淫羊藿苷元磷脂復(fù)合物防治去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨丟失與提高骨質(zhì)量實(shí)驗(yàn)探究

1、淫羊矍昔元磷脂復(fù)合物防治去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨丟失與提高骨質(zhì)量實(shí)驗(yàn)探究摘要目的：探討淫羊翟昔元磷脂復(fù)合物防治 去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨丟失和提高骨質(zhì)量的作用。方法：72 只雌性大鼠，隨機(jī)分為6組：假手術(shù)組、模型組、雌二醇組 和淫羊養(yǎng)昔元磷脂復(fù)合物低、中、高劑量組。假手術(shù)組僅行 假手術(shù)，其余5組行卵巢切除術(shù)。術(shù)后1周分別灌胃給予 173-雌二醇(2 mg - kg-1)和淫羊翟昔元磷脂復(fù)合物低、 中、高劑量(15, 30, 60 mg - kg-1),連續(xù)給藥3個(gè)月。測(cè) 定血鈣、血磷和堿性磷酸酶(alp),尿鈣(u-ca)、尿磷(u-p)、 尿脫氧毗噪酚(d-pyr)和肌肝(cr)o之后處死動(dòng)物，取出

2、 股骨、腰椎和脛骨，分別測(cè)定股骨密度，骨鈣、骨磷，腰椎 生物力學(xué)性能，脛骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)。結(jié)果：與假手 術(shù)組相比，模型組血清alp, u-ca, d-pyr/cr顯著增加，子 宮萎縮，股骨密度、骨鈣、骨磷、腰椎生物力學(xué)參數(shù)(彈性 載荷、最大載荷、斷裂載荷、剛度)、脛骨上段靜態(tài)參數(shù)(骨 組織總面積、骨小梁面積、骨小梁周長(zhǎng))、動(dòng)態(tài)參數(shù)(標(biāo)記 周長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)、骨形成率)均降低。與模型組比較，淫羊矍昔 元磷脂復(fù)合物中、高劑量和雌二醇組可使血清alp, u-ca, d-pyr/cr排出量降低，股骨密度、骨鈣、骨磷、腰椎生物力 學(xué)參數(shù)(彈性載荷、最大載荷、斷裂載荷、剛度)、脛骨上 段靜態(tài)參數(shù)(骨組織總面積

3、、骨小梁面積、骨小梁周長(zhǎng))、 動(dòng)態(tài)參數(shù)(標(biāo)記周長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)、骨形成率)均增加。雌二醇組 大鼠子宮增生，淫羊翟昔元磷脂復(fù)合物組大鼠子宮沒(méi)有增生 性變化。結(jié)論：淫羊霆昔元磷脂復(fù)合物能抑制由于去卵巢 雌激素缺乏引發(fā)的骨轉(zhuǎn)換增強(qiáng)，提高骨密度，增強(qiáng)腰椎抗壓 生物力學(xué)性能，且長(zhǎng)期服用對(duì)子宮沒(méi)有刺激作用。關(guān)鍵詞淫羊翟昔元；磷脂復(fù)合物；骨質(zhì)疏松；骨密 度；骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)；生物力學(xué)淫羊翟為小樂(lè)科植物淫羊翟epimedium brevicornu maxim.的干燥葉，具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)，祛風(fēng)除濕的功效。研究提 示，由淫羊翟組成的補(bǔ)腎復(fù)方在抑制骨量丟失，改善骨密度, 增強(qiáng)生物力學(xué)抗壓性能方面有明顯療效1。淫羊麓的主要 成

4、分淫羊翟昔(icariin)等黃酮類(lèi)能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分 化2,促進(jìn)去卵巢大鼠骨和下丘腦不同核團(tuán)erb mrna表 達(dá)3。淫羊翟昔元(anhydroicaritin)為淫羊蕾的一種多 務(wù)基黃酮類(lèi)單體成分，抗骨質(zhì)疏松作用較淫羊蕾中其他黃酮 類(lèi)化合物強(qiáng)4,但其水溶性差，生物利用度低，制約了其 藥效的發(fā)揮。bombardelli等5發(fā)現(xiàn)，天然黃酮類(lèi)化合物對(duì) 磷脂有特殊的親和力，二者結(jié)合形成磷脂復(fù)合物 (phytosomes 或 phospholipid complex),其理化性質(zhì)較原 母體化合物有不同程度的改變，通過(guò)與磷脂復(fù)合而形成載體 系統(tǒng)或前體藥物，可改善藥物經(jīng)胃腸道吸收，獲得較高的 血藥濃度

