缺氧誘導(dǎo)因子

1、12 Exercise training stimulates ischemia-induced neovascularization via phosphatidylinositol 3-kinase/Akt-dependent hypoxia-induced factor-1 alpha reactivation in mice of advanced age.在老年小鼠中通過磷脂酰肌醇3激酶/Akt依賴的缺氧因子1活化運動訓(xùn)練刺激缺血誘導(dǎo)的血管新生因子18、Transcriptional regulation of BNIP3 by Sp3 in prostate cancer.BNIP

2、3通過SP3在前列腺癌中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。Keywords:· prostate cancer;Sp3;BNIP3;transcriptional regulation;proliferationBACKGROUNDThe transcription factors Sp3/Sp1 are expressed in a various types of cancers and BNIP3 is overexpressed in prostate cancer. Although it has been demonstrated that BNIP3 is transcriptionally

3、 regulated by HIF-1 and is post-transcriptionally regulated by miR145, our previous data indicated that there might be some other transcription factors regulating BNIP3 in prostate cancer.This study is conducted to investigate whether BNIP3 expression is directly regulated by Sp3/Sp1 or not.轉(zhuǎn)錄因子SP1

4、SP3 /在各種類型的癌癥和BNIP3的表達(dá)在前列腺癌中高表達(dá)。雖然它已被證明是BNIP3 HIF-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，后由miR145轉(zhuǎn)錄調(diào)控，我們以前的數(shù)據(jù)表明，可能有一些其他的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子在前列腺癌中的表達(dá)。本研究旨在探討B(tài)NIP3的表達(dá)是由sp3 / SP1或不能直接調(diào)節(jié)MATERIALS AND METHODSBioinformatics analysis shows that BNIP3 promoter contains several potential Sp3/Sp1 binding sites. And then it is demonstrated that SP3 could

5、 regulate the BNIP3 transcriptionally by binding to the predicted sites by dual reporter gene assays, ChIP, and EMSA. The biological effects of SP3 regulating BNIP3 on prostate cancer cells proliferation are measured by MTT, TUNEL, and flow cytometry.生物信息學(xué)分析表明，BNIP3啟動子包含了幾個潛在的sp3 / Sp1結(jié)合位點。然后，它表明SP3

6、可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄結(jié)合BNIP3的預(yù)測雙報告基因檢測，芯片網(wǎng)站，EMSA。SP3調(diào)控BNIP3對前列腺癌細(xì)胞增殖的生物學(xué)效應(yīng)是通過MTT法、TUNEL法和流式細(xì)胞儀檢測。RESULTSOur data show that Sp3 but not Sp1, is positively related to BNIP3 overexpression in prostate cancer.Sp3 can directly regulate BNIP3 transcription by mainly binding to the Sp3 binding sites (624615 and 350343) o

7、f BNIP3 promoter. Knockdown of Sp3 by RNA interference could reduce cells growth and lead to cells apoptosis in PC-3 and DU145. Sp3-dependent BNIP3 overexpression might be an important mechanism to promote prostate cancer cells proliferation.CONCLUSIONThis is the first study to provide direct eviden

8、ce of Sp3-dependent BNIP3 expression. Sp3 might be the major transcriptional regulator of BNIP3 in prostate cancer and it is worthy to further study. The regulation of BNIP3 by Sp3 may be a new cancer-specific therapeutic target in prostate cancer. Prostate 75:15561567, 2015. © 2015 Wiley

9、Periodicals, Inc.NEP表達(dá)在常氧和低氧條件下培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞株相比。NEP活性，蛋白水平和mRNA水平均采用酶法測定，Western印跡法和熒光定量PCR分析，分別。電泳遷移率變動分析和染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（芯片）是用來確認(rèn)NEP的負(fù)調(diào)控在轉(zhuǎn)錄水平的缺氧反應(yīng)元件（重點）。進行測試和HIF-1的相互作用細(xì)胞共定位和免疫共沉淀。PC3細(xì)胞穩(wěn)定細(xì)胞基因穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞PC3細(xì)胞，隨著他們的控制，利用慢病毒表達(dá)系統(tǒng)的建立。進行測試的細(xì)胞HIF-1蛋白及其下游基因轉(zhuǎn)錄的影響進行Western blot及實時定量PCR。研究缺氧對細(xì)胞的潛在作用，細(xì)胞生長和克隆形成試驗進行穩(wěn)定表達(dá)株P(guān)C3細(xì)

10、胞進行19、Expression of BNIP3 correlates with hypoxia-inducible factor (HIF)-1alpha, HIF-2alpha and the androgen receptor in prostate cancer and is regulated directly by hypoxia but not androgens in cell lines.BNIP3表達(dá)與缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1的相關(guān)性，會和雄激素受體在前列腺癌中，受缺氧直接但沒有雄激素的細(xì)胞系。Shaida N1,Launchbury R1,Boddy JL1,Jone

11、s C1,Campo L1,Turley H1,Kanga S1,Banham AH1,Malone PR1,Harris AL1,Fox SB1更多相關(guān)基因：   BNIP3; HIF1APMID: 18163427影響因子 3.565BACKGROUND:BNIP3 is a hypoxia-induced protein involved in cell death and survival but its role in human tumors is unclear. This study investigated the

12、role of BNIP3 in prostate cancer.METHODS:The expression of BNIP3, the androgen receptor (AR), hypoxia inducible factor (HIF)-1alpha, HIF-2alpha and the hypoxia regulated gene GLUT1 were assessed in tissue microarrays constructed from 149 radical prostatectomy specimens. Statistics com

