免疫學實驗二ELISA雙抗夾心法學習教案

1、會計學1免疫學實驗免疫學實驗(shyn)二二ELISA雙抗夾心法雙抗夾心法第一頁，共24頁。酶聯(lián)免疫吸附試驗（酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISAELISA）是將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相）是將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合的一種敏感性很高的實驗技術(shù)，可用于檢測體液中微量的特異性抗體或抗原。首先，抗結(jié)合的一種敏感性很高的實驗技術(shù)，可用于檢測體液中微量的特異性抗體或抗原。首先，抗原、抗體的特異性反應(yīng)在一種固相載體表面聚苯乙烯微量反應(yīng)板孔中進行，通過洗滌去除原、抗體的特異性反應(yīng)在一種固相載體表面聚苯乙烯微量反應(yīng)板孔中進行，通過洗滌去除多余的游離反應(yīng)物；然后加入酶

2、標記的抗體或酶標記的抗抗體，從而形成抗體抗原酶標多余的游離反應(yīng)物；然后加入酶標記的抗體或酶標記的抗抗體，從而形成抗體抗原酶標抗體復(fù)合物（雙抗體夾心法）或抗原抗體抗抗體復(fù)合物（間接法）；此時加入酶底物和抗體復(fù)合物（雙抗體夾心法）或抗原抗體抗抗體復(fù)合物（間接法）；此時加入酶底物和顯色劑，在酶催化底物后，液體顯色劑，在酶催化底物后，液體(yt)(yt)呈現(xiàn)顯色反應(yīng)。液體呈現(xiàn)顯色反應(yīng)。液體(yt)(yt)顯色的強弱與復(fù)合物中待顯色的強弱與復(fù)合物中待測抗原或抗體的量呈正比，借此可檢測待測抗原或抗體的有無及含量。測抗原或抗體的量呈正比，借此可檢測待測抗原或抗體的有無及含量。該技術(shù)的特點是敏感性高，特異性強

3、，操作簡易，結(jié)果容易觀察。該技術(shù)的特點是敏感性高，特異性強，操作簡易，結(jié)果容易觀察。實驗實驗(shyn)原理：原理：第1頁/共23頁第二頁，共24頁。實驗實驗(shyn)原理：原理：第2頁/共23頁第三頁，共24頁。ELISA的測定方法包括的測定方法包括(boku)：雙抗體夾心雙抗體夾心(jixn)法：檢測抗原最常用的方法法：檢測抗原最常用的方法間接法：檢測抗體間接法：檢測抗體(kngt)最常用的方法最常用的方法競爭法：既可檢測抗原，亦可檢測抗體競爭法：既可檢測抗原，亦可檢測抗體生物素親和素系統(tǒng)生物素親和素系統(tǒng)ELISA法：是在法：是在ELISA中引入生物素或親和素放大系統(tǒng)，檢測極微量的抗原或

4、抗體的方法。中引入生物素或親和素放大系統(tǒng)，檢測極微量的抗原或抗體的方法。第3頁/共23頁第四頁，共24頁。直接直接(zhji)法法間接間接(jin ji)法法第4頁/共23頁第五頁，共24頁。第5頁/共23頁第六頁，共24頁。BAS-ELISA 底物底物(d w)1.已知已知Ab包被包被(bo bi)固相固相2.加待檢標本加待檢標本(biobn)3.加生物素標記的特異性抗體加生物素標記的特異性抗體4.加酶標記的親和素加酶標記的親和素5.加底物顯色加底物顯色親和素親和素酶酶生物素生物素待檢標本待檢標本biotin-avidin-system，生物素，生物素-親和素系統(tǒng)親和素系統(tǒng)此法敏感性更高。用

