外泌體,未來的醫(yī)學研究和應用新方向PPT精選文檔

1、Exosomes：Our future target！1簡介 外泌體最早發(fā)現(xiàn)于體外培養(yǎng)的綿羊紅細胞上清液中 細胞主動分泌的囊泡樣小體 大小較為均一，直徑為40100納米 密度1.101.18 g/ml2345 細胞外泌體攜帶多種蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA，參與細胞通訊、細胞遷移、血管新生和腫瘤細胞生長等過程 并有可能成為藥物的天然載體，應用于臨床治療。 Thry C是建立外泌體提取分離鑒定金標準的泰斗(Thry et al, 2006)。 在Cell發(fā)表了一篇綜述，文中著重討論了EV對癌癥轉(zhuǎn)移作用的最新發(fā)現(xiàn)，下面就是她的綜述內(nèi)容6Exosomes還是還是EV? Thry C提出應該是 exo

2、somes“而不是 ”exosome”(Thry, et al. 2014) 因為Exosome還含有另一個含義：外切酶體復合物，具有RNase活性。 分離的產(chǎn)物若沒有進一步證明它的細胞內(nèi)來源， 應定義為混合的小EVExtracellular Vesicles，即胞外囊泡。 來自多泡內(nèi)體多泡內(nèi)體或MVB的才是exosomes，可檢測囊泡是否含內(nèi)體標志蛋白證明，如CD63。 Multivesicular bodies，MVB=MVE Multivesicular endosomes 因此，這些exosomes的功能可能是廣義EV的，也可能是真正的exosomes。 下面Thry C的綜述中使用廣

3、義的EV指沒有專門鑒定過大小的囊泡，使用小EV指小于200nm的小囊泡。7VEexosomes胞外其他囊泡（來自于其他個體或生物）8EV幫助癌細胞長出幫助癌細胞長出“腿腿”？ 1. 腫瘤來源的EV對受體細胞有不同的作用。在原發(fā)性腫瘤位點，EV能穩(wěn)定細胞突起，增強癌細胞運動能力。EV通過細胞外基質(zhì) (ECM) 局部沉積，促進定向的持續(xù)遷移，例如含有纖連蛋白(Fibronectin)的小EV。 2. 包含金屬蛋白酶(Metalloproteinases)的EV也可以直接參與ECM重構(Remodeling)，使特化的細胞突起具有降解能力，也就是侵入性偽足(Invadopodia)。ECM重構幫助腫

4、瘤細胞在組織之間遷移。910 3. EV可促進腫瘤基質(zhì)細胞的分化或募集，如纖維母細胞(Fibroblasts)和骨髓來源細胞(Bonemarrow-derived cells,BMDC)。反過來，周圍纖維母細胞分泌的EV可以增強腫瘤細胞遷移能力及耐藥性。 4. 小EV還能進入循環(huán)，從原發(fā)腫瘤到達遠端位點。小EV的堆積可能增加血管通透性，EV可以進入遠端組織，誘導ECM重構、募集BMDC以及后來的腫瘤細胞，制造轉(zhuǎn)移前微環(huán)境(Pre-metastatic niche)。11體內(nèi)分析體內(nèi)分析EV轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)移的方法 將標簽添加到分泌的EV里 I. 將熒光蛋白基因融合到棕櫚?；?Palmitoylat

5、ion)序列，標記全細胞膜，通過mRNA的新熒光我們可以跟蹤結合或內(nèi)化了EV的細胞 II. 膜結合熒光素酶蛋白可以分析體內(nèi)發(fā)光細胞，這樣就能捕獲結合EV的熒光素酶蛋白或熒光素酶mRNA III.用CRE重組酶，檢測EV內(nèi)的mRNA1213EV幫助小幫助小RNA轉(zhuǎn)運？轉(zhuǎn)運？ miRNA分泌進小EV，運輸進靶細胞并發(fā)揮功能，直接調(diào)控miRNA靶標。Pegtel et al, 2010，發(fā)現(xiàn)小EV轉(zhuǎn)運EB病毒miRNA到鄰近未感染的細胞，抑制靶基因。 除了EV包裹的miRNA，miRNA起的作用也有可能是其他EV組分在靶細胞表達內(nèi)源miRNA引起的。 如何明確上述兩種情況？轉(zhuǎn)運的miRNA是外源基因