13、pared expression of these factors between each other, conventional clinicopathological parameters and PSA recurrence. Since an association between BNIP3 and AR and the HIFs was observed, the influence of hypoxia, dihydrotestosterone and the AR blocker, Casodex, was also

14、 investigated in prostate cell lines.RESULTS:BNIP3 was expressed in the nucleus and cytoplasm. Eight of 149 (5.5%) tumors showed no expression, 44/149 (29.5%) cases showed exclusively cytoplasmic expression, 17/149 (11.5%) cases showed exclusively nuclear expression and 80/149 (53.5%) cases sho

15、wed both cytoplasmic and nuclear expression. There was a significant correlation between cytoplasmic BNIP3 expression and Gleason score (P=0.005), age (P=0.02), AR (P=0.001), and GLUT1 (P=0.006). There was a significant correlation between nuclear BNIP3expression and HIF-1al

16、pha expression (P=0.006) and HIF-2alpha expression (P=0.013) but no correlation between BNIP3 and pre-operative PSA, tumor volume, margin positivity or capsular invasion (all P>0.05). There was an increase in BNIP3 expression under conditions of hypoxia (0.1% 0(2) but not with

17、 dihydrotestosterone stimulation or with Casodex treatment.CONCLUSIONS:These findings suggest that BNIP3 is directly regulated by hypoxia but that there may be a hormonal independent mechanism coordinating the expression of BNIP3 in prostate tumors.背景：缺氧誘導(dǎo)BNIP3蛋白參與細(xì)胞死亡和生存，但其在人類腫瘤

18、中的作用尚不清楚。這項研究調(diào)查了前列腺癌中BNIP3的作用。方法：BNIP3的表達(dá)，雄激素受體（AR）、缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1，HIF-2的調(diào)節(jié)在149的前列腺癌根治術(shù)標(biāo)本構(gòu)建組織芯片進行基因GLUT1的缺氧。統(tǒng)計分析比較了這些因子在各因子之間、常規(guī)臨床病理參數(shù)和抗原特異性復(fù)發(fā)率之間的比較。自從BNIP3和AR和HIF觀察之間的關(guān)聯(lián)，缺氧的影響，睪酮和AR拮抗劑，其中，也在前列腺癌細(xì)胞株的研究結(jié)果：BNIP3在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。149，八（5.5%）腫瘤無表達(dá)，44 / 149（29.5%）的情況下，表現(xiàn)出專門的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，17 / 149（11.5%）的情況下，完全核表達(dá)和80 /

19、149（53.5%）的情況下，表現(xiàn)出細(xì)胞質(zhì)和核表達(dá)。有一個顯著的相關(guān)性質(zhì)BNIP3的表達(dá)與格里森評分（P = 0.005），年齡（P = 0.02），AR（P = 0.001），和GLUT1（P = 0.006）。有一個顯著的相關(guān)性核BNIP3的表達(dá)和HIF-1的表達(dá)（P = 0.006）和HIF-2的表達(dá)（P = 0.013）無相關(guān)性，術(shù)前PSA BNIP3，與腫瘤體積、邊緣陽性或包膜浸潤（P > 0.05）。有一個增加BNIP3的表達(dá)在缺氧的條件下（0.1%，0（2）但不與雙氫睪酮刺激或比卡魯胺治療結(jié)論：這些結(jié)果表明，BNIP3的缺氧還可能是一種激素自主協(xié)調(diào)機制在前列腺腫瘤的直接調(diào)控

20、BNIP3的表達(dá)。22、論文題目：HIF-1BNIP3信號通路調(diào)節(jié)的低氧誘導(dǎo)自噬在唾液腺腺樣囊性癌中的作用陳占偉博士學(xué)位論文 (專業(yè)學(xué)位)第一部分低氧誘導(dǎo)唾液腺腺樣囊性癌ACCM細(xì)胞自噬的實驗研究第二部分低氧條件下抑制自噬過程觀察腺樣囊性癌ACCM細(xì)胞侵襲的實驗研究大量研究表明低氧狀態(tài)與腫瘤的侵襲性、血管再生、提高復(fù)發(fā)率及放化療耐受性之間存在復(fù)雜的聯(lián)系。作為氧平衡的重要調(diào)節(jié)因子，HIF-1是在低氧條件下重要的轉(zhuǎn)錄因子。HIFl是由HIFl和HIFl B兩種亞基組成的異源二聚體，HIF一1是HIF一1的結(jié)構(gòu)性亞基，在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)相對穩(wěn)定：HIF-1是HIF一1的功能亞基，常氧條件下不斷合成，同時

21、不斷經(jīng)泛素一蛋白酶小體途徑水解。低氧條件下，HIF一1降解受阻，在細(xì)胞漿內(nèi)積聚增多，向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，與HIF-l 結(jié)合調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。HIFl 已經(jīng)在大多數(shù)常見的人類癌癥中觀察到，如頭頸部的惡性腫瘤、卵巢癌和食道癌中，并與不良預(yù)后及治療抵抗相關(guān)。 HIF-l作為一種轉(zhuǎn)錄因子，其靶基因產(chǎn)物涉及無氧糖代謝、氧輸送、新生血管生成和血管擴張等，使腫瘤細(xì)胞耐受缺氧，且增加供氧和供能，從而促進腫瘤生長、浸潤和轉(zhuǎn)移。HIFl 調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的基因中BNIP3(Bcl-2adenovirus E1B19一kDainteracting protein 3)可以僅通過NTAD(HIF-1 Q的一種反式激活域)激活，H

