ELISA實驗基礎(chǔ)知識培訓

1、1會計學ELISA實驗基礎(chǔ)知識培訓實驗基礎(chǔ)知識培訓1. 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）基本原理及概念2. 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）定量檢測應用3. ELISA實驗主要設(shè)備移液器基本使用主要內(nèi)容第一部分 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）基本原理及概念免疫技術(shù)酶促反應抗原抗體酶底物酶標抗原或酶標抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗5什么是抗原？ 能刺激機體免疫系統(tǒng)并啟動機體的免疫應答，且能與其免疫應答產(chǎn)物(抗體或免疫效應細胞)特異性結(jié)合，引起一系列生物學效應的物質(zhì)?？乖禺愋钥贵w6抗原的特點免疫原性和抗原性 免疫原性免疫原性 指抗原分子能夠刺激機體產(chǎn)生免疫應答指抗原分子能夠刺激機體產(chǎn)生免疫應答( (產(chǎn)生特異性

2、產(chǎn)生特異性抗體及免疫效應細胞抗體及免疫效應細胞) )的性質(zhì)。的性質(zhì)。 抗原抗原入侵入侵記憶細胞（對抗原有記憶功能）漿細胞特異性抗體效應B細胞7 抗原性抗原性 指抗原分子與免疫應答產(chǎn)物指抗原分子與免疫應答產(chǎn)物( (抗體或免疫效應細胞抗體或免疫效應細胞) )發(fā)生發(fā)生特異性結(jié)合的性質(zhì)。特異性結(jié)合的性質(zhì)?？乖ブ虏∧芰? 抗原決定簇大多存在于抗原物質(zhì)的表面，有些存在于抗原物質(zhì)的內(nèi)部，須經(jīng)酶或其他方式處理后才暴露出來。一個天然抗原物質(zhì)可有多種和多個決定簇?？乖肿釉酱?，決定簇的數(shù)目越多?？乖瓫Q定簇：抗體識別相應抗原并與之結(jié)合的位點抗原決定簇抗原決定簇具有兩個以及兩個以上抗原決定簇的抗原叫多價抗原9哪些

3、物質(zhì)可以稱之為抗原呢？大多數(shù)蛋白質(zhì)、細菌、病毒、細菌外毒素等都是抗原。 可以引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染金黃色葡萄球菌常引起嚴重腹瀉和敗血癥10 病毒呈球形，衣殼由60個殼微粒組成，呈20面體立 體對稱，有HAV的特異性抗原(HAVAg)，每一殼微粒由4種不同的多肽（蛋白質(zhì)）即VP1、VP2、VP3和VP4所組成 甲肝病毒1973年Feinslone 首先用免疫電鏡技術(shù)在急性期患者的糞便中拍攝的甲型肝炎病毒 (Hapatitis A virus,HAV ) 11甲肝病毒表面的VP蛋白是具有免疫原性的蛋白，能刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性的抗體甲肝病毒12什么是抗體？ 抗

4、體是在機體對抗原刺激的免疫應答中，效應B細胞產(chǎn)生的一類糖蛋白，能夠與相應抗原特異結(jié)合、產(chǎn)生各種具有免疫效應的球蛋白。免疫球蛋白 在甲型肝炎的感染過程中，機體都可產(chǎn)生抗HAV的lgM 和lgG抗體。前者在急性期和恢復期出現(xiàn)，后者在恢復后期出現(xiàn)，并可維持多年，IgG 抗體使得機體對同型病毒的再感染有免疫力。13什么是抗原抗體反應 抗原抗體反應是指抗原與相應抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應抗原抗體反應的特點1. 特異性抗原與抗體結(jié)合反應的專一性，是指抗原分子表面的抗原決定簇與抗體的分子結(jié)合的特異性，這兩個分子的空間結(jié)構(gòu)是完全互補的。142.可逆性抗原與相應抗體結(jié)合成復合物后，在一定條件下又可解離為游離

5、抗原與抗體3. 階段性第一階段第一階段特異性結(jié)合階段：反應快，不可見第二階段第二階段反應可見階段：反應慢，但會出現(xiàn)凝集、沉淀和細胞溶解等現(xiàn)象我可找到你了15抗原抗體反應的特點4.比例性抗原與抗體發(fā)生可見反應需遵循一定的量比例關(guān)系 只有當二者濃度比例適當時才出現(xiàn)可見反應，形成的免疫復合物沉淀最多、最大。而當抗原抗體比例超過此范圍時，反應速度和沉淀物量都會迅速降低甚至不出現(xiàn)抗原抗體可見沉淀反應。沉淀物形成量沉淀反應中沉淀量與抗原抗體的比例關(guān)系沉淀反應中沉淀量與抗原抗體的比例關(guān)系16你們都看不見我17放射性免疫標記技術(shù)18放射性免疫標記技術(shù) 用放射性核素等標記物，標記抗體或抗原，進行的抗原抗體檢測技