5、于抗原抗體以及此法敏感性更高。用于抗原抗體以及DNA、RNA的檢測。的檢測。第6頁/共23頁第七頁，共24頁。材料材料(cilio)和試劑：和試劑：1. HBsAg、包被液。、包被液。2.待檢人血清。待檢人血清。3.酶標記的抗酶標記的抗HBsAb抗體?？贵w。4.HBsAb陽性對照陽性對照(duzho)血清、血清、HBsAb陰性對照陰性對照(duzho)血清血清5.洗滌液：洗滌液：PH7.40.01mol/L PBS-吐溫吐溫20。6.底物溶液：底物溶液：OPD-H2O2或或TMD-H2O2。7.終止液：終止液：2mol/L H2SO4。8. 酶標反應(yīng)板、移液器、恒溫箱、酶標儀酶標反應(yīng)板、移液器

6、、恒溫箱、酶標儀 酶標板酶標板移液器移液器酶標儀酶標儀第7頁/共23頁第八頁，共24頁。操作步驟：包被：將包被：將HBsAg用包被液作適當稀釋（用包被液作適當稀釋（1：100），在），在96孔反應(yīng)板中每孔加孔反應(yīng)板中每孔加100l，置，置372h后再移置后再移置4過夜。過夜。洗滌洗滌(xd)：將：將96孔反應(yīng)板傾去包被液，用洗滌孔反應(yīng)板傾去包被液，用洗滌(xd)液液PBS-吐溫吐溫20加滿各孔，置加滿各孔，置3min,傾去，如此反復(fù)傾去，如此反復(fù)3次。（前兩步已完成）次。（前兩步已完成） 第8頁/共23頁第九頁，共24頁。1.1.已知抗原已知抗原(kngyun)(kngyun)包被酶標板包被酶

7、標板2.12.1棄去板內(nèi)包被抗原棄去板內(nèi)包被抗原2.22.2拍干拍干2.32.3加滿洗滌液（重復(fù)加滿洗滌液（重復(fù)(chngf)(chngf)三次）三次）第9頁/共23頁第十頁，共24頁。3.3.加樣加樣（1）陽性對照：第）陽性對照：第1、2孔加孔加HBsAb陽性對照血清陽性對照血清50l；（2）陰性）陰性(ynxng)對照：第對照：第3、4孔加孔加HBsAb陰性陰性(ynxng)對照血清對照血清50l；（3）空白對照：第）空白對照：第5孔加生理鹽水孔加生理鹽水100l；（4）余下各孔加待檢血清）余下各孔加待檢血清50l。第10頁/共23頁第十一頁，共24頁。加酶標記的抗加酶標記的抗HBsAb抗

8、體：除空白對照外各孔抗體：除空白對照外各孔50l，充分，充分(chngfn)混勻。將即時帖覆蓋于反應(yīng)板上，混勻。將即時帖覆蓋于反應(yīng)板上，37孵育孵育30min。棄去反應(yīng)孔內(nèi)液體，拍干，用洗滌液注滿各孔、靜置棄去反應(yīng)孔內(nèi)液體，拍干，用洗滌液注滿各孔、靜置30秒、再拍干，重復(fù)洗滌秒、再拍干，重復(fù)洗滌5 次。次。(操作同操作同2)顯色：各孔（包括空白對照）加底物顯色：各孔（包括空白對照）加底物A液液50l（1滴），底物滴），底物B液液50l（1滴），置滴），置37避光溫育避光溫育15min。終止反應(yīng)：各孔加終止液終止反應(yīng)：各孔加終止液50l （2mol/L H2SO4 ）。）。比色：將反應(yīng)板以酶標儀

9、比色：將反應(yīng)板以酶標儀450nm處用空白孔調(diào)零，測各孔處用空白孔調(diào)零，測各孔OD值。值。 第11頁/共23頁第十二頁，共24頁。6.顯色顯色(xin s)各孔（包括各孔（包括(boku)空白對照）加底物空白對照）加底物A液液50l（1滴），底物滴），底物B液液50l（1滴），置滴），置37避光溫育避光溫育15min7.終止終止(zhngzh)反應(yīng)反應(yīng)各孔加終止液各孔加終止液50l （2mol/L H2SO4 ）第12頁/共23頁第十三頁，共24頁。OPD（鄰苯二胺）經(jīng)酶作用后的顯色（鄰苯二胺）經(jīng)酶作用后的顯色(xin s)反應(yīng)反應(yīng)終止終止(zhngzh)前終止前終止(zhngzh)后后TMB四

