料的脫色11。在本研究中，通過its分子生物學(xué)鑒定，野生多孔菌菌株dk1與硬毛栓菌相似性最高，為100%。但該菌株是否為硬毛栓菌，還需進(jìn)一步的形態(tài)學(xué)鑒定。通過單因素實(shí)驗(yàn)以及正交實(shí)驗(yàn)，最終確定野生多孔

11、菌的最適生長條件為：碳源為蔗糖、氮源為酵母浸粉、ph 7.0、培養(yǎng)溫度為35。本研究為野生多孔菌菌株的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)1周麗偉， 戴玉成. 中國多孔菌多樣性初探： 物種， 區(qū)系和生態(tài)功能j. 生物多樣性， 2013， 21（4）： 499-506.2 林志彬. 靈芝抗腫瘤作用的免疫學(xué)機(jī)制及其臨床應(yīng)用j.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2015（29）： 865-882.3 wu md， cheng mj， wang wy， et al. antioxidant activities of extracts and metabolites isolated from the fun

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