6、術(shù)，既有抗原抗體反應的特異性，又有標記物的靈敏度。通過放射強度的改變，測定未標記抗原或抗體的含量。（放射性標記物對抗原抗體反應起到了放大的作用）缺點：放射性物質(zhì)對人體會產(chǎn)生危害 1959年由Yalow和Berson開創(chuàng)了放射免疫技術(shù)(radioimmunoassay，RIA）。這項技術(shù)開辟了醫(yī)學檢驗史上的一個新紀元。它使得那些原先認為是無法測定的極微量而又具有重要生物學意義的物質(zhì)得以精確定量。酶具有可與抗原、抗體共價結(jié)合的基團高活性一個酶蛋白分子每分鐘可以催化103-104個底物分子轉(zhuǎn)化為有色產(chǎn)物 用酶標記抗體（或抗原）建立免疫測定法，可以使免疫結(jié)果得以放大，保證了測定方法的靈敏度。20Nak

7、ene和Pierce共同研究發(fā)現(xiàn)的酶標抗原或抗體的方法，他們共同發(fā)表了酶標抗體：制備和抗原定位中的應用，首先提出了免疫酶技術(shù)的基本原理酶標記抗原或抗體酶標抗原或抗體的原理及方法戊二醛交聯(lián)法 過碘酸鈉法 目前在免疫酶技術(shù)中常用的酶為辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP)，其次還有葡萄糖氧化酶，-半乳糖苷酶、溶菌酶和蘋果酸脫氫酶等。采用辣根過氧化物酶的原因分子量小：這使得它很容易結(jié)合到抗體分子上，且結(jié)合量大大增加，有助于信號的產(chǎn)生。辣根過氧化物酶的底物比較寬泛，且比堿性磷酸酶敏感。酶標抗體或抗原的原理 辣根過氧化物酶中與酶活性無關(guān)的糖蛋白組分，在過碘酸鈉作用下，其中的多糖羥基被氧化成活潑的醛

8、基，后者即可與抗體蛋白中的氨基形成的Schiffs堿而交聯(lián)，再經(jīng)硼氫化鈉還原終止反應，即得到穩(wěn)定的酶標結(jié)合物辣根過氧化物酶糖蛋白過碘酸鈉抗體蛋白氨基氨基羥基醛基Schiffs堿 酶標抗體或抗原技術(shù)基本要求是將酶分子與抗體或抗原分子共價結(jié)合 此種結(jié)合既不改變抗體的免疫反應活性，也不影響酶的生物化學活性22在實驗中，為了分離游離和結(jié)合的酶標記物，洗板的過程是必不可少的，所以，將抗原（抗體）固定在固相載體上就是必須的了將抗原（抗體）固定在什么固相載體上？呀！我沒結(jié)合上固相載體23塑料制品 抗體或蛋白質(zhì)抗原可以通過非共價鍵或物理吸附機制結(jié)合到固相載體表面。迄今用的聚苯乙烯制成的小試管、小珠和微量反應板

9、仍是最常用的固相載體Wide 和Jerker Porath研究并公開發(fā)表了抗原或抗體和固相載體結(jié)合的技術(shù)不足測定過程中固相抗體（抗原）脫吸附率較高且不均一，從而影響測定的靈敏度和精確性由于制作時配料及生產(chǎn)工藝的差別，各種聚苯乙烯ELISA板的質(zhì)量差異大，會影響檢測結(jié)果優(yōu)點材料經(jīng)濟方法簡便操作及測定易于自動化24Rosalyn Sussman Yalow 和Solomon Berson建立了放射性免疫技術(shù)，可以定量檢測體液中的生物活性物質(zhì)1960年Stratis Avrameas 和G. B. Pierce發(fā)現(xiàn)了酶和抗體結(jié)合技術(shù)Wide 和Jerker Porath研究并公開發(fā)表了抗原或抗體和固

10、相載體結(jié)合的技術(shù)1961-1965年1971年Engral和Perlmann綜合了前人技術(shù)，第一次提出酶聯(lián)免疫吸附試驗，并發(fā)表酶聯(lián)免疫吸附試驗測定IgG含量一文，使免疫酶技術(shù)成為一種實用的檢測液體標本中微量物質(zhì)的方法 捕獲法捕獲法01 間接法間接法02 競爭法競爭法03雙抗體夾心法雙抗體夾心法04ELISA的分類ELISA方法的適用范圍間接法捕獲法主要用于血清中某種抗體亞型成分，如：IgM的測定。當抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。競爭法可用于小分子的抗原和半抗原的定量測定，以及抗體測定。小分子激素、藥物等的測定多用此法雙抗體夾心法最常用于抗原檢