10、甲基聯(lián)苯胺經(jīng)酶作用四甲基聯(lián)苯胺經(jīng)酶作用(zuyng)后的顯色反應(yīng)后的顯色反應(yīng)終止前終止后終止前終止后第13頁/共23頁第十四頁，共24頁。結(jié)果(ji gu)判斷：u計算：判斷值陰性對照平均計算：判斷值陰性對照平均OD值值2.1u結(jié)果判斷：待測樣品孔結(jié)果判斷：待測樣品孔OD值大于或等于值大于或等于(dngy)判斷值為陽性；判斷值為陽性；u小于判斷值為陰性。小于判斷值為陰性。u注：陰性對照注：陰性對照OD值小于值小于0.05按按0.05計算，計算，u大于大于0.05按實際按實際OD值計算判斷值。值計算判斷值。 第14頁/共23頁第十五頁，共24頁。注意事項：試劑及待測標本使用前應(yīng)平衡試劑及待測標本

11、使用前應(yīng)平衡(pnghng)至室溫，并將試劑混勻，棄去至室溫，并將試劑混勻，棄去12滴垂直滴加；滴垂直滴加；嚴格按照操作程序依次加樣，以保證實驗結(jié)果準確性；嚴格按照操作程序依次加樣，以保證實驗結(jié)果準確性；應(yīng)盡量避免孔中有氣泡，以免所測得應(yīng)盡量避免孔中有氣泡，以免所測得OD值不準確。值不準確。 第15頁/共23頁第十六頁，共24頁。思考題：1.免疫(miny)標記技術(shù)有哪些？各有何特點？。2.ELISA操作過程中應(yīng)注意哪些問題？第16頁/共23頁第十七頁，共24頁。第17頁/共23頁第十八頁，共24頁。人工主動免疫、人工被動免疫、人工主動免疫、人工被動免疫、計劃免疫計劃免疫注：紅色標記為要求掌握

12、英文注：紅色標記為要求掌握英文第18頁/共23頁第十九頁，共24頁。第19頁/共23頁第二十頁，共24頁。簡答簡答52=10第20頁/共23頁第二十一頁，共24頁。簡述簡述MHCMHC分子的結(jié)構(gòu)及其分布。分子的結(jié)構(gòu)及其分布。HLAHLA的主要生物學功能。的主要生物學功能。T T細胞表面有哪些細胞表面有哪些(nxi)(nxi)與其功能相關(guān)的重要分子。與其功能相關(guān)的重要分子。B B細胞表面有哪些細胞表面有哪些(nxi)(nxi)與其功能相關(guān)的重要分子。與其功能相關(guān)的重要分子。巨噬細胞的主要生物學功能。巨噬細胞的主要生物學功能。簡述免疫應(yīng)答的基本過程。簡述免疫應(yīng)答的基本過程?？乖奶岢释緩剑▋蓷l）?？乖奶岢释緩剑▋蓷l）。固有免疫的組成及其與適應(yīng)性免疫的關(guān)系。固有免疫的組成及其與適應(yīng)性免疫的關(guān)系。兩種人工免疫的主要區(qū)別。預(yù)防接種的注意事項。兩種人工免疫的主要區(qū)別。預(yù)防接種的注意事項。滅活疫苗與減毒活疫苗的主要區(qū)別。滅活疫苗與減毒活疫苗的主要區(qū)別。第21頁/共23頁第二十二頁，共24頁。第22頁/共23頁第二十三頁，共24頁。NoImage內(nèi)容(nirng)總結(jié)會計學。競爭法：既可檢測抗原(kn