5、，且藥物在體內(nèi)消除變慢，生物利用度顯著提高。 為驗(yàn)證工藝的可行性，本研究運(yùn)用去卵巢大鼠造成骨質(zhì)疏松 模型，比較不同劑量的淫羊翟昔元磷脂復(fù)合物 （anhydroicaritin phytosomes, aip）和雌二醇防治去卵 巢骨質(zhì)疏松大鼠骨丟失和骨質(zhì)量下降的作用機(jī)制。1材料1.1動(dòng)物3月齡spf級(jí)雌性sd大鼠共72只，體重 （267±16） g,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許 可證號(hào) scxk （冀）2003-l-003o1.2儀器與試劑 慢速鋸（美國(guó)buehler公司），硬組 織切片機(jī)及鴿鋼刀（德國(guó)leica公司），ngs-10kng電子萬(wàn) 能精密材料試驗(yàn)機(jī)（日本島津公司）

6、，自動(dòng)化圖像數(shù)字化分 析儀包括光鏡和熒光顯微鏡（日本nikon公司）,ae100電子 天平（中國(guó)伯樂(lè)公司），火焰原子吸收分光光度計(jì)（日本島 津公司），lunar-xr型雙能x線骨密度測(cè)定儀（美國(guó)lunar 公司），alcyon 300i型全自動(dòng)生化儀（美國(guó)abbott laboratories公司），d-800 ls智能藥物溶出儀（天津大學(xué) 無(wú)線電公司），大鼠代謝籠（意大利tecn iplast公司）。 鹽酸四環(huán)素及鈣黃綠素（美國(guó)sigma公司），17 3 -雌二醇 （17b-e2, sigma公司），鈣、磷試劑盒、肌酉干試劑盒、堿 性磷酸酶（alkaline phosphatase, alp

7、）檢測(cè)試劑盒（中 生北控生物科技股份有限公司產(chǎn)品），脫氧毗噪酚elisa試 劑盒（美國(guó)quidel corporation公司）。淫羊翟昔元（自制， 質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）,大豆磷脂（江蘇曼氏生物科技有限公司）。1.3淫羊翟昔元磷脂復(fù)合物（aip）的制備工藝6稱(chēng) 取淫羊蒼昔元（anhydroicaritin, c21h2006） 500 mg 及一 定量的大豆磷脂，加適量的無(wú)水乙醇溶解，于一定的溫度 下攪拌回流一定時(shí)間，減壓回收乙醇，所得產(chǎn)物減壓干燥即 得淫羊矍昔元磷脂復(fù)合物。用時(shí)以pbs溶液溶解后，調(diào)ph 至7.27.4,分高、中、低3個(gè)劑量組，濾膜過(guò)濾除菌，-4 °c 密封保存?zhèn)溆谩?

8、方法2. 1造模與分組健康3月齡sd雌性大鼠72只，隨機(jī) 分為6組：假手術(shù)組、模型組、雌二醇組、淫羊霆昔元磷脂 復(fù)合物低、中、高劑量組，每組12只。將動(dòng)物乙瞇麻醉， 腰背部?jī)蓚?cè)剪毛，75%乙醇消毒，假手術(shù)組大鼠背部切口， 找到卵巢后，只切除少量脂肪組織后縫合；其他各組均參照 本實(shí)驗(yàn)室的背馱式方法3從背側(cè)切口摘除雙側(cè)卵巢，縫合 傷口，然后涂以紅霉素軟膏抗感染，于卵巢切除1周后，給 大鼠灌胃給藥：淫羊麓昔元磷脂復(fù)合物低、中、高劑量組大 鼠灌胃給予15, 30, 60 mgkg-laip混懸液，雌二醇組灌 胃給予2 mgkg-l雌二醇混懸液，假手術(shù)組和模型組灌胃 給予等體積蒸館水，每周記錄體重變化，

9、連續(xù)給藥3個(gè)月。 所有大鼠在處死前第4, 3天和第14, 13天分別皮下注射鹽酸四環(huán)素30 mg kg-1和鈣黃綠素5 mg kg-1進(jìn)行熒光標(biāo) 記，實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 d,收集大鼠24 h尿液，腹主動(dòng)脈取血， 然后處死動(dòng)物，取出大鼠的第2, 4腰椎、脛骨和股骨，剔 凈附著的軟組織和軟骨。2.2骨密度(bmd)測(cè)定取右側(cè)股骨，用美國(guó)lunar公司的dpx-l雙能x線骨密度儀及 其所附的“the small subject scan"小動(dòng)物軟件按文獻(xiàn) 分別測(cè)出股骨整體、股骨近端(為股骨近側(cè)干肪端1/3),股 骨遠(yuǎn)端(為股骨遠(yuǎn)側(cè)干肪端1/4)骨密度1,最終以平均 值計(jì)。2. 3骨鈣(b-ca)

