腺病毒LMP-3表達(dá)載體轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞后BMP-2、OSX表達(dá)研究

1、    腺病毒lmp3表達(dá)載體轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞后bmp2、osx表達(dá)研究    安貴峰王明月【摘要】 目的 探討骨礦化蛋白lmp-3促進(jìn)骨形成及骨修復(fù)重建的分子機(jī)制。方法 通過(guò)腺病毒lmp-3表達(dá)載體轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞， rt-pcr法檢測(cè)lmp-3、bmp-2、osx表達(dá)變化， 檢測(cè)相關(guān)因子表達(dá)情況。結(jié)果 腺病毒lmp-3表達(dá)載體轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞， 發(fā)現(xiàn)bmp-2 mrna、osx mrna的表達(dá)增高， 促進(jìn)骨形成。結(jié)論 lmp-3作用機(jī)制是通過(guò)上調(diào)bmp、osx等骨誘導(dǎo)因子的基因表達(dá)， 促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟， 從而促進(jìn)骨形成， lmp在骨形成研

2、究方面具有一定潛力?！娟P(guān)鍵詞】 lmp-3， 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；表達(dá)情況doi：10.14163/ki.11-5547/r.2016.22.207lmp作為一種新發(fā)現(xiàn)的骨礦化蛋白， 為骨組織工程及骨科重建提供新的途徑。研究者應(yīng)用腺病毒lmp-3表達(dá)載體轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞， 檢測(cè)bmp-2 mrna、osx mrna的表達(dá)情況， 探討骨礦化蛋白lmp-3促進(jìn)骨形成的可能機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。1 材料與方法1. 1 材料 主要試劑：pcr引物（上海生物）；兔抗大鼠lmp-3抗體（santa cruz） ；二抗羊抗鼠fitc標(biāo)記igg（中杉金橋）；胰酶（gibco）；rt-pcr試劑盒（takara）；胎

3、牛血清（hyclone）；dmem（hyclone）；引物（上海生工）；質(zhì)粒抽提試劑；msc 誘導(dǎo)藥物（sigma）；腺病毒lmp-3表達(dá)載體前期自行構(gòu)建。主要儀器：超凈工作臺(tái)（蘇凈）；恒溫co2孵箱（hera cell ）；倒置顯微鏡（日本 olympus）；熒光顯微鏡（olympus）；pcr儀（bio-rad）；垂直電泳儀（bio-rad）；轉(zhuǎn)印電泳儀（amersham）；可調(diào)溫?fù)u床（哈爾濱東聯(lián)）；臺(tái)式低溫離心機(jī)（eppendorf公司）；酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃）。1. 2 實(shí)驗(yàn)方法1. 2. 1 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng) 取3周齡sd大鼠， 處死， 取股骨和脛骨， 注入pbs， 離心管收集， 25

4、0×g， 離心10 min， 加入100 g/l 高糖dmem 10 ml。接種于2 個(gè)25 cm2 培養(yǎng)瓶中， 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；48 h換液， 10 d 后細(xì)胞80%匯合， 胰蛋白酶消化傳代， 繼續(xù)培養(yǎng)， 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1. 2. 2 實(shí)驗(yàn)組感染復(fù)數(shù)（moi=100）；對(duì)照組：未加病毒轉(zhuǎn)染作為陰性對(duì)照組， lacz 轉(zhuǎn)染組作為陽(yáng)性對(duì)照。1. 2. 3 轉(zhuǎn)染過(guò)程 將第3 代msc 傳代與12 個(gè)6 孔板中（5×104 cells /孔）， 加入病毒液， 輕搖1 min， 繼續(xù)培養(yǎng)， 12 h 后換液， 2 d后更換新鮮培養(yǎng)基， 5 d后更換新鮮培養(yǎng)基， 換液并留取檢測(cè)。8 d

5、后更換培養(yǎng)液， 12 d后再次換液并留取檢測(cè)。1. 2. 4 rt-pcr檢測(cè)lmp-3、bmp-2、osx在msc 中的表達(dá)情況 總rna的提取， 實(shí)驗(yàn)分組a ad-lmp-3組b ad-lacz組c陰性對(duì)照組。細(xì)胞裂解， 離心并棄上清液， 溶解rna后進(jìn)行rna的定量及保存， 測(cè)量光密度值并計(jì)算濃度。首先合成第一鏈cdna， 并以第一鏈cdna為模版繼續(xù)pcr擴(kuò)增， 反轉(zhuǎn)錄操作按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作， 30個(gè)循環(huán)；以-actin為內(nèi)參照；lmp-3引物序列如下：forward： 5-gcctcgaggaagatg cac ccatgt cctc-3；reverse： 5-gcgaatt