11、測，且為多價抗原檢測。但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心此法是檢測抗體最常用的方法用途廣泛1敏感度高2特異性強3可定性和定量4ELISA方法的特點28雙抗體夾心法原理：利用連接于固相載體上的 和 可分別于樣品中被檢測抗原分子上兩個不同抗原決定簇結(jié)合，形成 免疫復合物。 由于反應系統(tǒng) 和 相對于待檢測抗原是過量的，因此復合物形成的量和待檢抗原的含量成正比。測定復合物酶中加入的底物后生成的有色物質(zhì)（OD值），即可確定待測抗原的含量。（成正比）抗體 酶標抗體過量過量固相抗體-抗原-酶標抗體固相抗體-抗原-酶標抗體固相抗體酶標抗體的量29將抗體包被在固相載體上將抗體固定在固相

12、載體上 抗體作為一種蛋白質(zhì)可以與聚苯乙烯制成的固相載體以非共價鍵和物理吸附的機制相結(jié)合洗去未結(jié)合的抗原洗去未與抗原結(jié)合的酶標抗體TMB底物終止液終止液2mol/LH2SO4酶和底物作用后生成的物質(zhì)在終止劑作用下呈現(xiàn)黃色，黃色的深淺和抗原含量成正比雙抗體夾心法操作甲肝疫苗抗原檢測的方法雙抗體夾心法 采用ELISA雙抗體夾心法定量/定性檢驗甲肝抗原。 將特異性甲肝抗體（包被物）包被到酶標板上形成固相抗體； 加入?yún)⒈绕泛凸┰嚻?，與固相抗體形成抗原抗體復合物 隨后加入酶標抗體，參比品和供試品中的甲肝抗原與酶標抗體發(fā)生特異性結(jié)合 當加入酶底物時，出現(xiàn)呈色反應，酶標儀在適當波長測定參比品以及供試品的OD值

13、 應用量反應平行線法計算抗原含量。甲肝疫苗抗原檢測方法原理第二部分 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）定量檢測應用Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration (FDA) Center for Drug Evaluation and Research (CDER) Center for Veterinary Medicine (CVM) May 2001FDA對生物分析方法驗證的要求Typi

14、cal method development and establishment for a bioanalytical method include determination of (1)selectivity, (2) accuracy, precision, recovery, (3) calibration curve, and (4) stability of analyte in spiked samples生物學分析方法的驗證項目包括：（1）專屬性；（2）準確度、精密度、回收率；（3）標準曲線；（4）穩(wěn)定性34精密度的概念The precision of an analytic

15、al method describes the closeness of individual measures of an analyte when the procedure is applied repeatedly to multiple aliquots of a single homogeneous volume of biological matrix.精密度是指在規(guī)定的測試條件下，同一個均勻樣品，經(jīng)多次取樣測定所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標準偏差（SD）或變異系數(shù)（或稱相對標準偏差）來表示。 偏差、標準偏差（SD）或變異系數(shù)越小，說明測定結(jié)果越集中，精密度越好。精

16、密度的驗證結(jié)果表明了這個檢驗系統(tǒng)檢驗供試品結(jié)果的波動幅度。Precision should be measured using a minimum of five determinations per concentration. A minimum of three concentrations in the range of expected concentrations is recommended. The precision determined at each concentration level should not exceed 15% of the coefficient

17、of variation (CV) except for the LLOQ, where it should not exceed 20% of the CV which measures precision with time, and may involve different analysts, equipment, reagents, and laboratories.生物分析方法精密度評價的規(guī)定：對生物分析方法進行精密度檢測實驗時，檢測范圍內(nèi)最少設(shè)置3個不同濃度，每個濃度最少進行5次重復試驗?？疾煲蛩兀簳r間、人員、設(shè)備、試劑和實驗室導致結(jié)果的因素驗證結(jié)果：在相同濃度下，試驗結(jié)果變異系

18、數(shù)CV應小于15%（最低檢出限的要求是CV小于20%）。FDA對生物分析方法驗證的要求 Once the analytical method has been validated for routine use, its accuracy and precision should be monitored regularly to ensure that the method continues to perform satisfactorily. To achieve this objective, a number of QC samples prepared separately sho

19、uld be analyzed with processed test samples at interval based on the total number of samples. The results of the QC samples provide the basis of accepting or rejecting the run. At least four of every six QC samples should be within 15% of their respective nominal value. Two of the six QC samples may

20、 be outside the 15% of their respective nominal value, but not both at the same concentration.Application of validated method to routine drug analysis已驗證方法在常規(guī)檢驗中的應用-FDA當生物分析方法建立并開始用于常規(guī)檢定后，需要定期監(jiān)控該生物分析方法的精密度和準確性，以確保分析方法的運行是可靠的。采取的方法是，在檢驗過程中，定期設(shè)置質(zhì)控品；根據(jù)質(zhì)控品的結(jié)果來判定實驗是否成立。要求：要求：至少4/6的質(zhì)控品的測定結(jié)果在真實結(jié)果的15%范圍內(nèi)；2/