22、IF-l 作用于BNIP3啟動子區(qū)域的缺氧反應(yīng)元件(HRE)其核心序列是5一CGTG一3，它是誘導(dǎo)BNIP3表達(dá)的最強刺激因子5。BNIP3是包含單BH3區(qū)的促凋亡成員，屬于Bcl-2蛋白超家族。BNIP3，即Bcl2腺病毒E1B 19 kDa相關(guān)蛋白3(BCL2adenovirus E1B19kDainteracting protein 3)，屬于促凋亡蛋白，其表達(dá)受HIF-1依賴的缺氧的調(diào)節(jié)及其他很多因素的影響。BNIP3蛋白主要定位于線粒體外膜，當(dāng)其被激活后，完全整合入線粒體外膜，通過開放線粒體通透性轉(zhuǎn)運孔(mitochondrialpermeability transition por

23、e，MPTP)損傷線粒體功能引起染色質(zhì)凝聚、DNA分解，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。近年來，BNIP3的異常表達(dá)和很多腫瘤的進展、化療耐藥及自噬密切相關(guān)。BNIP3的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄因子HIF-1a的調(diào)控，在低氧誘導(dǎo)細(xì)胞自噬凋亡過程中起重要的作用。然而，唾液腺腺樣囊性癌中BNIP3的表達(dá)、其調(diào)節(jié)的低氧誘導(dǎo)自噬通路及臨床病理學(xué)行為國內(nèi)外尚未有文獻報道。自噬指的是從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的無核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜包裹的部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需要降解的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)等形成自噬體，與溶酶體融合后形成自噬溶酶體，進一步降解所包裹的多余蛋白質(zhì)和亞細(xì)胞成分，來實現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和細(xì)胞器的更新，來維持自身的穩(wěn)定。其整個過程主要分3個

24、階段：自噬小體的初步形成；自噬體膜的延伸；自噬體與溶酶體融合并降解。氯喹可以通過升高溶酶體內(nèi)的PH值，進而阻止自噬體與溶酶體結(jié)合而抑制自噬。我們的研究團隊在之前調(diào)查過79名患有頭頸部腺樣囊性癌的患者，觀察自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈一3(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3)和Beclin1的表達(dá)，結(jié)果顯示二者在腺樣囊性癌形成的過程中起重要的作用。近期的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)低氧狀態(tài)與誘導(dǎo)自噬之間存在某些聯(lián)系，然而低氧誘導(dǎo)腺樣囊性癌細(xì)胞自噬的分子機制尚未完全明確。低氧是實體腫瘤微環(huán)境中常見的現(xiàn)象（心衰？）。腫瘤在高速增殖的過程中，血管生成

25、速度顯著低于細(xì)胞增殖速度，氧供應(yīng)的速度滯后于細(xì)胞對氧的需求；同時，與正常組織相比，腫瘤組織中會產(chǎn)生大量結(jié)構(gòu)和功能異常的血管結(jié)構(gòu)，使得腫瘤中央?yún)^(qū)域的細(xì)胞普遍處于低氧狀態(tài)。HIFl a調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的基因中BNIP3(Bcl-2adenovirus E1B19一kDainteracting protein 3)可以僅通過NTAD(HIF-1 Q的一種反式激活域)激活，HIF-l Q作用于BNIP3啟動子區(qū)域的缺氧反應(yīng)元件(HRE)其核心序列是5一CGTG一3，它是誘導(dǎo)BNIP3表達(dá)的最強刺激因子5。BNIP3是包含單BH3區(qū)的促凋亡成員，屬于Bc卜2蛋白超家族。研究表明，低氧可以誘導(dǎo)自噬，并且主要是通過

26、HIF一1 BNIP3通路實現(xiàn)的6，7，8，9。在低氧應(yīng)激下腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生大量氧自由基等有害物質(zhì)損害線粒體并且影響基因的穩(wěn)定性，此時細(xì)胞通過自噬清除受損線粒體，減少受損所致凋亡，保護細(xì)胞存活。而這種HIF一1 調(diào)節(jié)的線粒體自噬可以有效抑制ROS水平的升高和細(xì)胞的死亡，從而實現(xiàn)對細(xì)胞存活的促進作用6。HIF一1 在低氧條件下水平升高，作為一種轉(zhuǎn)錄因子激活BNIP3BNIP3L(Bc卜2adenovirus E1819一kDainteract ing protein 3 like)。通過沉默BNIP3觀察低氧誘導(dǎo)的自噬表達(dá)也證實BNIP3在HIF一1 調(diào)節(jié)的自噬中的重要性。在常氧狀態(tài)下，Beclin

27、 1Bc1-2、Beclin 1Bc1-XL復(fù)合物之間低水平的分子親和力不足以誘導(dǎo)自噬。而低氧誘導(dǎo)的自噬表達(dá)證實通過分離Beclin 1Bc1-2、Beclin 1Bc1-XL復(fù)合物促進了自噬的表達(dá)。此過程中，BNIP3的BH3區(qū)發(fā)揮了重要作用。僅含BH-3區(qū)的BNIP3通過可以輕易的與Beclin-1競爭破壞Beclin 1Bc1-2、Beclin 1Bc1-XL復(fù)合物的聯(lián)系，導(dǎo)致Beclin-l獲得釋放，從而調(diào)節(jié)自噬水平的提高10。HIF-1 BNIP3信號通路調(diào)節(jié)的低氧自噬中，Beclin-1Bc1-2途徑主要參與了自噬的調(diào)控。Beclin-1基因是At96的哺乳動物同源基因， 是自噬所