6、組編碼的，如病毒的 (Pegtel et al, 2010) 或寄生蟲的 (Buck et al, 2014)，又或者受體細胞是小鼠的，并沒有所研究的miRNA (Alexander et al, 2015)。14EV與免疫與免疫 最 近報道發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中EV的RNA有著一段特殊的序列(Boelenset al, 2014)：它帶有5-triphosphate末端，通過RIG-I感應器被受體細胞基質(zhì)識別，誘導干擾素應答，跟病毒感染類似。這種應答也參與癌癥 細胞對放療或化療的應答。 小EV與包膜病毒有相似作用？何種表面分子協(xié)助受體細胞膜融合RNA或小分子內(nèi)含物到細胞 質(zhì)呢？這個問題有待探索。1

7、5外泌體分離和檢測外泌體分離和檢測161. 分離 到目前為止，仍沒有一種提取方法能同時保證外泌體的含量、純度以及生物活性。171.1 離心法 最常用的方法。收集細胞培養(yǎng)液以后依次在300 g、2 000 g、10 000 g離心去除細胞碎片和大分子蛋白質(zhì)，最后100 000 g離心得到外泌體。 得到外泌體量多，純度不足，電鏡鑒定時發(fā)現(xiàn)外泌體聚集成塊，由于微泡和外泌體沒有非常統(tǒng)一的鑒定標準，也有一些研究認為此種方法得到的是微泡不是外泌體。181.2 過濾離心 過濾離心是利用不同截留相對分子質(zhì)量截留相對分子質(zhì)量(MWCO)的超濾膜離心分離外泌體。 截留相對分子質(zhì)量是指能自由通過某種有孔材料的分子中

8、最大分子的相對分子質(zhì)量。 外泌體是一個囊狀小體，相對分子質(zhì)量大于一般蛋白質(zhì)，因此選擇不同大小的MWCO膜可使外泌體與其他大分子物質(zhì)分離。 這種操作簡單、省時，不影響外泌體的生物活性，但同樣存在純度不足的問題。191.3 密度梯度離心法 分為連續(xù)和不連續(xù)梯度離心法。 用于密度梯度離心法的介質(zhì)要求對細胞無毒，在高濃度時粘度不高且易將pH調(diào)至中性。實驗中常用蔗糖密度梯度離心法，在離心法的基礎上，預先將兩種濃度蔗糖溶液(如2.5 M 和0.25 M)配成連續(xù)梯度體系置于超速離心管中，樣本鋪在蔗糖溶液上，100 000 g離心16 h，外泌體會沉降到等密度區(qū)(1.101.18 g/ml)。 用此種方法分

9、離到的外泌體純度高，但是前期準備工作繁雜，耗時，量少。201.4 免疫磁珠法 泌體相關抗原的抗體(如CD9、CD63、Alix)與外泌體共同孵育，蒸餾水沖洗后，重懸于PBS緩沖液中。 這種方法可以保證外泌體形態(tài)的完整，特異性高、操作簡單、不需要昂貴的儀器設備, 但是非中性pH和非生理性鹽濃度會影響外泌體生物活性，不便進行下一步的實驗。211.5 色譜法 色譜法是利用根據(jù)凝膠孔隙的孔徑大小與樣品分子尺寸的相對關系而對溶質(zhì)進行分離的分析的方法。樣品中大分子不能進入凝膠孔，只能沿多孔凝膠粒子之間的空隙通過色譜柱，首先被流動相洗脫出來；小分子可進入凝膠中絕大部分孔洞，在柱中受到更強地滯留，更慢地被洗脫