10、、骨磷(b-p)含量測(cè)定取第2腰椎 用10%三氯醋酸3 ml脫鈣3次，每次24 h,合并脫鈣液， 取適量，用edta法測(cè)鈣，計(jì)算單位骨體積的含鈣量；用硫 酸亞鐵法測(cè)磷，計(jì)算單位骨體積的含磷量。2. 4尿鈣(u-ca)尿磷(u-p)、尿脫氧毗唳酚(d-pyr) 和肌肝(cr)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束前id,用大鼠代謝籠收集大鼠 24 h尿液，記錄尿量。用elisa法測(cè)定尿中脫氧毗唳酚的量, 用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定尿中鈣、磷和肌肝的量。2. 5血清鈣(s-ca)、血清磷(s-p)和堿性磷酸酶(alp) 分析大鼠用乙瞇麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，離心，分離血清, 用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清鈣、血清磷和堿性磷酸酶的活

11、性。2.6子宮取出大鼠的子宮，迅速稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算子宮臟器系數(shù)。2.7骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)靜態(tài)參數(shù)和動(dòng)態(tài)參數(shù)的測(cè)定大鼠處死后取左側(cè)脛骨，用慢速鋸沿額狀面鋸開(kāi)脛骨粗隆, 露骨髓腔，于脛骨近心端1/3處橫行鋸斷脛骨（即脛骨上段）。取脛骨上段按文獻(xiàn)方法7進(jìn)行固定、脫水、包埋、切 片，然后測(cè)量靜態(tài)參數(shù)即骨組織總面積、骨小梁面積、骨小 梁周長(zhǎng)和動(dòng)態(tài)參數(shù)即單標(biāo)記周長(zhǎng)、雙標(biāo)記周長(zhǎng)、雙標(biāo)記間距, 最后按公式8計(jì)算出相應(yīng)的靜態(tài)參數(shù)的骨小梁厚度和動(dòng)態(tài) 參數(shù)的標(biāo)記周長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)、骨形成率（bfr/bv：每年新形成 的骨小梁面積占骨小梁總面積的百分比，代表骨形成和骨轉(zhuǎn) 換的活躍程度，此參數(shù)越高，表示骨轉(zhuǎn)換越亢進(jìn)；bfr/tv：

12、每年新形成的骨小梁面積占骨組織面積的百分比，代表每年 骨小梁表面新形成骨的總量）。2. 8腰椎生物力學(xué)參數(shù)的測(cè)定取第4腰椎，去除棘突 和關(guān)節(jié)突，把兩端面磨平且與軸線垂直，根據(jù)浮力原理，測(cè) 定腰椎體積，其體積和椎體高的比值作為椎體平均橫截面 積，按文獻(xiàn)進(jìn)行椎體壓縮試驗(yàn)7,然后計(jì)算出生物力學(xué)參 數(shù)即彈性載荷（n）、最大載荷（n）、斷裂載荷（n）、剛度（n mm-1）2. 9統(tǒng)計(jì)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，應(yīng)用spss 11. 0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用單因素方差分析(one-way anova)o3結(jié)果3. 1對(duì)骨密度(bmd),骨鈣(b-ca)、骨磷(b-p)含量 的影響與假

13、手術(shù)組比較，模型組bmd, b-ca, b-p含量明 顯降低(p骨骼在一生中不斷地進(jìn)行更新和轉(zhuǎn)換，破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞在骨表面同一部位相繼進(jìn)行著骨的重建 活動(dòng)，每年約有數(shù)百萬(wàn)重建單位(bone remodeling unit, bmu)在骨表面上發(fā)生，如果骨形成的骨量少于被吸收骨量 時(shí)即發(fā)生負(fù)平衡。在bmu負(fù)平衡的狀態(tài)下，骨轉(zhuǎn)換越高，骨 丟失也越嚴(yán)重，骨質(zhì)疏松的發(fā)病部位主要在骨小梁15。目 前多用骨密度作為指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)骨質(zhì)疏松藥效，但單純追求骨 密度提高，會(huì)引起骨硬化，導(dǎo)致骨生物力學(xué)性能惡化，骨礦 含量提高和骨生物力學(xué)性能改善之間不能劃等號(hào)1,骨密 度、鈣、磷含量?jī)H反應(yīng)骨礦的"量”，而骨