28、必需的基因， 在自噬體雙層膜形成過程中作用重要11。Beclinl作為腫瘤抑制基因通過調(diào)控細(xì)胞自噬以維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，是III型P13K不可或缺的活化因子。BNIP3就是通過BH一3區(qū)的結(jié)合釋放Beclin一1上調(diào)了自噬水平。本課題擬在前期研究證實自噬相關(guān)基因的表達(dá)與腺樣囊性癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基礎(chǔ)上，運用分子生物學(xué)觀測HIFla、BNIP3、微管相關(guān)蛋白輕鏈3(MicrotubuleassociatedproteirIlightchain 3，MAPLC3)、Beclinl的表達(dá)變化，探討低氧相關(guān)基因HIFla、BNIP3以及自噬相關(guān)基因MAPLC3、Becl in一1的表達(dá)情況，。采用

29、細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，體外培養(yǎng)唾液腺腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CCM，應(yīng)用二氯化鈷模擬低氧環(huán)境，從而誘導(dǎo)ACCM細(xì)胞自噬現(xiàn)象的產(chǎn)生，同時檢測HIF-1 aBNIP3信號通路在這個過程中扮演的角色。本課題首次觀察低氧誘導(dǎo)的自噬在唾液腺腺樣囊性癌中的作用，并進一步探討HIFlaBNIP3信號通路調(diào)節(jié)的低氧誘導(dǎo)自噬在唾液腺腺樣囊性癌中的重要作用，為今后的預(yù)防和治療提供新的思路和作用新靶點。第一部分討論在本次試驗中，首先我們發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境下自噬體的生成明顯增加、自噬相關(guān)基因明顯上調(diào)；其次，HIF一1與其靶基因BNIP3在低氧誘導(dǎo)腺樣囊性癌自噬過程產(chǎn)生中扮演重要的角色。由于不完全的血液供應(yīng)及對氧氣的巨大需求使低氧狀態(tài)在

30、腫瘤細(xì)胞中迅速發(fā)展。大量證據(jù)表明低氧狀態(tài)普遍存在于頭頸部腫瘤中，并是一種重要的負(fù)性因子【18】。為了闡明低氧對腺樣囊性癌的影響，我們用二氯化鈷來處理Acc-M細(xì)胞株來觀察腫瘤細(xì)胞對低氧狀態(tài)的反應(yīng)。二氯化鈷已被廣泛應(yīng)用于擬態(tài)低氧環(huán)境，并可阻礙HIF-1 a的降解從而導(dǎo)致其過表達(dá)【19】。此外有的研究傾向于探索二氯化鈷是否可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡【20，2l】。本次實驗結(jié)果顯示適當(dāng)?shù)脑黾佣然挼臐舛瓤梢越档图?xì)胞的活性。作為轉(zhuǎn)錄因子，HIF-1 a轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中與HIF-1形成一復(fù)合體從而激活幾個轉(zhuǎn)錄基因，比如BNIP379。BNIP3是BH3omy Bcl2家族成員，被HIF-1調(diào)控，是一種很具代表性的

31、低氧反應(yīng)基因【22。在本次實驗中，BNIP3蛋白和mRNA的上調(diào)伴隨HIF-1 蛋白表達(dá)上調(diào)。在HIF-1依賴途徑中，低氧狀態(tài)可以很快誘導(dǎo)自噬過程的產(chǎn)生，HIF-1 aBNIP3信號通路在此過程中扮演決定性的角色。在Bcl-xL aIld Beclin 1功能和物理相互作用的研究中證實BH3結(jié)構(gòu)域影響自噬過程【25，26】。因此合乎邏輯的推論是BH3-0nly亞科，例如BNIP3需要進一步的研究。在用二氯化鈷處理的ACC-M細(xì)胞中我們發(fā)現(xiàn)BINP3和Beclin 1的表達(dá)均明顯上調(diào)，同時LC3一II的表達(dá)也明顯增加。所有的證據(jù)均表明二氯化鈷模擬的低氧環(huán)境能夠誘導(dǎo)增加ACCM細(xì)胞產(chǎn)生自噬，同時H

32、IF一1BNIP3信號通路在這個過程中起到重要的作用第二部分 低氧條件下抑制自噬過程觀察腺樣囊性癌侵襲的實驗研究自噬是發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)，吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器并使其包被進入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物的過程，是維持細(xì)胞的生物合成所必需的3】。越來越多的研究證實自噬過程在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著一個具有爭議的角色：一方面它可以提高腫瘤細(xì)胞對不良環(huán)境的適應(yīng)能力，比如低氧狀態(tài)；另一方面，自噬過程還可以通過降低傷害來保護正常細(xì)胞從而限制腫瘤發(fā)生【4】23、HIF-1在喹啉酸誘導(dǎo)的PCI2細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞損傷中的作用碩士學(xué)位論文 楊開勇方法將體外培養(yǎng)的PCI2和SH-S

33、Y5Y細(xì)胞經(jīng)不同濃度喹啉酸處理不同時間后，分別篩選出喹啉酸誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的低、中、高劑量及其作用時間，然后將實驗分為對照組、喹啉酸低、中、高劑量組及HIF-1抑制劑(2ME2)預(yù)處理損傷模型組，分別作用細(xì)胞24 h后，采用噻唑藍(lán)還原法和乳酸脫氫酶漏出率檢測法測定細(xì)胞損傷程度，采用丙二醛和超氧化物歧化酶試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)氧自由基水平，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，Hoechst 33342單熒光染色法觀察細(xì)胞凋亡，免疫熒光染色法檢測HIF1在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，免疫印跡法檢測細(xì)胞HIFls、3-鏈蛋白(p-Catenin)、糖原合成激酶一313(Glycogen synthasekinase3p，GS