21、6的質(zhì)控品測定結(jié)果超出真實結(jié)果真實結(jié)果的15%間接證明：生物分析方法的波動還是很大的質(zhì)控品甲型肝炎滅活疫苗內(nèi)控參比品（內(nèi)參）內(nèi)參設(shè)置頻次每塊酶標板設(shè)置1個內(nèi)參內(nèi)參成立要求體外效力檢驗值在1.04-1.28之間，試驗成立內(nèi)參均值1.16，其 15%范圍 為0.99-1.33內(nèi)參實際應用情況2013年6-7月間，內(nèi)參共檢驗124次，其中10次不符合要求，合格率92%（4/6）北京科興甲肝體外相對效力檢驗FDA所列的生物分析方法之一舉例說明表明：表明：甲肝體外內(nèi)參設(shè)立標準嚴格于FDA法規(guī)要求目前的甲肝體外效力檢驗系統(tǒng)是穩(wěn)定、可靠雙抗夾心ELISA抗原定量檢測應用舉例廠家檢驗項目最低檢出限北京科興質(zhì)控

22、部目前使用HBV核心抗原1ng/mlHCV核心抗原1ng/mlHIV p241ng/ml前列腺特異性抗原肺結(jié)核抗原幽門螺旋桿菌抗原卵清蛋白0.312ng/mlVero宿主細胞蛋白2ng/ml非限制性核酸內(nèi)切酶0.2ng/ml不同ELISA試劑盒驗證的變異系數(shù)SampleMean concentrationng/mLS t a n d a r d deviationCV(%)15.070.234.6024.090.317.5533.280.267.8942.180.062.8351.590.0684.5960.780.0283.54 Intra-assay板內(nèi)SampleMean concent

23、rationng/mLS t a n d a r d deviationCV(%)18.830.738.2324.550.296.3533.040.217.0240.820.056.57 Inter-assay板間卵清蛋白的ELISA定量試劑盒幽門螺旋桿菌抗原不同ELISA試劑盒驗證的變異系數(shù)POOlIntra assay CVInter assay CVLow6.9%4.4%Medium5.5%3.7%High3.5%3.6%Vero 宿主細胞蛋白不同的定量檢測試劑盒的變異系數(shù)可接受范圍有所不同前列腺特異性抗原分析模型的選擇根據(jù)不同ELISA檢驗方法的屬性與要求，適用模型不同線性回歸模型OV

24、A, BSA線性四參數(shù)模型Benzonase, vero cell protein 非線性量反應平行線模型EV71, HAV, HBs antigen線性供試品與標準品平行單點代入法多點比較法單點帶入法的風險單點帶入法的風險供試品不同稀釋度得到不同結(jié)果供試品不同稀釋度得到不同結(jié)果待檢樣品中組分干擾檢測結(jié)果，例如糖、鹽離子、雜蛋白等供試品劑量反應的線性無法考察待檢樣品中的有效組分與標準品中的有效組分與抗體的結(jié)合能力不同，劑量反應曲線斜率不同不具有同質(zhì)性量反應平行線法檢驗量反應平行線法檢驗待檢樣品和標準品多稀釋待檢樣品和標準品多稀釋度度考察標準品和供試品劑量反應是否呈線性供試品和標準品劑量反應曲線

25、相平行（斜率相同），表明兩者具有同質(zhì)性02468101214161802468標準品供試品02468101214161820051015標準品供試品有效抗原含量決定疫苗對人體的保護效果，是疫苗最重要的產(chǎn)品質(zhì)量評價標準甲肝抗原、EV71抗原、乙肝表面抗原定量采用量反應平行線法檢驗46 抗原性抗原性 指抗原分子與免疫應答產(chǎn)物指抗原分子與免疫應答產(chǎn)物( (抗體或免疫效應細胞抗體或免疫效應細胞) )發(fā)生發(fā)生特異性結(jié)合的性質(zhì)。特異性結(jié)合的性質(zhì)?？乖ブ虏∧芰?7 抗原決定簇大多存在于抗原物質(zhì)的表面，有些存在于抗原物質(zhì)的內(nèi)部，須經(jīng)酶或其他方式處理后才暴露出來。一個天然抗原物質(zhì)可有多種和多個決定簇?？乖肿釉酱?，決定簇的數(shù)目越多。抗原決定簇：抗體識別相應抗原并與之結(jié)合的位點抗原決定簇抗原決定簇具有兩個以及兩個以上抗原決定簇的抗原叫多價抗原48 病毒呈球形，衣殼由60個殼微粒組成，呈20面體立 體對稱，有HAV的特異性抗原(HAVAg)，每一殼微粒