煙草蛋白酶體α2型亞單位的克隆和序列分析

1、    煙草蛋白酶體2型亞單位的克隆和序列分析    付強(qiáng)+鄒頡+余婧+趙杰宏+任學(xué)良摘要：為研究煙草識(shí)別病毒并將其降解為蛋白酶體基因，以擬南芥的蛋白酶體2型亞單位基因全長(zhǎng)cdna序列（genbank登錄號(hào)：af043520.1）為信息探針，用電子克隆的方法從煙草栽培品種中克隆到1個(gè)蛋白酶體基因ntpab1，并對(duì)其進(jìn)行序列分析。結(jié)果表明，ntpab1包含完整的開(kāi)放讀碼框，編碼219個(gè)氨基酸，含有1個(gè)保守域proteasome_alpha_type_2；通過(guò)同源比對(duì)和進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，ntpab1氨基酸序列與葡萄pab1的序列一致性達(dá)到98%。以上結(jié)果表明，n

2、tpab1是栽培煙草中未報(bào)道的編碼蛋白酶體基因。關(guān)鍵詞：栽培煙草；蛋白酶體2型亞單位；蛋白降解；克隆；序列分析： s188；s572.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： a：1002-1302（2016）09-0039-03馬鈴薯y病毒屬的蚜傳輔助因子（hc-pro）是釋放感染所需病毒蛋白的三大蛋白酶之一1，hc-pro抑制植物體內(nèi)起抗病毒作用的rna干涉，但其具體分子機(jī)制尚無(wú)報(bào)道2-3。近期研究發(fā)現(xiàn)，萵苣花葉病毒的hc-pro能干涉泛素/26s蛋白酶體系統(tǒng)中核心元件20s蛋白酶體的活性，而泛素/26s蛋白酶體系統(tǒng)參與抗病毒反應(yīng)4。ballut等研究發(fā)現(xiàn)，煙草花葉病毒、萵苣花葉病毒的rna能夠被蛋白酶體識(shí)別水

3、解，這暗示20s蛋白酶體的核酸內(nèi)切酶活性可能參與植物體內(nèi)的抗病毒過(guò)程5。泛素/26s蛋白酶體在植物發(fā)育的方方面面起著重要作用，影響著一系列生理過(guò)程，包括胚胎發(fā)育和衰老6。泛素/26s蛋白酶體的核心元件是受到緊密調(diào)控并高度特異的26s蛋白酶體，由二級(jí)結(jié)構(gòu)為圓柱形的20s核心蛋白酶結(jié)合1個(gè)19s調(diào)控因子構(gòu)成7。筒形的20s蛋白酶體由4個(gè)環(huán)形結(jié)構(gòu)構(gòu)成，包括在2個(gè)外側(cè)的環(huán)形結(jié)構(gòu)中的7個(gè)亞基，而內(nèi)側(cè)的2個(gè)環(huán)形結(jié)構(gòu)上具有7個(gè)亞基，其大體的構(gòu)型為1-7/1-7/1-7/1-7/1-77。盡管已經(jīng)從煙草、土豆、綠豆、豌豆等植物中純化得到20s蛋白酶體8-10，但是目前尚無(wú)關(guān)于栽培煙草中蛋白酶體2型亞單位基因序

4、列的報(bào)道。隨著近年來(lái)多個(gè)物種全基因組測(cè)序的完成和表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tags，ests）計(jì)劃的發(fā)展，電子克隆技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，其技術(shù)核心是利用生物信息學(xué)技術(shù)組裝延伸ests序列，獲得基因的部分乃至全長(zhǎng)cdna序列。本研究采用電子克隆的方法獲得1個(gè)蛋白酶體2型亞單位基因ntpab1，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究煙草中外源蛋白、異常蛋白的降解奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 煙草pab1基因的電子克隆以擬南芥的蛋白酶體2型亞單位基因全長(zhǎng)cdna序列（genbank登錄號(hào)：af043520.1）為信息探針11，對(duì)genbank中est_others數(shù)據(jù)庫(kù)指定物種煙

5、草（nicotiana tabacum）進(jìn)行blast比對(duì)，并利用菲莫公司林煙草和絨毛狀煙草的全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)12，將比對(duì)到的煙草栽培品種美國(guó)普通煙草的全部est序列使用codon code aligner軟件進(jìn)行拼接，形成重疊群（contig）。利用拼接獲得的重疊群作為探針，再次進(jìn)行同源檢索、拼接，重復(fù)以上過(guò)程直至沒(méi)有更多est被檢出，獲得普通煙草的pab1 cdna序列。最后，再以此片段在ncbi數(shù)據(jù)中進(jìn)行blast比對(duì)，對(duì)比其他物種同源基因的相似性和一致性，判斷拼接所得cdna片段的正確性以及讀碼框（open reading frame，orf）序列的完整性。1.2 煙草pab1基因的生

6、物信息學(xué)分析序列比對(duì)、orf查找和翻譯在“http：/www.ebi.ac.uk/”提供的相應(yīng)模塊上完成。采用expasy網(wǎng)站上prot-param、pi/mw對(duì)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行基本分析；利用在線資源的signalp 4.1、targetp1.1、netphos、sopma軟件進(jìn)行信號(hào)肽、磷酸化位點(diǎn)、蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析；利用clustalx2.0、mega4.0軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析。2 結(jié)果與分析2.1 煙草栽培品種pab1基因的電子克隆以擬南芥的蛋白酶體2型亞單位基因全長(zhǎng)cdna序列為檢索探針，對(duì)genbank中煙草est數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blast檢索分析，同時(shí)比對(duì)菲莫公司201