34、K一3)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(phosphorylatedAkt，p-Akt)、淋巴瘤白血病-2(B cell lymphomalewkmia-2，Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)x蛋白(Bcl-2Associated XProtein，Bax)的表達(dá)。11神經(jīng)系統(tǒng)疾病與興奮性氨基酸112神經(jīng)發(fā)育過程中的經(jīng)典WntCatenin信號通路2121 WntCatenin信號通路的主要組成2122 GSK-3和-Catenin的主要功能313低氧誘導(dǎo)因子-1僅及其抑制劑4131 低氧誘導(dǎo)因子-1的結(jié)構(gòu)和功能4132 HIF-1的抑制劑2-甲氧基雌二醇614科學(xué)問題與假設(shè)一6141科學(xué)問題

35、6142提出假設(shè)715研究目的與意義一7151研究目的7152研究意義716研究思路與技術(shù)路線7161研究思路7162實驗技術(shù)路線HIF-1廣泛存在于哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，是目前發(fā)現(xiàn)的一種具有高度特異性能感受細(xì)胞氧分壓的調(diào)控蛋白。HIF-1由氧敏感的HIF-1a和組成性表達(dá)的HIF-1兩個亞基組成，其中HIF-1是主要的活性亞基22,23。HIF-1 【蛋白由四個功能結(jié)構(gòu)域組成：堿性的螺旋環(huán)螺旋(basichelix-loop-helix，bHLH)結(jié)構(gòu)域、參與二聚體形成及與DNA結(jié)合(Per-arylhydrocarbon receptornuclear translocator-sim，PER-

36、川礬T-SIM，PAS)結(jié)構(gòu)域，氧依賴降解(oxygen-dependent degradation，ODD)結(jié)構(gòu)域，以及兩個轉(zhuǎn)錄活化所需的反式激活結(jié)構(gòu)域(transactivation domains，NTAD和CTAD)。HIF113包含bHLH，PAS及轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域【24】，如圖1-4所示。常氧下，HIF-1的半衰期極短，在胞漿中幾乎檢測不到，一方面，HIF-1a合成后經(jīng)PHD羥基化，通過希佩爾-林道腫瘤抑制蛋白(pVHL)迅速被泛素化蛋白酶降解；另一方面，F(xiàn)IH(又稱HIF-1抑制因子)對于不經(jīng)蛋白酶體降解途徑的HIF-1起二級負(fù)向調(diào)控作用。在低氧條件下，ODD結(jié)構(gòu)域脯氨酸的羥基化被

37、抑制，阻止HIFl的泛素化降解，HIF-1在胞漿內(nèi)積聚【25，26，此外，F(xiàn)IH的活性受到抑制，HIFl的轉(zhuǎn)錄活性增加【27，28】，繼而通過其核定位信號轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與HIF113結(jié)合形成異二聚體HIF-1，如圖15所示。HIF-1通過作用于靶基因上的低氧反應(yīng)元件調(diào)控基因的表達(dá)，參與血管形成、糖代謝、細(xì)胞存活和增殖等過程22，2·】。在缺血性或出血性腦損傷后，大鼠腦組織HIF-1表達(dá)明顯提高【z9，30】；而離體培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)缺氧缺糖處理后，HIF-1表達(dá)也明顯提高，且出現(xiàn)細(xì)胞核內(nèi)聚集【31】，表明HIF-1調(diào)節(jié)了神經(jīng)細(xì)胞的損傷過程。但HIF-1是否調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞興奮性損傷，其作用的分

38、子機制目前仍不明確。另有研究表明，磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3kinase，P13K)絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(protein serine threonine kinase，Akt)信號通路參與了HIF-1的表達(dá)32，33,341。但在神經(jīng)細(xì)胞興奮性損傷中，是否有HIF-1的參與，若有，HIF-1是促進損傷還是參與保護，以及是否接受P13KAkt信號通路的調(diào)節(jié)，目前也均不明確。14科學(xué)問題與假設(shè)141科學(xué)問題在神經(jīng)系統(tǒng)興奮性毒性損傷過程中，其損傷的分子機制是否與HIF-la有關(guān)?若有，HIF1a是參與調(diào)節(jié)損傷還是損傷預(yù)適應(yīng)?此外，HIF-la的激活是否參與Akt

39、GSK-3-Catenin信號通路的調(diào)控?目前均不明確。142提出假設(shè)HIF1et參與了喹啉酸導(dǎo)致的PCI2和SHSY5Y細(xì)胞損傷。HIF10t的抑制劑2ME2可減輕喹啉酸誘導(dǎo)的PCI2和SHSY5Y細(xì)胞損傷。HIF1ct的激活參與AktGSK-3-Catenin信號通路的調(diào)控。15研究目的與意義151研究目的探討HIF-1在PCI2和SHSY5Y細(xì)胞興奮性毒性損傷中的作用及其與AktGSK-3-Catenin信號通路的關(guān)系，為證實HIF-l及其信號通路參與神經(jīng)元興奮性損傷提供依據(jù)。152研究意義明確HIF-1參與了喹啉酸誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷及HIF-1儀的抑制劑(2M巳2)對喹啉酸誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損