10、出。 分離到的外泌體在電鏡下大小均一，但是需要特殊的設備，應用不廣泛。222. 外泌體測量各種方法的比較232.1 電子顯微鏡掃描電子顯微鏡(SEM) 能夠直接觀察到樣品中外泌體的形態(tài)。并且SEM具有很高的分辨率，能夠鑒別不同大小的外泌體。 但SEM對樣品的預處理和制備上面要求較高，樣品的準備階段比較復雜，不適合對外泌體進行大量快速的測量。而且由于外泌體經(jīng)過了預處理和制備過程，無法準確的進行外泌體濃度的測量。242.2 動態(tài)光散射技術動態(tài)光散射是收集溶液中做布朗運動的顆粒散射光強度起伏的變化，通過相關儀器將光強的波動轉(zhuǎn)化為相關曲線，從而得到光強波動的速度，計算出粒子的擴散速度信息和粒子的粒徑。

11、小顆粒樣品的布朗運動速度快，光強波動較快，相關曲線衰減較快，大顆粒反之。在外泌體研究中，動態(tài)光散射測量敏感度較高，測量下限為10納米。相對于SEM技術來說，樣品制備簡單，只需要簡單的過濾，測量速度較快。但由于動態(tài)光散射技術是測量光強的波動數(shù)據(jù)，所以大顆粒的光強波動信號會掩蓋較小顆粒的光強波動信號，所以動態(tài)光散射不適合大小不一的復雜外泌體樣本的測量，只適合通過色譜法制備的大小均一的外泌體的尺寸測量，并且無法測量樣品中外泌體的濃度。25262.3 納米微粒追蹤分析術 納米微粒追蹤分析術(以下簡稱NTA)是一種比較新穎的研究納米顆粒的方法，可以直接和實時的觀測納米顆粒。 NTA通過光學顯微鏡收集納米

12、顆粒的散射光信號，拍攝一段納米顆粒在溶液中做布朗運動的影像，對每個顆粒的布朗運動進行追蹤和分析，從而計算出納米顆粒的流體力學半徑和濃度。NTA系統(tǒng)的工作原理是將一束能量集中的激光穿過玻璃棱鏡對樣品(懸浮顆粒的溶液)進行照射(光路圖見下圖)2728 激光光束從較小角度入射進入樣品溶液，照亮溶液中的顆粒。配備相機的光學顯微鏡，被放置在特定的位置上，收集視野中被照亮的納米顆粒發(fā)射出的光散射信號。 樣品池有大約500微米的深度，采樣點激光照亮寬度為20微米，這個數(shù)值和光學顯微鏡的聚焦的視野深度相匹配。相機會進行60秒的影像拍攝，每秒30個采樣畫面。顆粒的運動過程被NTA軟件進行分析。NTA軟件在每幅被

13、記錄的畫面中鑒別和追蹤做布朗運動的納米顆粒。29由于直接追蹤樣品中每一個納米顆粒，因此NTA技術對復雜的樣品具有極高的分辨率。為了證明NTA對于復雜樣品的分辨能力，我們將100納米和300納米兩種不同大小的聚苯乙烯顆粒按照5:1的數(shù)量混合，使用NTA進行測量(圖3A)。盡管其分布圖形有一定的重疊，但兩種不同大小的納米顆粒的峰清楚的區(qū)分開來。這種對復雜樣品的分辨能力對于外泌體這樣的研究對象來說是非常重要的。NTA也能對樣品濃度進行直接測量。對一系列濃度為1108 - 8108的100納米單分散樣品進行測量，可以看到NTA測量濃度結果和實際濃度存在著很好的線性相關(圖3B)。對于多分散體系，測量結果的準確取決于儀器參數(shù)的設定(照相機快門速度和光圈)，恰當?shù)膮?shù)設定可以保證不同大小顆粒都能被NTA軟件追蹤和計算。3031 由于外泌體表面有標志物CD9、CD63等跨膜分子的存在，在復雜的背景環(huán)境下(如血清中)，可以用熒光抗體標記外泌體，再用NTA的熒光測量功能實現(xiàn)在復雜背景下對外泌體的測量。 相比較于流式細胞儀的熒光功能，NTA分辨率較高，且測量熒光顆粒的下限可以達到30-40納米，而流式細胞儀的測量下限為400納米。即使對于最新一代的數(shù)碼流式細胞儀，其測量下限已經(jīng)達到100納米，但由于它仍然建立在監(jiān)測光信號的基礎上，所以測量和準確性和分辨率仍然不可