14、的生物力學(xué)參數(shù) 則反應(yīng)骨的“質(zhì)”，綜合考察反映骨“質(zhì)”和“量”的雙重 指標(biāo)，才能更客觀地評(píng)判抗骨質(zhì)疏松藥效的優(yōu)劣。彈性載荷 (elasticity load)、最大載荷(maximum load)、斷裂載 荷(broken load)等指標(biāo)反映骨結(jié)構(gòu)力學(xué)性能，而剛度 (stiffness)用來(lái)衡量材料在載荷作用下，抵抗變形的能 力。結(jié)果表明，模型組大鼠股骨骨密度、骨鈣、骨磷、第4腰 椎生物力學(xué)參數(shù)的彈性載荷、最大載荷、斷裂載荷、剛度均 降低，脛骨上段骨組織計(jì)量學(xué)靜態(tài)參數(shù)的骨組織總面積、骨 小梁面積、骨小梁周長(zhǎng)和動(dòng)態(tài)參數(shù)的標(biāo)記周長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)、骨形 成率(bfr/bv, bfr/tv)均降低，提示去卵

15、巢誘發(fā)的大鼠骨 質(zhì)疏松模型是成功的。aip治療后，股骨骨密度、骨鈣、骨 磷、大鼠腰椎生物力學(xué)參數(shù)的彈性載荷、最大載荷、斷裂載 荷、剛度，脛骨上段骨組織計(jì)量學(xué)靜態(tài)參數(shù)的骨組織總面積、 骨小梁面積、骨小梁周長(zhǎng)和動(dòng)態(tài)參數(shù)的標(biāo)記周長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)、骨 形成率(bfr/bv, bfr/tv)均明顯增加。提示aip可以防治 去卵巢所致的骨質(zhì)疏松大鼠腰椎生物力學(xué)性能的降低，可以 增強(qiáng)椎骨的抗變形能力，減少骨折的發(fā)生，提高骨質(zhì)量，詳 細(xì)的機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。參考文獻(xiàn)1 武密山，李恩，趙素芝，等.抗骨松顆粒對(duì)去卵巢 大鼠骨質(zhì)含量和生物力學(xué)的影響j中國(guó)老年學(xué)雜志， 2008, 28 (23)： 2289.2 明磊國(guó)，

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22、esin preventing and treating bone loss and enhancing bone qualityin ovariectomized osteoporosis ratswu mi-shanl, zhao su-zhi2*, ren li-zhong3, wang rul, bai xial, han hong-wei1, li bin4(1. department of formuloology , traditional chinese medicine college, hebei medical university, shijiazhuang 05009

23、1, china；2. qiaodong district shengbei community health centre of shijiazhuang, shijiazhuang 050041, china；3. department of orthopaedic, the first hospital of hebei medical university, shijiazhuang 050031, china；4. department of biochemistry, hebei medical university, shijiazhuang 050017, china)abst

24、roct objective： to explore the effect of anhydroicaritin phytosomes (aip) in preventing and treating bone loss and enhancing bone qua.1 ity in ovariectomized osteoporosis rats method： seventy-two sd female rats were randomly divided into 6 groups： the sham group, the model group, the estrogen group

25、and aip groups (low, middle, high) . the sham group was only sham opera ted, and the remaining five groups were ovariectomized one week after the ovariectomy, the rats were given 17 betaestrogen and aip (15, 30, 60 mg kg-1 ) for consecutively three months, during which period their serum calcium (sc

26、a), serum phosphorus (sp), alkaline phosphate (alp), urine calcium (uca), urine phosphorus (u-p), urinary deoxypyridinoline (dpyr) and creatinine (cr) were detected subsequently, rats were sacrificed, and their thighbone, second lumbar vertebrate and forth lumbar vertebrate were collected to detect

27、bone mineral density (bmd), bone calcium (bca) and phosphorus ( bp ) , biomechanical proper ties and bone histomorphometric parameters result： compared with the sham group, the model group showed a significant increase in serum alp, uca and dpyr /cr, and reduction in bmd of femur, bca and b-p, biomechanical proper ties (elas tic load, maximum load, break load, stiffness), static parameters (total tissue area, trabecular area, trabecular perimeter) and dynamic