40、傷具有保護作用。從而對谷氨酸所致的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預(yù)防及治療提供新的思路。1。6研究思路與技術(shù)路線161研究思路人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞和大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PCI2細(xì)胞是較好的神經(jīng)元模型，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)毒理學(xué)和神經(jīng)藥理學(xué)等研究。因此，本課題以PCI2及SH-SY5Y細(xì)胞作為實驗對象，以喹啉酸損傷作為手段，觀察并分析HIF-let抑$1J齊U(2ME2)對QA所致細(xì)胞存活率、形態(tài)學(xué)變化及各種相關(guān)蛋(aO-IF-lot、-Catenin、GSK-3D、p-Akt、Akt、Bcl-2、Bax)表達(dá)的影響，明確QA所致PCI2和SH-SY5Y細(xì)胞的損傷與HIF-1及AkffGSK-3-C

41、atenin信號通路的關(guān)系，如圖1-6所示。討論在神經(jīng)細(xì)胞損傷過程中，HIF-1a及其信號通路發(fā)揮了重要作用。離體培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元經(jīng)缺血樣損傷后，HIF-1a表達(dá)顯著增加并集中于核內(nèi)，過表達(dá)HIF-1a可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。動物經(jīng)受各種腦損傷如缺血性損傷、撞擊性腦外傷后，腦組織HIF-1a表達(dá)上調(diào)，HIF-1a抑制劑如2甲氧雌甾二醇則具有明顯的保護作用【48，·9】，表明HIF-1a可能參與了神經(jīng)損傷。但另一些證據(jù)卻表明HIF-1a可參與了神經(jīng)細(xì)胞對損傷的適應(yīng)過程：與野生型小鼠相比，神經(jīng)元特異性HIF-1a基因敲除小鼠對缺氧更加敏感，神經(jīng)細(xì)胞損傷更為嚴(yán)重【50】；HIF-1a抑制劑可減弱低

42、氧預(yù)處理引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞對氧化損傷的適應(yīng)作用51】。這些不一致的實驗結(jié)果提示在神經(jīng)細(xì)胞損傷過程中，HIF-1a可能具有雙向適應(yīng)性調(diào)節(jié)作用：HIF-1a輕度或中度誘導(dǎo)表達(dá)可促進細(xì)胞適應(yīng)損傷，而過量表達(dá)則導(dǎo)致細(xì)胞死亡【5253】。本實驗結(jié)果表明，510 mmolL QA作用24 h可顯著誘導(dǎo)PCI2細(xì)胞HIF-1a表達(dá)，且呈現(xiàn)劑量依賴性，表明HIF-1a信號通路可能參與了PCI2細(xì)胞損傷過程。同時，HIF-1a的活化受到多種分子的調(diào)控，如活性氧可通過激活一些細(xì)胞內(nèi)信號，繼而磷酸化HIF-1a的641和643位的絲氨酸位點，使其穩(wěn)定停留于細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮其促基因轉(zhuǎn)錄的作用54，55】；Akt也可通過調(diào)

43、節(jié)其下游分子如叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子04(forkhead transcriptionfactor 04，F(xiàn)OX04)、糖原合成酶313(the glycogen synthase kinase-3D，GSK-3p)等導(dǎo)致HIF-la的穩(wěn)定56,57。本實驗結(jié)果表明，QA可引起PCI2細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高和Akt的活化，進而導(dǎo)致HIF-1a表達(dá)上調(diào)，提示ROSAktHIF-1a可能參與了細(xì)胞的損傷過程。322QA中劑量組作用不同時間PCI2細(xì)胞HIFlot蛋白檢測采用免疫蛋白印跡法檢測檢N5 mmolL QA作用不同時間PCI2細(xì)胞內(nèi)HIF1a蛋白的表達(dá)，按照2284的步驟進行。326細(xì)胞內(nèi)HIF-1

44、的表達(dá)定位檢測328細(xì)胞HIF1a、-Catenin、csK-3、Akt、p-Akt、Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)檢測細(xì)胞按照321中的分組經(jīng)處理24 h后，收集細(xì)胞，提取總蛋白并測定蛋白濃度。將30ug蛋白進行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜并封閉后，加入抗HIF-1(1：1000)、pCatenin(1：looo)、GSK一3 (1：looo)、Akt0：1000)、p-Akt(1：looo)、Bax(1：1000)、Bcl-2(1：lOOO)和GAPDH(1：7 000)抗體于4反應(yīng)過夜。洗滌后，將膜和相應(yīng)二抗fl：5 ooo)在室溫下反應(yīng)1 h，以底物化學(xué)發(fā)光試劑顯色后并以凝膠成像系統(tǒng)(Ch

45、ampGel 5000，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)進行掃描，以ImageJ軟件分析各條帶灰度值。以GAPDH條帶灰度值作參照，進行半定量分析。335 2ME2對QA誘導(dǎo)PCI2細(xì)胞內(nèi)HIF1a核轉(zhuǎn)位的影響在細(xì)胞處于不同狀態(tài)下，HIF-1a的表達(dá)位置和表達(dá)量也出現(xiàn)變化，進而導(dǎo)致其功能的變化。本實驗采用熒光免疫組化實驗檢測HIF-1a在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)定位。如所示，在對照組細(xì)胞中，HIF-1a幾乎不表達(dá)；25 mmolL QA處理24 h后，PCI2細(xì)胞HIF-1a出現(xiàn)低表達(dá)；5 mmolL QA可明顯誘導(dǎo)細(xì)胞核內(nèi)HIF-1a高表達(dá)；10 mmolL QA處理使細(xì)胞核內(nèi)HIF-1a表達(dá)明顯提高；10m

