PCR產物電泳結果異常分析

1、PCR產物的電泳檢測時間一般為 48h 以內，有些最好于當日電泳檢測，大于 48h 后帶型不規(guī)則甚致消失。假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶PCR反應的關鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質量與特異性，酶的質量及，PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。模板：模板中含有雜蛋白質，模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白， 在提取制備模板時丟失過多， 或吸入酚。 模板核酸變性不徹底。 在酶和引物質量好時， 不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化 處理液，其程序亦應 固定不宜隨意更改。酶失活：需更換新酶，或新舊兩

2、種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。 有些批號的引物合成質量有問題， 兩條引物一條濃度高， 一條濃度低， 造成低效率的不對稱擴增， 對策為：選定一個好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看0D值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶， 此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要 平衡其濃度。引物應高濃度小量分

3、裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失 效。引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低 PCR擴增的特 異性，濃度過低則影 響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。反應體積的改變：通常進行 PCR擴增采用的體積為 20ul、30ul、50ul?；?00ul，應用多 大體積進行PCR 擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因：變性對 PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性退

4、火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。靶序列變異： 如靶序列發(fā)生突變或缺失， 影響引物與模板特異性結合， 或因靶序列某 段缺失使引物與模板 失去互補序列，其 PCR擴增是不會成功的。假陽性出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增 時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設計引物。靶

5、序列或擴增產物的交叉污染： 這種污染有兩種原因： 一是整個基因組或大片段的交叉污染， 導致假陽性。 這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除 酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。 必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染， 這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式 PCR方法來減輕或消除。出現(xiàn)非特異性擴增帶PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特

6、異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及 PCR循環(huán)次數(shù)過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異 條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)， 酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。 其對策有： 必要時重新設計引物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當提高退火溫度 或采用二溫度點法（93C變性，65 'C左右退火與延伸）。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+

7、濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少酶量，或調換另一來源的酶。減 少dNTP的濃度。適當降低 Mg2+濃度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。克隆PCR產物的最優(yōu)條件是什么？最佳插入片段：載體比需實驗確定。1： 1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數(shù)比 1： 8 或 8： 1 也行。應測定比值范圍。連接用 5ul 2X連接液，50ng質粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫 保溫1小時，或4oC過夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會自連，產生藍斑。室溫保溫 1小時能滿 足大多數(shù)克隆要求，為提高連接效率，需 4oC 過夜。PCR產物是否需要用凝膠純化？如

8、凝膠分析擴增產物只有一條帶， 不需要用凝膠純化。 如可見其他雜帶， 可能是積累了大量引物的二聚體。 少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高，這會產生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此 需在克隆前做凝膠純化。如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對照實驗？A）涂布未轉化的感受態(tài)細胞。如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質粒，或產生氨芐抗型 的菌落。B） 轉化完整質粒，計算菌落生長數(shù)，測定轉化效率。例如，將1ug/ul質粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受 態(tài)細胞轉化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養(yǎng)過夜，產生 1000個菌落。轉化率為：產生菌落的總數(shù)/

9、鋪板DNA的總量。鋪板DNA的總量是轉化反應所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉化率為：1000克隆X10（3次方）ng /鋪板1 ng DNA ug=10 （6次方）cfu/ ug轉化pGEM-T應用10 （ 8次方）cfu/ ug感受態(tài)細胞如沒有菌落或少 有菌落，感受態(tài)細胞的轉化率太低。C） 如用pGEM-T正對照，或PCR產物，產生>20-40藍斑（用指定步驟 10 （8次方）cfu/ ug感受態(tài)細胞）， 表明載體失去T?？赡苁沁B接酶污染了核酸酶。 T4 DNA連接酶（M180

10、1，M1804，M1794）質量標準好無 核酸酶污染，不應用其它來源的 T4 DNA連接酶替換。D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對照，轉化高頻率感受態(tài)細胞（10 （ 8次方）cfu/ug ）, 按照指定的實驗步驟，可得 100個菌落，其中 60%應為白斑，如產生 >20-40藍斑, 沒有菌落或少有菌落， 連接有問題。對照實驗結果好，卻沒有回收到目的片段，實驗出了什么問題？A） 連接用室溫保溫1小時，能滿足大多數(shù)克隆，為提高效率，需4oC過夜。B） 插入片段帶有污染，使 3'-T缺失，或抑制連接，抑制轉化。為此，將插入片段和pGEM-T正對照混合， 再連接。如降低了對照的菌落數(shù)，插入片段需純化，或重新制備。如產生大量的藍斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3'-T缺失。C） 插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時有發(fā)生。UV過度照射會產生嘧 啶二聚體，不利于連接， DNA 必需重新純化。D）帶有修復功能的耐熱 DNA聚合酶