6、cctacatc ctgtagttcttgtttc -3。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)， 取實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組pcr產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)， 電泳結(jié)束后取反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行染色并進(jìn)行灰度掃描， 檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度依據(jù)電泳條帶面積及灰度強(qiáng)度進(jìn)行比較， 檢測(cè)lmp-3、bmp-2、osx和-actin灰度比值表示lmp-3、bmp-2 mrna、osx mrna表達(dá)水平。2 結(jié)果腺病毒lmp-3載體轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞后， 可見(jiàn)長(zhǎng)多角形細(xì)胞生長(zhǎng)， 增殖旺盛。進(jìn)一步應(yīng)用rt-pcr法檢測(cè)lmp-3 mrna、bmp-2 mrna、osx mrna的表達(dá)rt-pcr結(jié)果顯示， 序貫轉(zhuǎn)染ad-lmp-3組存在特異性條帶， 大小1200

7、bp， 表達(dá)的濃度顯著高于對(duì)照組。序貫轉(zhuǎn)染ad-lmp-3組在456 bp的位置存在特異性條帶， 表明bmp-2 mrna表達(dá)增高， 表達(dá)的濃度高于對(duì)照組。ad-lmp-3組特異性條帶， 大小488 bp， 顯示 osx mrna表達(dá)較高， 對(duì)照組未見(jiàn)特異性條帶， 表明無(wú)osx mrna表達(dá)。研究結(jié)果表明腺病毒lmp-3載體轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞， lmp-3表達(dá)增高， 表明轉(zhuǎn)染成功， 轉(zhuǎn)染組bmp-2 mrna、osx mrna的表達(dá)增高表明lmp-3促進(jìn)了骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中bmp-2、osx表達(dá)， 從而促進(jìn)了骨形成。3 討論lim礦化蛋白是新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞內(nèi)非分泌蛋白， 具有骨生成誘導(dǎo)的作用，

8、能夠正性調(diào)節(jié)骨形成誘導(dǎo)， 在骨礦化過(guò)程中促進(jìn)骨結(jié)節(jié)的形成。lim礦化蛋白lim礦化蛋白已經(jīng)發(fā)現(xiàn)3種亞型， 具有成骨作用包括lim礦化蛋白-1和lim礦化蛋白-3 1。lim礦化蛋白能夠促進(jìn)骨形成的作用， 可能是再骨形成細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的， 并通過(guò)下游細(xì)胞調(diào)節(jié)因子發(fā)揮骨形成作用， 但其確切促進(jìn)骨形成分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究證明 2。研究者成功應(yīng)用腺病毒lmp-3表達(dá)載體轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞， 并檢測(cè)lmp-3轉(zhuǎn)染后各組骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中相關(guān)目的基因mrna表達(dá)情況， 研究發(fā)現(xiàn)bmp-2 mrna、osx mrna的表達(dá)增高。骨礦化蛋白lmp-3是通過(guò)上調(diào)bmp、osx骨誘導(dǎo)因子的基因表達(dá)而實(shí)現(xiàn)lm

9、p-3的促進(jìn)骨形成作用， 促進(jìn)骨鈣化結(jié)節(jié)形成， 在骨形成及骨礦化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究結(jié)果表明 lmp-3是osx的上游調(diào)節(jié)因子， 通過(guò)上調(diào)bmp-2、osx表達(dá)， 通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟， 促進(jìn)骨鈣化結(jié)節(jié)形成。lmp-3通過(guò)細(xì)胞內(nèi)調(diào)控及信號(hào)傳導(dǎo)， 不受成骨前體細(xì)胞表面受體數(shù)量和活性的限制， 不受細(xì)胞外因子作用濃度及數(shù)量限制， 在促進(jìn)骨形成作用更強(qiáng)， 可能同時(shí)促進(jìn)bmp-4， bmp-6等其他細(xì)胞因子分泌， 激聯(lián)促進(jìn)骨形成， 作用時(shí)間更加持久， 作用強(qiáng)度更強(qiáng)， 受細(xì)胞外因子影響更小。通過(guò)對(duì)lim礦化蛋白的促進(jìn)骨形成進(jìn)一步分子機(jī)制研究， 以及進(jìn)一步進(jìn)行基因敲除及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體內(nèi)成

10、骨研究， 對(duì)進(jìn)一步探索其在骨形成、骨缺損及脊柱融合等方面的作用奠定基礎(chǔ)， 對(duì)骨礦化蛋白lmp-3促進(jìn)骨形成的作用研究及進(jìn)一步臨床應(yīng)用具有重要意義。本研究表明， lmp通過(guò)作用骨誘導(dǎo)因子bmp-2、osx共同通過(guò)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路促進(jìn)成骨， 促進(jìn)骨鈣化結(jié)節(jié)形成， 在骨形成過(guò)程中具有重要作用， 其促進(jìn)骨形成的作用更強(qiáng)， 但仍需要進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究來(lái)闡明確切生物學(xué)機(jī)制。參考文獻(xiàn)1 minamide a， boden sd， viggeswarapu m， et al. mechanism of bone formation with gene transfer of the cdna encoding for the intracellular protein lmp-1. j bone joint surg am， 2003， 85-a（6）：10