(完整版)酵母質(zhì)粒提取

1、 酵母質(zhì)粒抽提方法 點(diǎn)擊次數(shù)： 247 作者：ydniu 發(fā)表于：2008-06-18 11:44 轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明來(lái)自丁香園 來(lái)源：丁香園 問(wèn)：想從酵母提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，按分子克隆的方法，可能都線性化了，轉(zhuǎn)化率為 0,請(qǐng)問(wèn)有 什么好的辦法？ 答：以下是我的方法，曾提過(guò)數(shù)百個(gè)，好像轉(zhuǎn)化效率還可以 ，基本上都提岀來(lái)了。 個(gè)人體會(huì)是 Lyticase的活性要好，而且渦流混勻這一步好像要盡量充分吧， u see，酵母質(zhì)粒所以不 好提，就是因?yàn)榻湍讣?xì)胞有很厚的細(xì)胞壁，再加上酵母質(zhì)?？截悢?shù)目多少的問(wèn)題，所以破壁一定要充分。 其次嗎？感受態(tài)細(xì)胞的狀態(tài)也會(huì)有很大的影響 再有，如果擔(dān)心酵母細(xì)胞的活性問(wèn)題，也可

2、以活化一下 再提，不過(guò)好象我的實(shí)驗(yàn)中這項(xiàng)不是問(wèn)題 .哈哈. 詳細(xì)步驟： 1、挑 10mm2的酵母溶于含 50 gl的 TE ( pH7.0)的 1.5ml離心管中 2、每管加 10 g 1的裂解液(Lyticase 5 unit/ gSjgma避光保存)，渦流混勻 3、37 C，200-250r/m，30-60min 4、每管加 10 g l 20 % SDS，渦流 1min 5、E0C凍存過(guò)夜 6、室溫下融解后，渦流混勻 質(zhì)粒提取。 1.5ml 離心管加 TE Buf 至 200 gl 的（pH7.0 ） 200gl酚，渦流 5min 后，4C, 14000r/m 離心 10min。 取上清

3、至干凈的 1.5ml Eppendorf 管中。 等體積酚氯仿，渦流 5min 。 4C， 14000r/m 離心 10min 。 取上清至一干凈的 1.5ml Eppendorf 管后加等體積氯仿，渦流混勻 4C， 14000r/m 離心 10min 。 取上清至一干凈的 1.5ml Eppendorf 管中。 8gl 10M NH4Ac 和 500gl 95%100 %的乙醇。 -70 C, 1h。 4C， 14000r/m 離心 10min 。 棄上清，空氣中干燥。 10g l H2O 懸浮細(xì)胞。 轉(zhuǎn)化（要求：4 C預(yù)冷） 冰上融化感受態(tài)細(xì)胞（感受態(tài)細(xì)胞的制備見(jiàn)分子克隆啦） Top10f 加 100gl轉(zhuǎn)化細(xì)胞到預(yù)冷的 1.5ml離心管中，槍頭輕輕吹打混勻。 冰上孵育 30min 。 42 C, 45S 50S。 冰上孵育 2min 后，加 1ml LB 。 37C， 1h， 250r/m. 2500r/m ， 5min ， RT。 棄上清，在剩余的溶液中懸細(xì)胞。 接種 LB/Amp 板， 37 C ，倒置培養(yǎng) 24h。7、 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 7.10 7.11 7.12 7.13 8、