免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)二ELISA雙抗夾心法學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)(shyn)二二ELISA雙抗夾心法雙抗夾心法第一頁，共24頁。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISAELISA）是將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相）是將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合的一種敏感性很高的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，可用于檢測體液中微量的特異性抗體或抗原。首先，抗結(jié)合的一種敏感性很高的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，可用于檢測體液中微量的特異性抗體或抗原。首先，抗原、抗體的特異性反應(yīng)在一種固相載體表面聚苯乙烯微量反應(yīng)板孔中進(jìn)行，通過洗滌去除原、抗體的特異性反應(yīng)在一種固相載體表面聚苯乙烯微量反應(yīng)板孔中進(jìn)行，通過洗滌去除多余的游離反應(yīng)物；然后加入酶

2、標(biāo)記的抗體或酶標(biāo)記的抗抗體，從而形成抗體抗原酶標(biāo)多余的游離反應(yīng)物；然后加入酶標(biāo)記的抗體或酶標(biāo)記的抗抗體，從而形成抗體抗原酶標(biāo)抗體復(fù)合物（雙抗體夾心法）或抗原抗體抗抗體復(fù)合物（間接法）；此時(shí)加入酶底物和抗體復(fù)合物（雙抗體夾心法）或抗原抗體抗抗體復(fù)合物（間接法）；此時(shí)加入酶底物和顯色劑，在酶催化底物后，液體顯色劑，在酶催化底物后，液體(yt)(yt)呈現(xiàn)顯色反應(yīng)。液體呈現(xiàn)顯色反應(yīng)。液體(yt)(yt)顯色的強(qiáng)弱與復(fù)合物中待顯色的強(qiáng)弱與復(fù)合物中待測抗原或抗體的量呈正比，借此可檢測待測抗原或抗體的有無及含量。測抗原或抗體的量呈正比，借此可檢測待測抗原或抗體的有無及含量。該技術(shù)的特點(diǎn)是敏感性高，特異性強(qiáng)

3、，操作簡易，結(jié)果容易觀察。該技術(shù)的特點(diǎn)是敏感性高，特異性強(qiáng)，操作簡易，結(jié)果容易觀察。實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shyn)原理：原理：第1頁/共23頁第二頁，共24頁。實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shyn)原理：原理：第2頁/共23頁第三頁，共24頁。ELISA的測定方法包括的測定方法包括(boku)：雙抗體夾心雙抗體夾心(jixn)法：檢測抗原最常用的方法法：檢測抗原最常用的方法間接法：檢測抗體間接法：檢測抗體(kngt)最常用的方法最常用的方法競爭法：既可檢測抗原，亦可檢測抗體競爭法：既可檢測抗原，亦可檢測抗體生物素親和素系統(tǒng)生物素親和素系統(tǒng)ELISA法：是在法：是在ELISA中引入生物素或親和素放大系統(tǒng)，檢測極微量的抗原或

4、抗體的方法。中引入生物素或親和素放大系統(tǒng)，檢測極微量的抗原或抗體的方法。第3頁/共23頁第四頁，共24頁。直接直接(zhji)法法間接間接(jin ji)法法第4頁/共23頁第五頁，共24頁。第5頁/共23頁第六頁，共24頁。BAS-ELISA 底物底物(d w)1.已知已知Ab包被包被(bo bi)固相固相2.加待檢標(biāo)本加待檢標(biāo)本(biobn)3.加生物素標(biāo)記的特異性抗體加生物素標(biāo)記的特異性抗體4.加酶標(biāo)記的親和素加酶標(biāo)記的親和素5.加底物顯色加底物顯色親和素親和素酶酶生物素生物素待檢標(biāo)本待檢標(biāo)本biotin-avidin-system，生物素，生物素-親和素系統(tǒng)親和素系統(tǒng)此法敏感性更高。用