46、molL2ME2+5 mmolL QA處理明顯抑制細(xì)胞內(nèi)HIF-1a發(fā)生核轉(zhuǎn)位(圖35)。4討論第二章的實驗結(jié)果顯示，QA可劑量性導(dǎo)致PCI2細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，同時誘導(dǎo)HIF-1 高表達(dá)，Akt磷酸化，表明AkV/HIF-1 信號通路可能參與了該損傷過程。該結(jié)果提示，HIF-1 參與了神經(jīng)興奮毒性，抑制HIF-1 及其下游信號通路可能具有抑制興奮性神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用。因此，本章給予HIF-1 的抑制劑2ME2加以驗證。如本章圖3-1的Western Blot結(jié)果顯示，隨著QA作用PCI2細(xì)胞時間的增長，HIF-1 的表達(dá)水平逐漸升高。與正常對照組相比，QA作用6h后其表達(dá)量顯著提高，24 h達(dá)到高

47、峰。因此，在24 hCk，將HIF-1 抑制劑2ME2作用于QA損傷的PCI2細(xì)胞，觀察其能否減輕QA所致細(xì)胞活性受損，從而判斷HIF-1 【在QA誘導(dǎo)PCI2細(xì)胞損傷中的作用。結(jié)果表明，與損傷對照組相比，2ME2可促進細(xì)胞存活，減少細(xì)胞損傷，減輕細(xì)胞膜的破壞，細(xì)胞透光率增強，胞體皺縮明顯減少，軸突變長，并使細(xì)胞死亡減少，說明抑制HIF-1 的表達(dá)對損傷細(xì)胞具有保護作用。此外，2ME2可通過抑制HIF-1 的表達(dá)從而阻斷HIF-1 通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，從形態(tài)學(xué)上觀察2ME2預(yù)處理后PCI2細(xì)胞內(nèi)HIF-1 核轉(zhuǎn)位的發(fā)生和對細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，給予HIF-1 抑制劑2ME2后，發(fā)現(xiàn)抑制H

48、IF-1 的激活和核轉(zhuǎn)移可以部分阻斷興奮性毒性所致的凋亡的發(fā)生。因此，我們認(rèn)為HIF-1 的激活促進了神經(jīng)元死亡進程的發(fā)生。大量研究顯示，缺氧以及非缺氧性刺激下，P13KAkt信號通路在HIF-1 表達(dá)和活性調(diào)控過程中可能起重要作用63】。p-Akt是P13K激活A(yù)kt發(fā)生磷酸化的活化產(chǎn)物，Akt只有磷酸化后被活化成為p-Akt時才具有生物學(xué)功能，直接或間接影響多種轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和促凋亡蛋白活性，從而實現(xiàn)整個信號通路的生物活性僻】。但Akt和HIF-1 之間是直接相互調(diào)控還是通過其它相關(guān)蛋白間接調(diào)控?目前鮮有報道。在大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型中，皮層損傷處p-Akt、GSK-3、p-Catenin蛋白

49、表達(dá)顯著增高，表明激活A(yù)ktGSK-3-Catenin信號通路可能是導(dǎo)致創(chuàng)傷性腦損傷的機制之-65。在急性腦缺血再灌注損傷模型中，導(dǎo)致大鼠海馬CAl區(qū)細(xì)胞凋亡的同時，伴有Wnt信號通路中關(guān)鍵因子p-Catenin、GSK-3p表達(dá)的增加和-Catenin、p-GSK3表達(dá)無明顯變化，說明Wnt信號通路可能參與缺血再灌注腦損傷的發(fā)生發(fā)展，對腦缺血細(xì)胞凋亡具有促進作用斷】。在姜黃素防治AD的體外研究中，給予姜黃素后，GSK-3mRNA和蛋白表達(dá)水平都顯著減弱；而GSK-3的磷酸化形式GSK-3-Ser9蛋白水平卻明顯增加；-catenin mRNA和蛋白水平也增加，表明GSK3-Catenin信號

50、通路激活可能是AD的發(fā)病機制之-67。上述研究表明，P13KAkt信號通路可以直接調(diào)控GSK-3，而-Catenin是GSK-3下游一個很重要的轉(zhuǎn)錄激活因子，那么HIF-1 是否是通過AktGSK-3-Catenin信號通路激活而發(fā)揮調(diào)控作用的呢?目前也不清楚。本章研究Western blot結(jié)果顯示，隨著QA損傷PCI2細(xì)胞的濃度增加，HIF-1 、GSK-3、p-Akt蛋白表達(dá)依次增加，-Catenin蛋白表達(dá)依次降低，Akt蛋白表達(dá)沒明顯變化趨勢；在給予HIF-1 抑制劑2ME2預(yù)處理后，抑制了HIF-1 、GSK-3、P-Akt蛋白表達(dá)的增加，-Catenin蛋白表達(dá)的降低，表明HIF

51、-1 、GSK-3及p-Akt參與QA誘導(dǎo)PCI2細(xì)胞的損傷，-Catenin參與細(xì)胞存活。在損傷過程中HIF-1 、GSK-3和p-Akt表達(dá)變化呈正相關(guān)，-Catenin表達(dá)變化呈負(fù)相關(guān)，給予2ME2后，驗證了上述的表達(dá)變化，表明QA損傷PCI2細(xì)胞的機制可能是HIF-1 通過競爭-Catenin激活GSK-3介導(dǎo)Akt的磷酸化產(chǎn)生的。在細(xì)胞損傷中都有凋亡的存在，細(xì)胞的凋亡與抗凋亡之間存在一種精細(xì)的平衡，當(dāng)細(xì)胞受到外來刺激時，這種平衡被打破，啟動細(xì)胞的凋亡程序68-691。Bax是一種凋亡前體蛋白，是p53的靶基因，Bax可刺激細(xì)胞色素C和其他凋亡誘導(dǎo)因子的外流，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；與此相反，B