7、3年發(fā)布的煙草基因組測(cè)序數(shù)據(jù)12，發(fā)現(xiàn)10條一致性（identity）、相似性（similarity）較高的est序列。按照“1.1”節(jié)所述方法進(jìn)行重疊群分析，結(jié)果顯示，10條est可拼接成1條獨(dú)立的cdna序列，長(zhǎng)度為660 bp，暫命名ntpab1（nicotiana tabacum pab1）（圖1）。2.2 ntpab1蛋白基本參數(shù)和可能的翻譯后修飾ntpab1蛋白含有219個(gè)氨基酸，分子量為23.71 ku，等電點(diǎn)（pi值）為7.8。ncbi保守域檢測(cè)表明，ntpab1蛋白含有1個(gè)保守域proteasome_alpha_1，說(shuō)明所克隆的ntpab1基因是植物蛋白酶體基因家族成員（圖2

8、）。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為34.31，屬于不穩(wěn)定蛋白；脂溶指數(shù)為88.08，總平均親水性為-0.193，具有輕度疏水性。采用signalp 4.113預(yù)測(cè)ntpab1蛋白無(wú)信號(hào)肽。利用targetp1.114在線軟件（http：/www.cbs.dtu.dk/services/targetp/）對(duì)推導(dǎo)蛋白的定位特性分析顯示，ntpab1沒(méi)有特殊定位偏好性。用netphos2.0（http：/www.cbs.dtu.dk/services/netphos/）預(yù)測(cè)表明，ntpab1蛋白存在20個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其潛在絲氨酸（ser）、蘇氨酸（thr）、纈氨酸（tyr）活性位點(diǎn)數(shù)分別為5、3、1個(gè)，ntpa

9、b1蛋白存在較多的磷酸化位點(diǎn)，說(shuō)明磷酸化位點(diǎn)修飾對(duì)pab家族蛋白的活化起著重要作用。 2.3 ntpab1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析通過(guò)sopma方法分析ntpab1蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖3所示，可見(jiàn)參與-螺旋的氨基酸含量達(dá)到37.90% （83個(gè)）；63個(gè)氨基酸可能參與形成無(wú)規(guī)則卷曲，占28.77%；另外有49個(gè)氨基酸可能參與延伸鏈，占22.37%；24個(gè)氨基酸可能參與-轉(zhuǎn)角，占10.96%。說(shuō)明-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲是ntpab1蛋白質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)。2.4 ntpab1基因同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析為分析ntpab1與其他植物的蛋白酶體基因的同源性，在ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blastp。結(jié)果表明，ntpab

10、1所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列與葡萄同源基因氨基酸相似性最高，達(dá)到98%，而在林煙草和本式煙草中未能找到該基因的同源基因。另外ntpab1與楊樹(shù)、百脈根、可可的相關(guān)基因的相似性達(dá)到85%以上。從genbank上獲得的多個(gè)植物pab同源基因編碼蛋白的氨基酸序列，經(jīng)過(guò)clustalx 2.0比對(duì)后生成aln比對(duì)文件，然后利用進(jìn)化分析軟件mega4.0打開(kāi)比對(duì)文件，采用鄰接（neighbor-joint，n-j）算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)15- 16。分析結(jié)果表明，ntpab1與葡萄pab基因編碼蛋白進(jìn)化關(guān)系更近（圖4）。3 結(jié)論與討論馬鈴薯y病毒屬（potato virus y，pvy）是包含范圍廣、增殖過(guò)

11、程復(fù)雜但基因組簡(jiǎn)單的一類重要病毒，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失17。特別是在煙草行業(yè)，煙草馬鈴薯y病毒分布于世界各煙區(qū)。在中國(guó)，近年來(lái)馬鈴薯y病毒也有逐年加重的趨勢(shì)，在馬鈴薯、煙草及蔬菜混種或間種的地區(qū)發(fā)病尤為嚴(yán)重，已經(jīng)成為導(dǎo)致煙草減產(chǎn)和品質(zhì)下降的主要病毒之一。國(guó)外研究調(diào)查顯示，煙草感染pvy后，其單位面積產(chǎn)值減少11%18%，煙葉等級(jí)指數(shù)也降低36%62%。近年來(lái)，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了許多pvy侵染循環(huán)中的作用因子，加深了對(duì)pvy侵染過(guò)程中各項(xiàng)機(jī)制的研究。hc-pro對(duì)于pvy的傳播至關(guān)重要，但是其具體分子機(jī)制尚未研究清楚。ballut等研究表明，萵苣花葉病毒的hc-pro能夠結(jié)合20

12、s蛋白酶體4。因此可知，20s蛋白酶體對(duì)于植物抵御病毒的危害具有重要作用。本研究通過(guò)電子克隆方法從煙草栽培品種中克隆到1個(gè)20s蛋白酶體基因ntpab1，為利用該基因培育抗pvy病毒栽培煙草品系奠定了理論基礎(chǔ)。下一步工作是通過(guò)改變煙草20s蛋白酶體的序列，使得pvy病毒的hc-pro無(wú)法識(shí)別靶標(biāo)序列，從而達(dá)到抗pvy的目的。參考文獻(xiàn)：1plisson c，drucker m，blanc s，et al. structural characterization ofhc-pro，a plant virus multifunctional proteinj. the journal ofbiolo

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