5、于抗原抗體以及此法敏感性更高。用于抗原抗體以及DNA、RNA的檢測。的檢測。第6頁/共23頁第七頁，共24頁。材料材料(cilio)和試劑：和試劑：1. HBsAg、包被液。、包被液。2.待檢人血清。待檢人血清。3.酶標(biāo)記的抗酶標(biāo)記的抗HBsAb抗體。抗體。4.HBsAb陽性對(duì)照陽性對(duì)照(duzho)血清、血清、HBsAb陰性對(duì)照陰性對(duì)照(duzho)血清血清5.洗滌液：洗滌液：PH7.40.01mol/L PBS-吐溫吐溫20。6.底物溶液：底物溶液：OPD-H2O2或或TMD-H2O2。7.終止液：終止液：2mol/L H2SO4。8. 酶標(biāo)反應(yīng)板、移液器、恒溫箱、酶標(biāo)儀酶標(biāo)反應(yīng)板、移液器

6、、恒溫箱、酶標(biāo)儀 酶標(biāo)板酶標(biāo)板移液器移液器酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀第7頁/共23頁第八頁，共24頁。操作步驟：包被：將包被：將HBsAg用包被液作適當(dāng)稀釋（用包被液作適當(dāng)稀釋（1：100），在），在96孔反應(yīng)板中每孔加孔反應(yīng)板中每孔加100l，置，置372h后再移置后再移置4過夜。過夜。洗滌洗滌(xd)：將：將96孔反應(yīng)板傾去包被液，用洗滌孔反應(yīng)板傾去包被液，用洗滌(xd)液液PBS-吐溫吐溫20加滿各孔，置加滿各孔，置3min,傾去，如此反復(fù)傾去，如此反復(fù)3次。（前兩步已完成）次。（前兩步已完成） 第8頁/共23頁第九頁，共24頁。1.1.已知抗原已知抗原(kngyun)(kngyun)包被酶標(biāo)板包被酶

7、標(biāo)板2.12.1棄去板內(nèi)包被抗原棄去板內(nèi)包被抗原2.22.2拍干拍干2.32.3加滿洗滌液（重復(fù)加滿洗滌液（重復(fù)(chngf)(chngf)三次）三次）第9頁/共23頁第十頁，共24頁。3.3.加樣加樣（1）陽性對(duì)照：第）陽性對(duì)照：第1、2孔加孔加HBsAb陽性對(duì)照血清陽性對(duì)照血清50l；（2）陰性）陰性(ynxng)對(duì)照：第對(duì)照：第3、4孔加孔加HBsAb陰性陰性(ynxng)對(duì)照血清對(duì)照血清50l；（3）空白對(duì)照：第）空白對(duì)照：第5孔加生理鹽水孔加生理鹽水100l；（4）余下各孔加待檢血清）余下各孔加待檢血清50l。第10頁/共23頁第十一頁，共24頁。加酶標(biāo)記的抗加酶標(biāo)記的抗HBsAb抗

8、體：除空白對(duì)照外各孔抗體：除空白對(duì)照外各孔50l，充分，充分(chngfn)混勻。將即時(shí)帖覆蓋于反應(yīng)板上，混勻。將即時(shí)帖覆蓋于反應(yīng)板上，37孵育孵育30min。棄去反應(yīng)孔內(nèi)液體，拍干，用洗滌液注滿各孔、靜置棄去反應(yīng)孔內(nèi)液體，拍干，用洗滌液注滿各孔、靜置30秒、再拍干，重復(fù)洗滌秒、再拍干，重復(fù)洗滌5 次。次。(操作同操作同2)顯色：各孔（包括空白對(duì)照）加底物顯色：各孔（包括空白對(duì)照）加底物A液液50l（1滴），底物滴），底物B液液50l（1滴），置滴），置37避光溫育避光溫育15min。終止反應(yīng)：各孔加終止液終止反應(yīng)：各孔加終止液50l （2mol/L H2SO4 ）。）。比色：將反應(yīng)板以酶標(biāo)儀

9、比色：將反應(yīng)板以酶標(biāo)儀450nm處用空白孔調(diào)零，測各孔處用空白孔調(diào)零，測各孔OD值。值。 第11頁/共23頁第十二頁，共24頁。6.顯色顯色(xin s)各孔（包括各孔（包括(boku)空白對(duì)照）加底物空白對(duì)照）加底物A液液50l（1滴），底物滴），底物B液液50l（1滴），置滴），置37避光溫育避光溫育15min7.終止終止(zhngzh)反應(yīng)反應(yīng)各孔加終止液各孔加終止液50l （2mol/L H2SO4 ）第12頁/共23頁第十三頁，共24頁。OPD（鄰苯二胺）經(jīng)酶作用后的顯色（鄰苯二胺）經(jīng)酶作用后的顯色(xin s)反應(yīng)反應(yīng)終止終止(zhngzh)前終止前終止(zhngzh)后后TMB四