52、cl-2抑制細(xì)胞色素C的釋放和Capase成員的激活，阻止細(xì)胞凋亡，而受到外來化學(xué)刺激時，BaxBcl-2值是細(xì)胞存活的指標(biāo)【70】。Bcl-2過表達(dá)可能削弱NMDA誘導(dǎo)凋亡和細(xì)胞毒性，從而延長細(xì)胞的生存時間和維持細(xì)胞的穩(wěn)定性。本研究Western blot結(jié)果顯示，2ME2抑制了QA所導(dǎo)致的BaxBcl-2值依次增加，表明2ME2可減輕細(xì)胞凋亡的程度。綜上所述，本章實驗結(jié)果表明，HIF-1 抑制劑2ME2能夠減輕喹啉酸致PCI2細(xì)胞的損傷程度，減少細(xì)胞凋亡；該過程的分子機制可能是通過抑制HIF-1 的激活從而阻斷AktGSK-3-Catenin信號通路進而調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白產(chǎn)生的。第四章2甲氧

53、基雌二醇在喹啉酸誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷中的作用第三章研究表明，喹啉酸誘導(dǎo)PCI2細(xì)胞損傷的機制之一可能是通過HIF-1 激活A(yù)ktGSK-3-Catenin信號通路進而調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白產(chǎn)生的。PCI2細(xì)胞是大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞，因其具有具有神經(jīng)元特質(zhì)，常被用于模擬神經(jīng)細(xì)胞進行體外實驗，但其屬于鼠源細(xì)胞株，因此，為了觀察和證明不同屬源的細(xì)胞是否具有特異性差異，本章選用與正常神經(jīng)細(xì)胞生理生化功能相似的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞進行驗證，該細(xì)胞株也常被用于體外模擬神經(jīng)元損傷的研究。41材料和方法41 1細(xì)胞株人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。421 細(xì)胞培

54、養(yǎng)及實驗分組將SH-SY5Y細(xì)胞用含10新生牛血清、1×105 UL青霉素、100 mgL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于含5C02和95空氣的37培養(yǎng)箱中，每2 d換液1次，4 d傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。 將SH-SY5Y細(xì)胞以5×104mL密度接種于96孔或24孔,板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的QA分別處理不同時間(篩選出QA低、中、高的濃度分別為225，45，9 mmolL；時間為24 h)。故將實驗分為對照組、QA低劑量組(225 mmolL)、中劑量組(45 mmolL)、高劑量組(9 mmolL)及HIF-1a抑制劑2ME2(20

55、 gtmolL)+QA高劑量組(9 mmolL)，其中2ME2預(yù)處理30 min。對照組細(xì)胞中加入相同體積PBS。422 QA高劑量組作用不同時間SH-SY5Y細(xì)胞HIF-la蛋白檢測采用免疫蛋白印跡法檢測檢測9 mmolL QA作用不同時間SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)HIF-1a蛋白的表達(dá)，按照2284的步驟進行。423 MTT法檢測細(xì)胞活力以MTT還原法檢測細(xì)胞存活率。五組藥物處理結(jié)束后，培養(yǎng)板每孔中加入MTT(終濃度為05 mgmL)，37反應(yīng)4 h，吸去上清后每孔加入100止二甲基亞砜，振蕩5 min，置酶標(biāo)儀上于490 nlTl處測定各孔吸光度值。具體方法參照222。423 LDH法檢測細(xì)胞

56、毒性424細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測425細(xì)胞內(nèi)HIF-1 的表達(dá)定位檢測426細(xì)胞凋亡檢測將SH-SY5Y細(xì)胞接種于玻璃片上，按照421中的分組經(jīng)藥物處理24 h后棄去培養(yǎng)液，經(jīng)PBS洗滌后，用冰甲醇固定細(xì)胞10 min。吸去固定液，用PBS洗滌后加入Hoechst 33342染色液(終濃度為1 0 BgmL)-T-室溫下反應(yīng)5 min，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。427細(xì)胞HIF-1 、pCatenin、GSK一3p、Akt、p-Akt、Bax、Bel-2蛋白的表達(dá)檢測44討論本章旨在第二和第三章的實驗基礎(chǔ)上，觀察和證明常被用于體外模擬神經(jīng)元損傷的不同屬源的PCI2細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞是否具有特異性

57、差異。本章實驗結(jié)果與第三章的結(jié)果基本相同，表明PCI2細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞在QA導(dǎo)致的興奮性毒性損傷中不存在明顯差異，但在比較第三章和第四章的結(jié)果時發(fā)現(xiàn)，PCI2細(xì)胞比SH-SY5Y細(xì)胞對QA誘導(dǎo)的損傷更為敏感。本章實驗結(jié)果41顯示，QA可呈時間和劑量依賴性的降低細(xì)胞存活率，增加細(xì)胞損傷：其中，225 mmolL QA對SH-SY5Y細(xì)胞損傷不明顯，45 mmolL QA才對SHSY5Y細(xì)胞造成明顯損傷，與文獻報道相一致73】，而25 mmolL QA即可導(dǎo)致PCI2細(xì)胞出現(xiàn)明顯損傷，說明PCI2細(xì)胞比SH-SY5Y細(xì)胞對QA誘導(dǎo)的損傷更為敏感。此外，因?qū)A誘導(dǎo)PCI2細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞損傷所篩選的濃度不一致，因此，HIF1a在QA誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷中的表達(dá)峰值時間也可能不同，故本章實驗選用9 m