10、甲基聯(lián)苯胺經(jīng)酶作用四甲基聯(lián)苯胺經(jīng)酶作用(zuyng)后的顯色反應(yīng)后的顯色反應(yīng)終止前終止后終止前終止后第13頁/共23頁第十四頁，共24頁。結(jié)果(ji gu)判斷：u計(jì)算：判斷值陰性對(duì)照平均計(jì)算：判斷值陰性對(duì)照平均OD值值2.1u結(jié)果判斷：待測樣品孔結(jié)果判斷：待測樣品孔OD值大于或等于值大于或等于(dngy)判斷值為陽性；判斷值為陽性；u小于判斷值為陰性。小于判斷值為陰性。u注：陰性對(duì)照注：陰性對(duì)照OD值小于值小于0.05按按0.05計(jì)算，計(jì)算，u大于大于0.05按實(shí)際按實(shí)際OD值計(jì)算判斷值。值計(jì)算判斷值。 第14頁/共23頁第十五頁，共24頁。注意事項(xiàng)：試劑及待測標(biāo)本使用前應(yīng)平衡試劑及待測標(biāo)本

11、使用前應(yīng)平衡(pnghng)至室溫，并將試劑混勻，棄去至室溫，并將試劑混勻，棄去12滴垂直滴加；滴垂直滴加；嚴(yán)格按照操作程序依次加樣，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性；嚴(yán)格按照操作程序依次加樣，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性；應(yīng)盡量避免孔中有氣泡，以免所測得應(yīng)盡量避免孔中有氣泡，以免所測得OD值不準(zhǔn)確。值不準(zhǔn)確。 第15頁/共23頁第十六頁，共24頁。思考題：1.免疫(miny)標(biāo)記技術(shù)有哪些？各有何特點(diǎn)？。2.ELISA操作過程中應(yīng)注意哪些問題？第16頁/共23頁第十七頁，共24頁。第17頁/共23頁第十八頁，共24頁。人工主動(dòng)免疫、人工被動(dòng)免疫、人工主動(dòng)免疫、人工被動(dòng)免疫、計(jì)劃免疫計(jì)劃免疫注：紅色標(biāo)記為要求掌握

12、英文注：紅色標(biāo)記為要求掌握英文第18頁/共23頁第十九頁，共24頁。第19頁/共23頁第二十頁，共24頁。簡答簡答52=10第20頁/共23頁第二十一頁，共24頁。簡述簡述MHCMHC分子的結(jié)構(gòu)及其分布。分子的結(jié)構(gòu)及其分布。HLAHLA的主要生物學(xué)功能。的主要生物學(xué)功能。T T細(xì)胞表面有哪些細(xì)胞表面有哪些(nxi)(nxi)與其功能相關(guān)的重要分子。與其功能相關(guān)的重要分子。B B細(xì)胞表面有哪些細(xì)胞表面有哪些(nxi)(nxi)與其功能相關(guān)的重要分子。與其功能相關(guān)的重要分子。巨噬細(xì)胞的主要生物學(xué)功能。巨噬細(xì)胞的主要生物學(xué)功能。簡述免疫應(yīng)答的基本過程。簡述免疫應(yīng)答的基本過程?？乖奶岢释緩剑▋蓷l）?？乖奶岢释緩剑▋蓷l）。固有免疫的組成及其與適應(yīng)性免疫的關(guān)系。固有免疫的組成及其與適應(yīng)性免疫的關(guān)系。兩種人工免疫的主要區(qū)別。預(yù)防接種的注意事項(xiàng)。兩種人工免疫的主要區(qū)別。預(yù)防接種的注意事項(xiàng)。滅活疫苗與減毒活疫苗的主要區(qū)別。滅活疫苗與減毒活疫苗的主要區(qū)別。第21頁/共23頁第二十二頁，共24頁。第22頁/共23頁第二十三頁，共24頁。NoImage內(nèi)容(nirng)總結(jié)會(huì)計(jì)學(xué)。競爭法：既可檢測抗原(kn